流式细胞术样本制备.
流式细胞术的质量控制
流式细胞术的质量控制流式细胞术是一种在液流中快速检测和分析细胞特性的技术，广泛应用于医学、生物技术、免疫学等领域。
然而，要确保实验结果的准确性和可靠性，必须实施严格的质量控制措施。
本文将探讨流式细胞术的质量控制。
1、样本制备的质量控制样本制备是流式细胞术的关键步骤之一，包括细胞样本的收集、处理和标记。
在此过程中，应遵循标准化操作流程，并注意以下几点：（1）样本的收集和保存：应尽可能缩短样本采集到分析的时间，避免细胞状态的改变。
对于血液样本，应使用肝素抗凝，避免细胞聚集。
（2）细胞的分离和洗涤：应根据实验需求，采用合适的分离方法（如密度梯度离心法、贴壁培养法等）对细胞进行分离。
在洗涤过程中，应使用无菌、无内毒素的缓冲液洗涤细胞，去除杂质和死细胞。
（3）抗体标记：选择高质量的抗体，并遵循制造商的建议进行标记。
应避免抗体非特异性结合，确保标记的特异性和敏感性。
2、仪器设备的质量控制流式细胞仪是流式细胞术的核心设备。
为确保实验结果的准确性，应对仪器进行定期校准和维护。
具体措施包括：（1）校准激光功率：定期使用标准样本对激光功率进行校准，确保光路准直，提高光散射数据的准确性。
（2）清洗流动室：定期清洗流动室，防止样品残留物堵塞喷嘴，影响流速稳定性。
（3）校准光电倍增管：使用标准样本校准光电倍增管，确保光电倍增管输出的线性范围。
3、数据分析的质量控制数据分析是流式细胞术的关键步骤之一，包括数据的获取、处理和解析。
在此过程中，应遵循标准化操作流程，并注意以下几点：（1）数据获取：设置合适的参数和门控，确保获取最佳的数据。
（2）数据预处理：去除噪声和无效数据，进行数据归一化处理，提高数据质量。
（3）数据分析：选择合适的数据分析方法（如聚类分析、主成分分析等），对数据进行深入挖掘。
同时，应使用多个对照样本，评估实验结果的可靠性和稳定性。
4、实验室环境的质量控制实验室环境对流式细胞术的结果也有重要影响。
为确保实验结果的准确性，应采取以下措施：（1）温度控制：保持实验室温度稳定，避免温度波动对细胞状态的影响。
流式细胞术样品制备技术(完整)
流式细胞术样品制备技术流式细胞术对细胞的分析检测必须基于单细胞的基础上，这是流式细胞术的基本要求。
因此就必须把实体组织制备成单细胞悬液。
在应用FCM技术中，制备出合格的单分散细胞是流式细胞术样本制备技术中重要的一环。
它要求这种分散细胞方法既要使细胞成为单个细胞，又能保持细胞的固有生物化学成分及生物学特性。
流式细胞术样品制备大致可分为下面五个步骤：①取材：取手术或活检组织必须具有代表性，如取手术肿瘤组织，必须取瘤细胞生长旺盛部位；组织等标本必须在取材后保持样本的新鲜；一般在室温1个小时之内处理好样本或及时用固定剂或低温对组织进行保存；②对细胞的待测生物化学成分进行荧光染色；③按照厂家提供的软件程序对样本进行获取、检测和存储；④再依照软件提供的程序对检测结果进行定量分析；⑤检测分析结果在生物、医学上的意义进行分析和评价。
第1节样本单细胞悬液的制备方法一新鲜实体组织样本的制备FCM对单细胞快速进行各种参数分析必须基于单细胞基础上，根据各种组织成分的特点，可选择不同的分散细胞方法，以期达到单细胞产额高、损伤少的目的。
尽管标本制备已形成了标准化的程序，但实际操作中总会出现这样或那样的问题。
在实体组织分散为单个细胞过程中，解离的方法可能瞬间地或持久地影响细胞的性质、形态、结构、功能等。
所以，在对各种不同组织进行分散选择方法时，应尽量减少对细胞的这种影响。
目前常用的分散组织细胞的方法有如下3种。
（一）酶消化法1 作用原理：对实体组织分散的作用原理主要有3方面：①可以破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等；②可以水解组织间的粘多糖等物质；③可以水解组织细胞间的紧密联结装置的蛋白质物质。
