流式细胞术实验方法及应用
流式细胞术原理及应用
流式细胞术原理及应用
流式细胞术是通过一种名为流式细胞仪的仪器完成的，它能够以非常
高的精确度进行分析和检测。
流式细胞仪通过一根轴，从这个轴上有三根
弹性管，细胞进行注射，从而使细胞在管中行进，细胞同时也受到外界信
号的影响，这种信号可以来自磁场、电场或光场。
当细胞运行到仪器的另
一端时，它们会被照亮，通过一台摄像机可以拍摄到高清晰度的照片，然
后在计算机上进行分析处理。
流式细胞术广泛应用于早筛检、医学诊断、药物发现、药理学实验和
抗生素耐药性研究等方面，它能够更加精确、快速地进行细胞分析。
此外，流式细胞术也可以用于分析抗原抗体，免疫细胞介导的反应，以及细胞因
子如细胞因子和表面受体等的表达情况。
这种技术还可以用来监测血液中细胞水平的变化，如血小板、红细胞、白细胞等。
FCM(流式细胞术检测)原理及临床应用
流式细胞术(flow cytometry FCM)是利用流式细 胞仪对单个生物颗粒(红细胞、白细胞、各类组织细 胞、血小板、微生物等)以及人工合成微球的物理和 生物学特性进行多参数定量分析，并能对特定细胞 群体加以分选的分析技术。
FCM的工作原理
流式细胞仪组成：
1.液流系统 2.光学系统 3.数据处理系统
双标记或多标记分析：目前使用的流式细胞仪 能用一个激光束激发检测三色甚至四色荧光信 号。检测时需注意荧光补偿。
常用免疫荧光染料组合
荧光染料 FITC+PE
激发波长 （nm）
488
发射波长（nm） 525、575
颜色 绿色、橙色
FITC+PeCy5
488
525、675
绿色、红色
FITC+ECD
488
实体瘤以多倍体居多；
G0 期：DNA 合成静止期 G1 期：DNA 合成前期 S 期： DNA 合成期 G2 期：DNA 合成后期 M 期： 细胞分裂期
DNA 倍体 2N 2N
2N-4N 4N 4N
DNA非2倍体出现是鉴别良性与恶性肿瘤的特异性指 标:
良性肿瘤和正常组织良性增生不出现DNA非2倍体细 胞而恶性肿瘤常可出现异倍体细胞；
过去认为 FCM测定残存白血病细胞不可靠， 因为现用的 McAb不能鉴别正常血细胞与白血 病细胞。虽然至今尚未发现白血病细胞特异抗 原，但近来有人提出根据白血病细胞的以下特 征， FCM检测的敏感度可明显提高
白血病细胞的某些抗原表达量明显高于相应 的正常血细胞
如小儿ALL，其CDl0+细胞的荧光强度可 高达3-4个对数值，而其 CD45则为弱阳性或 阴性。
525、625
流式细胞术
流式细胞术检测淋巴细胞表面标记一、实验目的1.了解流式细胞仪的组成、原理及应用：初步了解流式细胞仪的工作元件及基本应用原理；能够认识流式细胞术的应用，特别是常用的一些功能。
2. 熟悉用流式细胞术检测小鼠脾脏T细胞表面标志的基本流程3. 学习并掌握流式细胞术结果的分析：能够基本看懂结果图，重点掌握“门”和“补偿”两个概念。
二、实验原理1.流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性（多参数）的技术，同时可以对特定群体加以分选。
特点：可检测的样本种类多样，大小范围较广（0.2~50µm）；检测速度快，分析样本量大（快速、大量）；细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏；采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度10000个细胞(微粒)/秒与统计分析精确性。
2. 流式细胞仪组成及原理Fluidics (液流系统)——流体动力学聚焦样本形成单细胞流。
鞘液是辅助样本流被正常检测的基质液。
主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。
匀速流动，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。
Optics (光学系统)——激发和收集光信号。
激发系统包括：激光器、透镜和反射镜，将激光聚焦到检测区收集系统包括：光学镜片和滤光片、光信号检测器流式细胞仪收集的信号：（1）散射光信号：细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为前向散射光(信号强弱与细胞体积大小成正比)和侧向散射光(检测细胞粒度和细胞内相对复杂性)。
