流式细胞术：样本处理与存储-李奈林
流式细胞术课件
Flow cytometry of apoptotic cell death
Phospholipid redistribution
第七节 细胞周期的检测
Flow cytometry of cell cycle
原理：细胞在有丝分裂的过程中 DNA 会加倍。 （n----2n）
以二倍体细胞为例，流式检测细胞周期的过程。 首先，我们知道细胞分为处于静止期的细胞 （G0）和处于分裂状态的细胞，分裂期状态的 细胞又有 G1 期，S 期,G2 期和 M 期。
Flow cytometry of cell cycle
基本工作原理
已标记的单细 硅化管 胞悬液和鞘液
基本过程
流动室 形成稳态 喷嘴 水平激光与之 荧光染料被
单细胞液柱
垂直相交 激发发光
荧光检测系统和
收集光信号 光电倍增管
放大 脉冲信号
散射光感受系统
计算机系统 分析结果
现代流式细胞仪包括
液流系统 聚焦细胞以供检测
光学系统 激发和收集光信号
电子系统 将光信号转化为电信号，并使其数字化以供计算机分 析
液流系统示意图
鞘液
Fluorescence signals
Focused laser beam
喷嘴
FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
2. 光学系统
激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 透镜组：形成平行光，除去室内光 滤片：长通、短通、带通 光电倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）
流式细胞术的组织样本，你会处理吗？
流式细胞术的组织样本，你会处理吗？前⾔常常听到流式操作的⽼师说，你细胞数量太少⽆法获取有效数据，或者细胞聚团导致管路堵塞等问题。
本来就好不容易排到队去分析样本，还会被后⾯同学各种嫌弃，1min实验有时候10min都没做出来！细胞数⽬的掌握很难，过于稀释浓度不够，过于稠⼜会在通过细胞仪时影响分析，做不出结果，常常是我们做流式的⼀⼤通病。
特别是从组织中分离样本时，这样的问题常常遇到。
本期就看看如何从不同组织中分离出优质样本。
组织样本的单细胞制备与贴壁或者悬浮细胞相⽐，组织样本的单细胞制备相对有⼀定的难度和复杂性，也是同学们最容易出现问题的地⽅，如细胞数量太少，细胞活性不好，细胞碎⽚太多等。
下⾯就具体看看组织中的细胞如何制备。
⽬前，最常⽤两种⽅法是物理法和酶解消化法。
组织样本的处理⽅法⼀、物理⽅法：原理：是指利⽤物理⽅法（机械法）分散组织，经过滤⽹过滤获得单细胞悬液。
应⽤：常⽤于处理部分软组织例如⾻髓、胸腺、脾脏、淋巴结等，或富含细胞的肿瘤组织----淋巴⾁瘤、视神经母细胞瘤、脑瘤、未分化瘤、髓样瘤以及⼀些软组织⾁瘤等，⽤单纯的机械法就可以获得⼤量⾼质量的单分散细胞。
优势：操作⽅便，耗时短，且能获得⼤量的细胞。
缺点：易造成组织细胞机械损伤，如细胞碎⽚和细胞团块，所以常与其他⽅法配合使⽤；对硬组织或纤维组织效果不好。
⼆、酶解消化法：原理：利⽤酶（主要是胶原酶和蛋⽩酶）破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等、⽔解组织细胞的紧密连接结构的蛋⽩质和粘多糖物质以将实体组织分散为单个细胞的⽅法。
应⽤：既可⽤于普通单层的传代细胞也适合致密的组织样本，如上⽪、肝、肾等或含有⼤量结缔组织的肿瘤----⾷管癌、乳腺癌、⽪肤癌等。
优势：适⽤于⼤部分组织样本获取单细胞，酶的种类多选择空间⼤。
缺点：操作步骤⽐较繁琐，消化时间⽐较长且难控制。
不同的组织样本酶种类、浓度、消化时间的选择需要不断摸索优化。
下⾯具体介绍这2种⽅式的操作步骤：⼀物理⽅法1. 吹打：⽤移液枪或注射器反复吹打组织以获得单个细胞的⽅法。
流式细胞术的操作、原理与应用
流式细胞术的特点
检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； 检测参数：多参数； 检测特点：单细胞水平分析； 检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒； 检测结果：精度高、准确性好； 可对目标细胞进行分选；
1
5
50
104
1.7 min
20 s
2s
105
16.8 min 3.4 min
20 s
106
2.8 h
3.4 min
3.4 min
107
1.2 天
5.6 h
34 min
分选时间表(机器流速10000个/s时)
分选速度、分选纯度和分选收获率，相互影响。
分选纯度指被分选出来的细胞所占的百分比，一般能达 99%以上。
光电倍增管(photomultiplier, PMT) 光灵敏度高，测定弱信号（SSC, FL1, FL2, FL3,