酶消化法是实体瘤、培养细胞分散为单细胞的主要方法之一。
常用的酶类试剂有：蛋白酶类——胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链酶蛋白酶和中性蛋白酶等，都能解离组织中的细胞。
胰蛋白酶能水解脂键和肽键；胶原酶能降解几种分子类型的胶原；溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷键；弹性蛋白酶能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维。
流式细胞术待测样品制备方法建议2016
流式细胞术待测样品制备方法建议：
1）收集2×10^6个细胞，用1ml冷的PBS重悬，1500rpm离心5min，弃上清。
2）拍打混匀细胞团块，随后加入1ul 荧光直标的CD45抗体，混匀，冰上避光孵育15min；3）加入1ml PBS重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清；
4）加入1ml 1%中性多聚甲醛（注：用PBS将4%的多聚甲醛稀释为1%浓度使用即可）重悬细胞，避光固定15min，随后1500rpm离心5min，弃上清；
5）加入1ml PBS重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清；
6）用1ml含0.09%皂素的PBS重悬细胞，冰上避光放置10min，1500rpm离心5min，弃上清。
7）加入1ml PBS重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清；
8）以200ul PBS重悬细胞，加入Hsp70抗体，冰上避光放置30min，再用1ml冷的PBS 重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清，洗去未结合的一抗；
9）加入1ml PBS重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清；
10）以200ul PBS重悬细胞，加入FITC标记的二抗，冰上避光放置40min后，再用1ml冷的PBS 重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清，洗去未结合的二抗；
11）加入1ml PBS重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清；
12）以200ul PBS重悬细胞，避光备用；上机检测，每样品计数5000-50000个细胞。
备注：抗体的使用量请参照说明书。
流式细胞术的质量控制
流式细胞术的质量控制流式细胞术（Flow cytometry）是一种广泛应用于生物学和医学研究中的细胞分析技术。
它通过利用光传感器和激光来检测细胞悬浮液中的细胞数量、大小、形态和表面标记物等信息，从而实现对细胞的分析和分类。
为了保障流式细胞术的准确性和可重复性，质量控制是非常重要的。
样本制备的质量控制在进行流式细胞术之前，样本制备是流式细胞术质量控制的第一步。
样本质量对于结果的准确性和可重复性至关重要。
以下是一些常见的样本制备质量控制步骤：细胞样品准备细胞浓度的准确计数：使用细胞计数仪准确计数细胞数目，以确保每个样本含有足够数量的细胞进行分析。
细胞的适当处理：根据不同实验要求，对细胞进行适当的处理，如洗涤、培养基的选择等，以确保细胞状态的一致性。
样品标记物的质量控制标记物的选择：根据实验需要，选择合适的标记物，并确保其特异性、亲和力和荧光强度等符合要求。
样品标记物的浓度和时间：对于标记物的浓度和反应时间进行优化，避免过高或过低的浓度导致信号失真或信号强度不足。