流式细胞术实验方法
流式细胞术实验方法PI 染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。
2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。
3、加入2ml预冷的70%酒精，4℃固定30min，或是-20℃固定过夜。
4、离心，弃上清液。
5、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。
6、加入RNase A (工作浓度20ug/ml)于500ul 1×PBS中，37℃孵育30min，离心。
7、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。
8、加入PI(工作浓度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中，室温避光孵育30min。
9、混匀，过300目筛网，置流式管中， 4℃冰箱保存，待测。
GFP PI染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。
2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。
3、加入2ml预冷PFA，PFA的浓度根据细胞的特点进行调节，4℃固定30min。
以下步骤同PI 染色操作步骤的（4-9）细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。
2、以冷PBA 1ml，离心洗涤，弃上清液。
3、加入用PBA稀释的荧光素标记的抗体200ul。
用微量移液器轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min-1h。
4、离心弃上清液。
5、加入冷PBS1ml,离心洗涤2次，以除去未结合的多余抗体成分。
6、向细胞中加入冷PBS 500ul,吹打混匀，置流式管中，4℃避光保存，待测。
细胞表面间接免疫荧光染色操作步骤1-2、同细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤3、用PBA稀释的第一抗体200ul，对照管加入对应于一抗的正常实验动物IgG，轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育1、5-2h。
离心，弃上清。
4、 BS1ml离心洗涤1次，以去除多余的未结合的特异性抗体。
微生物检测技术中的流式细胞术的应用教程
微生物检测技术中的流式细胞术的应用教程流式细胞术是一种广泛应用于微生物检测技术的高效、准确的方法。
它利用流式细胞仪对微生物细胞进行快速而准确的检测和分析，为微生物学研究、病原体诊断和环境监测等领域提供了重要的工具。
本文将为读者介绍流式细胞术的基本原理、实验步骤和常见应用。
流式细胞术的基本原理是利用流式细胞仪的光学系统将待测样品中的微生物细胞逐个通过一个狭窄的流道，并通过激光束照射细胞，然后测量经过细胞的散射和荧光信号。
利用这些信号，流式细胞仪可以快速确定微生物细胞的数量、大小、形态以及特定标记物的表达情况，从而对样品进行定性和定量分析。
在进行流式细胞术前，首先需要准备样品。
样品可以是来自培养基中生长的微生物细胞、环境样品（如水、土壤）中的微生物细胞，或者是体内组织、血液等样品中的微生物细胞。
样品通常需要进行处理，如细胞固定、细胞染色或荧光标记等，以便流式细胞仪可以准确识别和测量细胞。
接下来是样品的处理和染色步骤。
在流式细胞术中，常用的样品处理方法包括离心、过滤等，以获得单个细胞的悬浮液。
然后，可以通过荧光染色或标记物标记细胞，以便流式细胞仪可以进行荧光检测。
染色既可以针对整个样品中的细胞，也可以特异性染色，以检测感兴趣的微生物细胞。
样品处理和荧光染色完成后，就可以开始使用流式细胞仪进行细胞检测和分析了。