FL4)。
PMT
前向散射光 光电二极管
（二）电信号两种放大方式
由于光信号比较弱，需将其等比例放大，方便计算机分 析处理，一般信号的放大可以使用线性或对数两种方式。
线性(linear; lin) log)
电子系统
光电转换器 数据处理系统
细胞分选系统
喷嘴 电偏转板 样本收集器
1.3.1 液流系统
鞘流技术：根据层流原理 发展起来的技术，可以实 现两种液体的同轴流动， 样本细胞流位于轴心稳定 流动，外面包裹有鞘液 (sheath)。
流体动力学聚焦：稳定的 液流从截面积较大的部分 流入截面积较小的部分后， 有一个聚焦收缩作用，细 胞流直径被约束在1020um，避免了多个细胞重 叠进入检测区。
流式细胞术操作规程
流式细胞术操作规程
《流式细胞术操作规程》
流式细胞术是一种用于研究细胞表型和功能的重要技术。
在进行流式细胞术时，操作规程的严谨性和标准化是非常重要的。
以下是流式细胞术操作规程的一般步骤：
1. 样品准备：首先，需要准备好待测的细胞样品。
这包括细胞的培养和收集，以及必要的处理和染色。
2. 仪器准备：在进行流式细胞术之前，需要确保流式细胞术仪器的正常运行。
这包括检查流式细胞仪和细胞分选仪的通电和冷却系统，以及其它相关设备的准备。
3. 校准仪器：在进行流式细胞术之前，需要对流式细胞仪进行校准，以确保其准确测量样品中细胞的特定参数。
4. 样品测量：将准备好的细胞样品加入流式细胞仪，并进行测量。
测量完毕后，需要对数据进行分析和记录。
5. 数据分析：对测量得到的数据进行分析，包括确定细胞的表型和功能，以及对其它相关参数进行分析和比较。
6. 结果解释：根据数据分析的结果，进行结果的解释和报道，并对相关实验现象进行讨论和总结。
在进行流式细胞术时，需要严格遵守操作规程，以确保实验结果的准确性和可靠性。
此外，对于一些特殊的实验操作，可能
还需要根据具体情况进行相应的调整和改进。
流式细胞术的操作规程是一个很重要的研究工具，它可以帮助研究人员进行高效、准确的实验，从而为科学研究和医学诊断提供更为可靠的数据和方法。
流式细胞术基本原理与实用技术
流式细胞术基本原理与实用技术流式细胞术（Flow Cytometry）是一种常用的细胞分析技术，它基于光学、电子和计算机技术，能够对单个细胞进行快速、准确的多参数分析。
本文将介绍流式细胞术的基本原理和实用技术。
一、基本原理流式细胞术的基本原理是利用细胞在液体中悬浮的特性，在流动状态下通过一个细胞计数器，同时对细胞进行多参数的检测和分析。
其主要包括以下几个步骤：1. 细胞样品的制备：将待检测的细胞样品进行预处理，如离心、洗涤等，以获得单细胞悬浮液。
2. 细胞的进样：将细胞悬浮液通过微细管道进入流式细胞仪的流动系统中，形成单细胞的液体流。
3. 细胞的定位和聚焦：利用激光束对细胞进行定位和聚焦，使其逐个通过探测区域。
4. 细胞的激发和发射：通过激光束的照射，激发细胞中的荧光染料或标记物，使其发射特定波长的荧光信号。
5. 光信号的收集和处理：收集细胞发射的荧光信号，并经过光学系统进行分光、分束、分光和聚焦，最后通过光电倍增管或光电二极管转换为电信号。
6. 数据的获取和分析：将电信号转化为数字信号，并通过计算机系统进行数据采集、存储和分析，得到细胞的各项参数及相关统计学分析。
二、实用技术1. 细胞标记技术：为了能够准确地检测和分析细胞的特定性质，常常需要对细胞进行特异性的染色或标记。
常用的标记方法包括荧光染料、抗体标记和基因表达标记等。
2. 多参数分析技术：流式细胞术可以同时检测多个参数，如细胞大小、形态、表面标记物的表达、细胞周期等。
通过合理选择和配置荧光染料和滤光片组合，可以实现多重标记和多参数分析。
3. 数据分析软件：流式细胞术产生的数据量庞大，需要借助计算机软件进行数据的分析和解读。
常用的数据分析软件有FlowJo、CellQuest、ModFit等，它们可以对细胞的分布、比例、相关性等进行统计学分析和图形展示。
4. 高通量流式技术：随着科学研究的深入和技术的发展，高通量流式技术逐渐兴起。
它通过提高仪器的样品处理速度和自动化程度，实现对大量样品的快速检测和分析，广泛应用于生物医学研究和临床诊断。
流式细胞术详解
流式细胞术详解一. 流式细胞术概述流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,•它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。
它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA 含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。