流式细胞仪的质量控制流式细胞仪作为流式细胞术的核心仪器，其性能的稳定和准确也是流式细胞术质量控制的关键。
以下是常见的流式细胞仪质量控制步骤：光谱校正与补偿荧光信号校正：使用校正颗粒进行荧光信号校正，校正光谱重叠和荧光强度的变化，以提高结果的准确性。
荧光信号补偿：通过对不同通道之间的荧光信号进行补偿，避免荧光信号之间的交叉干扰，确保结果的准确性。
流速标定流速标定：使用标定颗粒进行流速标定，保证流速的准确性，以便对细胞进行准确的定位和计数。
指标质量控制正质量控制：使用已知正样本进行实验，确保仪器的稳定性和结果的准确性。
负质量控制：使用未标记的负样本进行实验，排除背景信号和非特异性结合，保证结果的准确性。
识别和排除异物：通过故障检查和核查流式细胞术结果，识别和排除可能存在的污染源和异常情况。
数据分析的质量控制流式细胞术之后，对数据的准确分析和解读也是质量控制的重要环节。
流式细胞术样品制备技术(完整)
流式细胞术样品制备技术流式细胞术对细胞的分析检测必须基于单细胞的基础上，这是流式细胞术的基本要求。
因此就必须把实体组织制备成单细胞悬液。
在应用FCM技术中，制备出合格的单分散细胞是流式细胞术样本制备技术中重要的一环。
它要求这种分散细胞方法既要使细胞成为单个细胞，又能保持细胞的固有生物化学成分及生物学特性。
流式细胞术样品制备大致可分为下面五个步骤：①取材：取手术或活检组织必须具有代表性，如取手术肿瘤组织，必须取瘤细胞生长旺盛部位；组织等标本必须在取材后保持样本的新鲜；一般在室温1个小时之内处理好样本或及时用固定剂或低温对组织进行保存；②对细胞的待测生物化学成分进行荧光染色；③按照厂家提供的软件程序对样本进行获取、检测和存储；④再依照软件提供的程序对检测结果进行定量分析；⑤检测分析结果在生物、医学上的意义进行分析和评价。
第1节样本单细胞悬液的制备方法一新鲜实体组织样本的制备FCM对单细胞快速进行各种参数分析必须基于单细胞基础上，根据各种组织成分的特点，可选择不同的分散细胞方法，以期达到单细胞产额高、损伤少的目的。
尽管标本制备已形成了标准化的程序，但实际操作中总会出现这样或那样的问题。
在实体组织分散为单个细胞过程中，解离的方法可能瞬间地或持久地影响细胞的性质、形态、结构、功能等。
所以，在对各种不同组织进行分散选择方法时，应尽量减少对细胞的这种影响。
目前常用的分散组织细胞的方法有如下3种。
（一）酶消化法1 作用原理：对实体组织分散的作用原理主要有3方面：①可以破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等；②可以水解组织间的粘多糖等物质；③可以水解组织细胞间的紧密联结装置的蛋白质物质。
酶消化法是实体瘤、培养细胞分散为单细胞的主要方法之一。
常用的酶类试剂有：蛋白酶类——胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链酶蛋白酶和中性蛋白酶等，都能解离组织中的细胞。
胰蛋白酶能水解脂键和肽键；胶原酶能降解几种分子类型的胶原；溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷键；弹性蛋白酶能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维。
流式细胞术样品制备(完整)
一、单层培养细胞分散为单个细胞
㈠贴壁的单层培养细胞单细胞悬液的制备
操作步骤： 1、将单层培养细胞(对数生长期)中的旧培养液倒掉。
2、加入少量0.25%胰酶，消化细胞，在倒置显微镜下观
察，见细胞稍变圆时，立即终止消化（假如含有10%胎 牛血清的培养基），收集细胞，离心后去上清，PBS液
洗涤细胞一次，离心去掉上清液，约留0.5ml细胞悬液， 用振荡器使细胞分散。