将样品注入流式细胞仪的进样室中，仪器会将细胞逐个引入流道，并通过激光照射细胞。
细胞与激光相互作用后，产生的信号会被流式细胞仪捕捉和测量。
流式细胞术常用的参数有三个：前向散射光（forward scatter, FSC）、侧向散射光（side scatter, SSC）和荧光信号。
前向散射光与细胞的大小和形态相关，侧向散射光与细胞的复杂度和颗粒含量相关，而荧光信号则与标记物的特异性结合情况相关。
通过测量和分析这些参数，可以获得关于细胞数量、大小、形态和特定标记物表达的信息。
除了基本的细胞检测和分析，流式细胞术还可以进行更加复杂的功能性分析和分选操作。
流式细胞术实验报告
一、实验目的本实验旨在通过流式细胞术技术，对细胞群体进行快速、精确的分析和定量测定，研究细胞的物理与化学性质，并对细胞进行分类和分选。
通过本次实验，掌握流式细胞仪的工作原理，了解其在细胞生物学研究中的应用。
二、实验原理流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒逐个进行快速定量分析和分选的技术。
其基本原理是将经过荧光标记的细胞或微粒，在流动系统中以高速通过，同时利用激光束照射细胞，通过光散射和荧光信号来获取细胞的大小、形态、表面标记物等信息。
最后，通过数据分析和可视化展示，对细胞进行计数、分类和分析。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 细胞样本：小鼠脾细胞、Jurkat细胞- 荧光标记抗体：CD45-FITC、CD3-PE、CD4-APC- 溶液：磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）、荧光染料（如PI）2. 实验仪器：- 流式细胞仪（如BD FACS Calibur）- 离心机- 恒温培养箱- 移液器四、实验步骤1. 细胞制备：- 收集小鼠脾细胞或Jurkat细胞，用PBS洗涤后，调整细胞浓度为1×10^6个/mL。
- 加入荧光标记抗体，室温下孵育30分钟。
- 用PBS洗涤细胞两次，去除未结合的抗体。
2. 流式细胞术分析：- 将处理好的细胞加入流式细胞仪，设置合适的参数进行检测。
- 收集数据，进行细胞分类和分析。
3. 数据分析：- 利用流式细胞术分析软件（如CellQuest、FlowJo）对数据进行分析，包括细胞计数、分类、DNA含量分析等。
五、实验结果与分析1. 细胞分类：- 通过流式细胞术，成功将小鼠脾细胞和Jurkat细胞分为不同的亚群，如T细胞、B细胞等。
2. DNA含量分析：- 通过PI染色，检测细胞的DNA含量，发现小鼠脾细胞和Jurkat细胞均处于G0/G1期。
3. 表面标记物分析：- 通过CD45-FITC、CD3-PE、CD4-APC抗体检测，发现Jurkat细胞为T细胞，小鼠脾细胞中含有B细胞和T细胞。
流式细胞术实验方法及应用
2、阳性染色对照 用现有试剂和方法检测已知表达某种特 异性抗原的细胞即为阳性细胞。如检测血小板CD62P时， 可用被ADP诱导活化血小板作为CD62P检测的阳性对照细 胞。
3.阴性染色对照已知不表达某种抗原的细胞即为阴 性细胞群，如CD3/CD19双染检测健康人性细胞群（主要是NK细胞），可作阴性对照。 4. 同型对照 与染色的单克隆抗体特异性无关的免 疫球蛋白亚型，如IgG-FITC、IgG-PE
荧光能检测到单个微粒上标有荧光分子少于 <600个 (如FITC或PE)；前向角检测到小于0.3um 颗粒。 分选感兴趣的细胞 纯度达99%，收获率可达90%。
流式细胞术的应用范围
细胞大小 细胞表面分子:CD系列 细胞浆内分子：胞内细胞因子 细胞核内分子：P53 细胞功能检测:细胞周期、细胞凋亡
其他：线粒体膜电位、细胞内钙离子浓度
加OptiLyes C溶血素250ul
PBS洗一次
抗体:
上机分析
CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE-CY5三标抗体
CD19-PE/CD3-FITC二标抗体 CD16+56-PE/CD3-FITC二标抗体
IgG-FITC/IgG-PE/IgG-PE-CY5同型对照
淋巴细胞亚群检测临床意义：