在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。
国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D 公司)。
流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。
BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B-D•公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。
EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能,•多用于科学研究。
二.流式细胞仪主要技术指标1．流式细胞仪的分析速度：一般流式细胞仪每秒检测1000～ 5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。
2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。
3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～０.5μm。
4．流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，,一般流式细胞仪能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。
实用流式细胞技术及其样品处理
FACSAria (FACSDiva)
流式细胞术基本原理 在不同领域的应用 样品及其前处理
一、 流式细胞术基本原理
Orange
Time
SSC
Green
Time
FSC Data Processor
FSC SSC
Time Green
Time
Orange Time Red
5、CTL功能分析
评价细胞杀伤过程的生物学变化：如效应细胞的凋亡， CTL介导的裂解功能的抑制。
proteolytic cleavage sites for individual caspases fluorophore 18-amino-acid peptides
细胞分选
分选纯度
分选产率
厂家、型号、激光器、滤光片、软件
Becton Dickinson (Maxwell W. Becton and Fairleigh S. Dickinson BD)： FACS
“Fluorescence Activated Cell Sorter”
FACS I,II,III,IV,400,420,440,FACStar,Vantage, DiVa, Aria : Sorters. FACS Analyser, can, Calibur* , LSR, Canto: ‘Benchtop’.
（二）细胞功能分析
细胞活性分析
细胞膜电位
线粒体膜电位、膜蛋白抗原7A6
细胞内Ca2+
胞浆内pH
活性氧（ROS）
1、细胞活性分析
根据对细胞膜的渗透性不 同来区分活/死/凋亡细胞： PI，EB，7-AAD and Hoechst 33342
流式细胞术的原理和应用
流式细胞术的原理和应用流式细胞术是一种广泛应用于生物医学领域的先进技术，它通过对细胞的特定特征进行高效、快速的检测和分析，为科学研究和临床诊断提供了强大的工具。
流式细胞术的原理和应用涉及到许多方面，包括仪器原理、标记技术、数据分析等，下面将对这些内容进行详细阐述。
一、流式细胞术的原理流式细胞术的原理基于细胞在流动液体中依次通过激光束后的单个检测区域，通过检测细胞在不同参数下的散射或荧光信号来获取关于细胞数量、大小、形态、表面标记物等信息。
流式细胞术通常包括以下步骤：1. 样本制备：将样本中的细胞进行适当的处理，如酶消化、离心、过滤等，以获得单细胞悬浮液。
2. 细胞标记：利用标记物（如荧光染料、抗体等）对待测细胞进行特异性标记，以便在流式细胞仪中对其进行检测和分析。
3. 流式细胞仪检测：将标记后的细胞悬浮液通过流式细胞仪，激光束依次照射每个细胞，并通过检测散射光和荧光信号来获得相关信息。
4. 数据分析：通过专门的流式细胞数据分析软件对获得的数据进行处理和分析，获取细胞的数量、特征等信息。
二、流式细胞术的应用1. 免疫学研究：在免疫学领域，流式细胞术可用于分析免疫细胞的类型、数量和功能，如淋巴细胞亚群的鉴定、T细胞的活化状态等，为免疫学研究提供了重要的数据支持。
2. 癌症诊断和治疗：流式细胞术可用于检测肿瘤细胞的类型和数量，分析肿瘤细胞的表面标记物，评估肿瘤的侵袭性和预后，指导临床治疗方案的选择和疗效监测。
3. 干细胞研究：流式细胞术可用于干细胞的鉴定和分离，分析干细胞的表面标记物和多能性，为干细胞研究和应用提供重要的技术支持。