实验证实，用化学试剂处理组织导致细胞 成活率降低，细胞产额较低，细胞碎片和细胞 丛结的量不稳定，因此，化学试剂处理方法不 单独使用，可与其他方法联合使用。 机械法常常造成严重的细胞损伤，较低的 细胞产量，为使细胞碎片不影响FCM检测结果， 需采用适当的方法除去碎片或尽量减少碎片。 酶学法对实体肿瘤的分散解聚是较理想的， 但是会对所测化学成分造成不良影响，所以根 据使用目的去选择合适的单细胞悬液制备方法， 才能获得理想的样品和更好的FCM结果。
3、如果不是及时上机检测，则需要对细胞进行固定，常 规固定液为70%乙醇，然后保存于4℃冰箱中。
（二）悬浮培养细胞单细胞悬液的制备
操作步骤：
1、离心去除旧培养液，PBS液洗涤细胞一次，离心去掉 上清液，约留0.5ml细胞悬液，用振荡器使细胞分散。
2、如果不是及时上机检测，则需要对细胞进行固定，常 规固定液为70%乙醇，然后保存于4℃冰箱中。
注意事项： 一定将石蜡从组织中脱干净，检验是否将石蜡 脱净的方法是，弃去二甲苯，加入100%乙醇， 如无絮状物浮起，即视为石蜡已脱净，反之则 没有脱净。 消化时间不可过长，以免造成已释放出的细胞 核被消化掉。 切片不可过薄或过厚，过薄则碎片增多，影响 流式分析结果，过厚造成脱蜡不净或脱蜡时间 过长，一般以40-50μm为宜。
免疫缺陷性疾病的流式细胞术(FACS)检测技术综述
免疫缺陷性疾病的流式细胞术（FACS）检测技术综述流式细胞术（FACS）是一种广泛应用于免疫学、细胞生物学和医学研究领域的高级技术。
它基于细胞表面标记物的特异性染色和流式细胞仪的高速多参数分析能力，能够对细胞的多个特征进行准确快速地评估。
在免疫缺陷性疾病的诊断、治疗和研究中，FACS检测技术发挥了重要作用。
一、FACS技术原理及基本流程FACS技术利用单克隆抗体或荧光染料标记的抗体与细胞表面的抗原结合，将细胞分为不同的亚群，并通过流式细胞仪进行高速分析和计数。
1. 样本制备：样本制备是FACS分析的重要步骤，它要求样本细胞的高质量提取和制备。
血液和组织样本通常经过红细胞溶解、细胞过滤和标记前的预处理。
2. 孵育抗体：单克隆抗体或荧光染料标记的抗体与样本中的特定细胞表面抗原结合，形成荧光标记的细胞。
3. 过滤和洗涤：样本离心去除未结合的抗体并进行洗涤，以去除杂质和多余的荧光染料。
4. 流式细胞术仪器：使用流式细胞仪进行细胞的高速分析。
该仪器利用激光器照射细胞，测量细胞释放的荧光和散射光的特性，从而对细胞进行鉴定和分类。
5. 数据分析：通过流式细胞仪获得的数据经过专业的软件进行分析和解读，得出相应的结果和图表。
二、FACS在免疫缺陷性疾病中的应用1. 免疫缺陷性疾病的诊断：FACS技术可以通过检测细胞表面抗原与参考范围进行比较，确定患者是否存在免疫缺陷。
例如，在先天性免疫缺陷疾病中，可以检测T细胞、B细胞和NK细胞等免疫细胞的数量和功能。
2. 免疫细胞亚群的鉴定：FACS技术可以通过检测不同免疫细胞表面标记物，准确鉴定不同免疫细胞亚群的比例和数量。
对于免疫缺陷性疾病研究来说，这对于确定异常细胞亚群以及监测治疗效果具有重要意义。
3. 细胞活力和细胞周期分析：FACS技术还可以通过检测细胞的活力标记物和细胞周期相关标记物，评估细胞的生存能力和增殖情况。
这对于免疫功能评估和治疗效果的监测具有重要意义。
4. 免疫治疗效果的评估：FACS技术可用于监测免疫治疗的效果，包括免疫细胞的增加、功能的改善以及异常细胞的清除。
流式细胞术样品制备(完整)
注意事项：
Ⅰ新鲜组织标本应及时进行保存，以免组织在室温下放 置时间过长，造成细胞自溶导致DNA降解，影响FCM 测定结果。
Ⅱ根据实验目的选用最佳的细胞固定方法，以免由于固 定剂的原因，造成FCM检测结果的不稳定。
Ⅲ酶学法要注意条件的选择和影响因素，要注意酶的溶 剂，消化时间、pH值、浓度等方面对酶消化法的影响。
消化时间不可过长，以免造成已释放出的细胞 核被消化掉。
切片不可过薄或过厚，过薄则碎片增多，影响 流式分析结果，过厚造成脱蜡不净或脱蜡时间 过长，一般以40-50μm为宜。