育15-30min → 溶血素→ 室温10min → PBS洗1次
→上机分析（1% 多聚甲醛固定）。
2. 细胞浆或核内抗原标记法 收集单细胞悬(1×106)+固定剂A 去固定液 破膜剂B及抗体
室温，15 min 室温，15 min
洗涤
PBS洗涤1次
上机分析（1% 多聚甲醛固定）。
3. 细胞表面和细胞内抗原同时标记
流式细胞术的基本原理及其应用
流式细胞术的基本原理及其应用流式细胞术的基本原理是通过将携带荧光标记物的细胞单个穿过一个经过纳米级微孔的流动细胞仪中，在仪器静止状态下，用激光束照射细胞，测量细胞散射光强度和荧光素（荧光标记物）发射光强度，并对荧光标记物进行定量和定性分析。
流式细胞术有多个功能模块来实现这些原理，包括样本处理和采集、检测光源、光学系统、示波器、计算机控制和数据分析软件等。
应用方面，流式细胞术在免疫学、细胞生物学和药物研发等领域具有广泛的应用。
以下是几个流式细胞术的应用举例：1.免疫细胞表型分析：可以通过流式细胞术对白细胞表面的特定抗体标记物进行检测和分析，了解免疫细胞的分布、组成和功能状态。
这种技术在临床用于诊断和监测疾病，例如血液肿瘤的分型和监测、感染和免疫疾病的诊断。
2.DNA细胞周期分析：流式细胞术可以通过染色体分析来检测细胞周期的不同阶段，并评估细胞的增殖和DNA损伤。
通过分析细胞周期，可以确定干细胞、肿瘤细胞和其他细胞类型的比例，从而研究生物学和疾病发展过程中的细胞生长和增殖。
3.细胞凋亡分析：流式细胞术可以用荧光标记物来检测和分析细胞凋亡（程序性细胞死亡）的过程。
凋亡是正常生理和病理过程中的重要事件，例如生长发育和肿瘤发生。
通过分析细胞表面和内部标记物的表达和活性变化，可以了解细胞凋亡的诱导和调控机制。
4.细胞分选和分离:流式细胞术可以通过荧光标记物和细胞大小、复杂性等参数来识别和分选特定类型的细胞。
这种细胞分选技术在基因表达、单细胞转录组学、干细胞研究等领域具有重要应用，可以帮助研究者对细胞进行单个细胞水平的分析。
5.离子指示染料测定：通过使用与细胞膜融合的离子指示染料，流式细胞术可以测定细胞内离子浓度和动态变化。
例如，钙离子（Ca2+）作为重要的细胞信号分子，流式细胞术可以实时监测细胞内钙浓度的变化，并研究其与细胞功能和相应生理过程的关联。
总之，流式细胞术作为一种高通量、高灵敏度和多参数的细胞分析技术，在免疫学、细胞生物学和疾病研究中起着至关重要的作用，不仅可以提供定量的细胞信息，还可以为深入理解细胞生命活动和机制提供有效的实验手段。
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单细胞悬液
胸水、腹水：胸、腹水50-100ml，加入1000U/ml 肝
素液，置于4℃ 冰箱中静置 6-12h
尿 液：收集24h 尿液，置4℃冰箱中自然沉淀 2h 冲洗液：300-500ml 生理盐水冲洗膀胱 ，冰箱内置 6-12h
间
标
羊抗兔
五、荧光标记
主要包括间接免疫荧光染色和直接免
疫荧光染色两种方法。 间接标记是采用特异的无荧光标记的一
二、流式细胞术的特点、优点
速度快 极短时间内可分析大量细胞，每秒可检测上万个 细胞，甚至几万个细胞。
多参数分析 可同时分析单个细胞的多种特性，获得单个细 胞多种信息，也可以根据其细胞表面标志的不同把 细胞群分为各亚群。
定性、定量分析细胞 通过荧光染色对单细胞的某些成分，如：DNA、 抗原或受体等进行定性、定量分析。 灵敏度高 荧光能检测到单个微粒上标有荧光分子少于 <600个 (如FITC或PE)；前向角检测到小于0.3um 颗粒。 分选感兴趣的细胞 纯度达99%，收获率可达90%。
流式细胞术的应用范围
细胞大小 细胞表面分子:CD系列 细胞浆内分子：胞内细胞因子 细胞核内分子：P53 细胞功能检测:细胞周期、细胞凋亡
其他：线粒体膜电位、细胞内钙离子浓度
三、单克隆抗体标记荧光探针选择
1.了解激发光波长和发射波长 常用荧光素
激发光波长（nm ）
异硫氰酸（FITC） 488 发射波长(nm) 525（绿）
2500r/min，20-30min
单个核细胞
单核细胞: 利用单核细胞在短时培养贴壁快 的特性（30-40min），可采用短时培 养获得较纯的单核细胞.