4. 病原微生物检测：流式细胞术可用于检测微生物感染，分析微生物的数量、类型和毒力，评估感染的严重程度和治疗效果。
5. 血液分析：流式细胞术可用于分析血液中各类细胞的数量和功能，如白细胞亚群的鉴定、血小板的活化状态等，为临床诊断和治疗提供重要信息。
流式细胞术作为一种高效、敏感的细胞分析技术，在生物医学领域有着广泛的应用前景。
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固体组织的酶消化性解聚
• 基本程序:
新鮮组织 → 酶 切 组织消化 → 原始悬液 → 过滤 → 离心 → 洗涤 → 细胞悬液 细胞悬液 → 细胞计数和活性检测 → 细胞固定
培养细胞的细胞悬液制备 (I)
• 钙螯合法
• 过程: 5 mM EDTA, > 30 min • 优点: 细胞表面抗原保存好 • 缺点: 耗时, 低细胞回收率 低细胞回收率 , 减低存活率 减低存活率
27
28
样本染色 (VII) –– 孵育温度
• 低温孵育引起体外假象的可能性较小
样本孵育温度对白细胞CD11b测定的影响
10.0 4°C 15°C *
Leukocyte CD11b MFI
7.5
22°C 37°C ++
• 体温 (37°C) 孵育适于观察细胞体外反应性
5.0
2.5
++
• 最适孵育温度需根据具体检测项目而定
5
• 酶切消化法
• 过程: trypsin/EDTA (0.02-0.1%/5 mM), 1– 1–10 min • 优点: 快速, 高细胞回收率 高细胞回收率 , 高存活率 高存活率 • 缺点: 可能显著改变 细胞表面抗原表达 可能显著改变细胞表面抗原表达
6
1
胰蛋白酶消化可能显著改变培养细胞的 表面抗原表达
流式细胞术样本处理的主要任务与目标
流式细胞术: 样本处理与存储
Flow Cytometry: Sample Preparation and Storage
• 样本对流式细胞仪的可视化
Visualize the sample to cytometer • 单细胞悬液 Single cell suspension
1.0 0.5 0.0 2.0
Unstimulated
0.5 0.0 2.0
Monocytes
1.5 1.0 0.5 0.0
Lymphocytes
1.5 1.0 0.5 0.0
0
1
3
6 12 24
0
1
3
6 12 24
Halldén G, et al. Ann Allerg Asthma Immunol 1999; 83: 413-421. 14
20
免疫萤光标记先于胰蛋白酶消化可能 改善细胞表面抗原保存
800
EC VCAM-1 Expression (arbitrary unit)
600
15
ICAM-1 Expression (arbitrary unit)
400
10
200
5
0 0
EDTA
Trypsin/EDTA
Corver WE, et al. Cytometry 1995; 19: 267-272.
2.5
染色前的样本储存 Pre-sample handling storage
原则: 原则:
越短越好 保存温度: 4°C或室温 合适的保存方式取决于细胞种类, 合适的保存方式取决于细胞种类, 分析类型和样 本处理方法 粒细胞功能, 血小板功能, 髓系细胞的免疫表型, 细胞周期分析
Leukocyte CD11b MFI
17 18
• 溶血分离法
• 最常用, 染后溶血 >> 溶血后染色 • 优点: 经济; 高细胞回收率 高细胞回收率 • 缺点: 亦 易导致制样假象
3
细胞分离过程对单核细胞CD11b测定的影响
样本制备过程应避免温度的反复升降
Lundahl J, et al. J Immunol Methods 1995; 180: 1993-100.
白细胞的分离 (I)
• 密度梯度分离法
• 较少用 • 优点: 细胞亚群纯化; 去除死细胞 • 缺点: 耗时; 低细胞回收率 低细胞回收率 , 易导致制样假象
白细胞的分离 (II)
• 荧光抗体或DNA染料的识别染色法 • 应用不断增多 • 优点: 样本处理简单, 样本处理简单, 制样假象少, 制样假象少, 选择性强而灵活 • 缺点: 相对贵一些 • 抗体包被的磁珠分选法 • 应用不断增多 • 优点: 快捷, 快捷, 选择性强 • 缺点: 昂 贵
• 优化和标准化样本制备程序
Optimize and standize sample handling precedures
2
固体组织的机械解聚 固体组织和培养细胞的细胞悬液制备
Cell suspension preparation from solid tissues and cultured cells
7
染色 ↓ 解脫
解脫 ↓ 染色
8
Gräbner R, et al. Cytometry 2000; 40: 238-244.