二、血液单细胞样品的制备
血液是天然的单细胞分散细胞悬液，血中 的细胞成分在生理状态下呈分散的游离状态， 它是流式细胞分析的最合适的样品，全血中含 有红细胞，白细胞和血小板三种有形成分，但 流式细胞的检测是以某一群细胞为测定对象， 因此在检测前须将所测的某群细胞分离出来， 下面分别介绍几种血细胞的分离制备方法。
新鲜实体组织单细胞悬液制备方法如下：
⒈酶消化法 ⒉机械法
剪碎法 网搓法 研磨法
⒊化学试剂处理法
⒈酶消化法
酶对实体组织分散作用原理主要有三方面：
﹡一是可以破坏组织间的胶原。
﹡二是可以水解组织细胞的紧密连结装置的蛋白性物质。
﹡三是可以水解组织间的粘多糖物质。
酶消化法是实体组织分散为单细胞的主要方法，常用 的酶类试剂有：
1. 取肝素1000u/ml抗凝全血3.0m1,加入3.0ml生理
盐水将血稀释,均在无菌条件下操作。
2.1640培养液10.0ml,放入培养瓶内,将稀释血加入
培养液中,混匀,与培养瓶接触面要大。
3.放入37℃恒温箱内孵育30-40分钟,取出培养瓶 , 将血倾倒掉,用生理盐水将培养瓶轻轻冲洗一次, 以去掉残留的血液,这时培养瓶壁上贴附了大量 的单核细胞,因为单核细胞具有短时培养期内贴 附快的特点 ,而其他细胞没有这个特性,所以利 用这一特性进行短时培养可获得较纯的单核细 胞。
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样本制备实例:细胞表面蛋白荧光染色 (Immunofluorescence Staining原理:对细胞表面蛋白质的染色可以分为直接染色(DIF 和间接染色(IIF 两种。
直接染色是指用直接联有荧光的抗体染色;而间接染色则是采用一级抗体和蛋白先结合,然后再用带有荧光的与一级抗体有亲和力的二级抗体进行染色。
荧光染色的方法在蛋白质检测中使用非常普遍,因为只要采用合适的抗体,几乎任意的蛋白都可以用指定的荧光标记。
但是由于各种蛋白表达的强度和荧光染料自身荧光强度不同,以及临近通道串色的问题, 多色实验的基本原则是:最强的染料配表达最弱的蛋白,最弱的染料配表达最强的蛋白; 如果使用染料的数量不大则应尽量避免使用临近通道。
还需要考虑染料之间的溢漏、以及偶联染料已降解的问题。
现出现了 405nm 的激光激发的新型染料如 BV421、 BV605等为多色实验提供了更多的选择空间。
材料:∙被检测细胞∙FACS Lysing Solution (细胞裂解液, 1倍或 10倍, 10倍的要先稀释到 1倍后使用∙相应的蛋白荧光染色抗体 (e.g. CD4 FITC, CD8 PE, CD3 APC步骤:1. 在 100 µL外周血加入抗体:a. 同型对照:PB 100µL +Isotope FITC 20 µL+Isotope PE 20 µL+Isotope APC 5 µLb. 单阳管:PB 100µL +CD4 FITC 20 µL+Isotope PE 20 µL+Isotope APC 5 µLc. 单阳管:PB 100µL +Isotope FITC 20 µL+CD8 PE 20 µL+ Isotope APC 5 µLd. 单阳管:PB 100µL +Isotope FITC 20 µL+ Isotope PE 20 µL+CD3 APC 5 µLe. 样品管:PB 100µL +CD4 FITC 20 µL+CD8 PE 20 µL+CD3 APC 5 µL2. 避光 15min3. 在每管中加入 2mL 裂解液,室温下避光孵育 10min4. 将裂解好的外周血离心 1200rpm , 5min ,去上清液5. 加入 2mL 鞘液,混匀6. 离心 1200rpm , 5min ,去上清液7. 加入 500 µL鞘液,混匀8. 3小时内上机(如果不能立刻上机, 2⁰ C -8⁰ C 避光保存样本对照:a. 同型对照(和使用的抗体同源、同亚型、同荧光标记:Isotope*3b. 单阳 CD4 加 Isotope PE & APCc. 单阳 CD8加 Isotope FITC & APCd. 单阳 CD3 加 Isotope FITC & PE细胞周期 (Cell Cycle原理:细胞在有丝分裂的过程中,核内的 DNA 会进行复制,造成 DNA 含量的波动。
如果把处于 G0/1期的细胞的 DNA 含量看做 1倍的话,处于 G2/M期的细胞的 DNA 含量则为 2倍。
荧光染料 propidium iodide (PI 是一种核染料。
因为每一个 PI 分子只能插在两组相邻的碱基对中,所以 PI 染料的荧光强度与被染的 DNA 的数量成正比。
根据 PI 的这种特性,我们常常用它来揭示细胞内 DNA 倍性的关系,从而推导出细胞所处的周期。
然而,流式细胞术只能检测在某一时刻穿过激光的细胞的荧光强度,但无法直接判断在这一时刻到底穿过了几个细胞。
如果有细胞粘在一起或是正巧同时穿过激光,流式细胞仪则会读取其整个荧光强度,从而导致对单个细胞 DNA 含量测定上的误差。
为了解决这个问题,我们常常做一张以 FL2-W 和 FL2-A 分别为横纵坐标的散点图。
FL2-W 指的是第二通道(PI 里该细胞通过时的时间,而 FL2-A 指的是第二通道里该细胞的总荧光强度。
当细胞粘联时,期总体积与质量变大,导致通过激光时间变长,所以 FL2-W 的值会比单个细胞大出很多。
通过这种方式,我们可以将 FL2-W 比较统一(小的细胞用门圈出,以排除粘联体,从而确保周期分析的准确性(如下图所示。
然后我们就可以在 FL2-A 的直方图上直观地对细胞倍性进行分析了。
材料:∙被检测细胞∙ FACS Lysing Solution (细胞裂解液, 1倍或 10倍, 10倍的要先稀释到 1倍后使用∙BD CycletestTM Plus DNA Reagent Kit (340242∙Solution A (10mL×1 (Trypsin in Spermine Tetrahydrochloride Detergent Buffer ∙Solution B (8mL×1 (RNase A and trypsin Inhibitor in Spermine Buffer∙Solution C (8mL ×1 (Propidium Iodide (PI in Spermine Buffer ∙Buffer Solution (50mL ×3 (DMSO in Sucrose-Sodium Citrate注意:Solution A, B, C 中含有 spermine tetrahydrochloride,对皮肤和粘膜有刺激性;Solution C中 PI 有毒,并具有潜在的致癌性;Buffer Solution 中含有 DMSO ,具有潜在的致畸性。
操作时戴手套,注意避免眼睛,皮肤和衣服与以上试剂的接触。
Solution A 和 B 在室温下使用(20⁰ C-25⁰ C , Solution C 要在 2⁰ C -8⁰ C 下避光保存。
步骤:1. 在 200 µL外周血加入 2mL 裂解液,室温下孵育 10min2. 将裂解好的外周血离心 1200rpm , 5min ,去上清液3. 加入 2mL 鞘液,混匀(如不含红细胞样本无需裂红,从此步骤开始,取 106细胞4. 离心 1200rpm , 5min ,去上清液5. 加入 250µL Solution A, 轻轻混匀(不要涡旋 ,室温下孵育 10min6. 加入 200µL Solution B, 轻轻混匀(不要涡旋 ,室温下孵育 10min7. 加入 200µL Solution C,混匀,在冰上或者冰箱里避光孵育 10min8. 将样本用 35-50µm的滤网(300目过滤9. 3小时内上机(如果不能立刻上机, 2⁰ C -8⁰ C 避光保存样本对照:1内参:样本内含有已知倍性的细胞亚群2外参(optional :同类已知倍性的细胞。