培养细胞的细胞悬液制备 (II)
• 机械刮脫
• 过程: 机械推刮 • 优点: 简单快速 简单快速, 细胞表面抗原表达保存好 • 缺点: 可能导至细胞机械损伤 可能导至细胞机械损伤
• ≤ 72 h:
淋巴细胞免疫表型与DNA倍数分析
12
2
白细胞CD11b表达和反应性在24小时 存储(4°C)中的动态变化
2.0 2.0
嗜酸性粒细胞CD69表达在24小时 存储(4°C)中的动态变化
Leukocytes
1.5
Neutrophils
1.5 1.0
fMLP 0.1 µM
Leukocyte CD11b MFI
样本染色 (V) –– 萤光素的选择
• 荧光素的明亮度
• phycoerytherin (PE) > PE-Cy5 > PE-Texas Red (E (ECD ) > allophycocyanin (APC) > fluorescein isothiocyanate (FITC)
样本染色 (VI) –– 洗涤还是不洗涤
• 细胞膜通透化的方法需逐个评估
22
白细胞胞膜通透化对光散射特性的影响
Control 0.1% Triton 0.8% OG
样本染色 (III) –– 抗体选择 1
• 抗体特异性 • IgG 作为首选 • 选择明亮萤光素标记的抗体检测密度低的抗原 • 细胞内染色IgG较好, 尤其是细胞核内抗原 • 同型阴性对照抗体的萤光素/蛋白质比例 (F/P ratio) 应与阳性染色抗体的相近
血液抗凝剂:
• 枸橼酸钠: 细胞分型, 粒细胞和血小板功能测试,
DNA分析
• 肝素: • EDTA: • 水蛭素:
细胞分型, 粒细胞功能测试, DNA分析 细胞分型, 粒细胞功能测试, DNA分析 细胞分型, 粒细胞和血小板功能测试, DNA分析
10
9
血液抗凝剂对白细胞 CD11b 流式细胞术检测的影响
Fc受体阻断对目标抗原染色的作用
FITC-CD3染色15 min
鼠IgG孵育10 min + FITC-CD3染色15 min
• 次级抗体需采用F(ab) 或F(ab’)2片段
25 26 Stewart CC & Stewart SJ. Methods Cell Biol 2001; 63: 217-251.
CD11b Expression MFI
1.5
• 应用: 应用: 细胞分型, DNA分析
1.0
Unfixed
0.5
• 冰冻保存
• 应用: DNA分析, 细胞分型
15
0.5% formaldehyde fixed
0.0
0
1
3
6
12
24
48
16
Time (hour)
Li N, et al. Eur J Haematol 2000; 65: 57-65.
李奈林
瑞典 斯德哥尔摩 卡罗林斯卡医学院/大学医院 内科系 临床药理科 杭州 浙江大学医学院 病理学与病理生理学教研室
1
• 荧光标记 Fluorescent labelling
• 防止或减低样本制备引起的假象
Prevent or minimize artefacts during sample handling
8
Unfixed
Unstimulated
6
0.2% F 0.5% F 1.0% F
Leukocyte CD11b MFI
• 固定剂的类别
• 非凝固性固定剂 非凝固性固定剂 • 多聚甲醛 Paraformaldehyde: 0.5-4% in PBS • 甲醛 Formaldehyde: 0.2-1% in saline or PBS • 戊二醛 Glutaraldehyde: 少用 • 凝固性固定剂 凝固性固定剂 • 乙 醇 Ethanol: 少用 • 甲醇 Methanol: 少用 • 丙酮 Acetone: 少用
4
1.0% PF 2.0% PF
2
0 8
0.1 µM fMLP
6
4
2
• 样本固定方法需具体评估
0
31
0
1
3(log hour) 6 12 Time
24
48
32
Li N, et al. Eur J Haematol 2000; 65: 57-65.
结语
• 流式细胞术的样本制备没有一个黄金标准。 There is NOT a golden protocol for flow cytometric sample preparation that suits every application.
0.0
* * ++ ++
Unstimulated
29
0.1 µM fMLP