细胞凋亡 (Apoptosis原理:细胞程序性死亡 /凋亡(apoptosis 是机体移除不需要的细胞的一种常见的机制。
细胞凋亡早期的标记之一是 PS (phosphatidylserine 自胞膜内表面到外表面的转移。
Annexin V (AV 和 PS 有很强的亲和力,所以被荧光标记后常常在流式中被用来检测外翻的 PS 。
在细胞凋亡后期,细胞膜常常会破裂。
这种现象在流式中可以用propidium iodide (PI 检测。
PI 是一种核染料。
当细胞膜完整时, PI 无法穿透胞膜,故无法对细胞核进行染色。
AV 与 PI 共同使用时,可以对细胞凋亡的各个时期进行检测:正常活细胞显示 AV 和 PI 的共阴性;早凋细胞显示 AV 阳性和 PI 阴性;晚凋细胞则显示 AV 和 PI 的双阳性。
然而,可以被 AV 和 PI 共同染色的细胞并不一定处于凋亡晚期。
坏死的细胞在晚期也会被 AV 和 PI 共同染色。
所以要想做到对细胞凋亡精确的检测则需要对整个凋亡过程进行监测, 即 AV 阴性 & PI阴性→ AV阳性 & PI阴性→ AV 阳性 & PI 阳性。
材料:∙被检测细胞∙BD PharmingenTM FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I (556547∙10X Annexin V Binding Buffer (50mL×1 51-66121E ∙FITC Annexin V (AV (0.5mL×1 51-65874X ∙Propidium Iodide (PI Staining Solution (2.0mL ×1 51-66211E注意: PI 有毒,并具有潜在的致癌性。
操作时注意安全,要戴手套。
步骤:1. 将 10倍的 Annexin V Binding Buffer 稀释为 1倍 (将 1容积的 Buffer 加到 9容积的蒸馏水中2. 用冷 PBS 把细胞溶液清洗 2次(离心1200rpm/5min → 去上清液→ +2mL PBS → 混匀→ 离心1200rpm/5min → 去上清液→ +2mL PBS→ 混匀离心→1200rpm/5min → 去上清液3. 将清洗好的细胞加入 1倍 Annexin V Binding Buffer中(终浓度 106细胞 /mL4. 在 5mL 的流式管中加入 100 µL步骤 3的细胞溶液(应含 105细胞5. 在每一管样本溶液中加入 5µL的 FITC Annexin V 和 5µL的 PI6. 将溶液轻轻地震荡后,避光在室温下(25⁰ C 孵育 15min7. 加入 400 µL 1倍 Annexin V Binding Buffer8. 在 1小时内上机对照:1. 未染色细胞(全阴2. 单染 FITC Annexin V3. 单染 PI4. 正常细胞(未经凋亡药物处理加 AV 和 PI6-C TBNK检测原理:人类的淋巴细胞按照表面抗原的表达可以被分成三大类:T 细胞(CD3+, B 细胞(CD19+和 NK 细胞(Natural Killer自然杀手(CD16+CD56+。
这些淋巴细胞表面还会表达一些其他的抗原。
根据这些抗原的表达,我们可以做出对某些疾病的检测和诊断。
例如:CD3+CD4+淋巴细胞的比例和绝对数量是检测 HIV 阶段的重要指标(随着 HIV 的加重, 患者血液中 CD3+CD4+淋巴细胞的数量会逐渐减少; CD3+CD4+淋巴细胞的比例和绝对数量以及 T 细胞和 B 细胞的总量也常常是诊断其他免疫缺失疾病和自免疫疾病的依据;表达 CD3-CD16+/CD56+的 NK 细胞往往对某些肿瘤细胞和被病毒感染的细胞有杀伤力,所以其数量是个体对该症状抵抗力的量化表达。