2、培养细胞样品的制备(贴壁细胞)
培养板
胰蛋白酶
吸去培养液
37℃，室温，3-5min
PBS洗2次
含血清的培养基
吹打
PBS洗2次
单细胞悬液。
3. 组织器官单细胞悬液的制备
参数的意义: FSC的强度与细胞的大小有关，也就是说，细胞越大， 散射光越强，细胞越小,散射光越弱; SSC对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可反 映细胞颗粒性程度大小。 单参数直方图X轴代表荧光或散射光的强度，Y轴代该 道所具有相同光信号细胞的频率或相对的细胞数； 双参数散点图X轴和Y轴均代表散射光或荧光的强度.
七、荧光补偿
流式细胞分析中常需要两种或两种以上不 同荧光素标记的单克隆抗体进行多色分析。由 于目前使用的各种荧光染料都是宽发射光谱性 质，发射光谱范围有一定的重叠，出现结果误 差，克服这种误差的有效方法就是使用荧光补 偿。
八、数据分析
流式细胞术的目的是对我们感兴趣的细胞进行 分析，其中设门技术是流式细胞数据分析中最为独 特的技术，是指在细胞分布图中指定一个范围或一 片区域（门），对其中的细胞进行单参数或多参数 分析。设门包括线性门、矩形门、圆形门、多边形 门、任意门和四象门等。
藻红蛋白（PE）
碘化丙啶（PI） 藻红蛋白偶联物（PECY5） 藻红蛋白偶联物（PECY7） 别藻青蛋白（APC）
488
488 488 488 633
575（橙）
610（红） 667（红） 767（红外） 660（红）
别藻青蛋白偶联物 （APC-CY7）
633
767（红外）
2. 要有高的光子产量---提高信号强度。
生理盐水
1000r/min，5min
300目尼龙网过滤
研磨法
组织块洗去血液 单细胞悬液。 研磨器研至匀浆 离心 100目钢筛网 PBS洗2次 300目尼龙网过滤
1000r/min，5min
4. 石蜡包埋组织单细胞悬液的制备
手术获得的新鲜实体组织，常要送病理石蜡包 埋处理，这些标本也可用于流式细胞术的检测。
流式细胞结合单克隆抗体技术能准确分类 计数淋巴细胞亚群，被认为是血液中淋巴细胞 免疫表型分析的标准方法。血液淋巴细胞是一 群特异性极强的细胞，根据淋巴细胞的功能及 膜表面标志，主要分为T淋巴细胞(CD3+)、B淋 巴细胞(CD19+)、NK细胞(CD16+56+/CD3-)三个 亚群。
T淋巴细胞（CD3+） 淋巴细胞 B淋巴细胞（CD19+） NK细胞（CD16+56）+
3. 对激光有强的吸收----降低背景噪音。
4. 激发光谱和发射光谱之间差距大---减少
干扰。
5. 易与被标记的物质结合，而不影响被标记 物的特异性。 6. 稳定性好，不易受光、温度、标本抗凝剂 和固定剂等影响。
常用荧光探针组合
细胞表型分析：
双色分析：FITC与PE
三色分析：双色分析+PE-CY5
酶消化法
组织器官
机械法
单细胞制备仪 剪碎法 网搓法 研磨法
（1）、酶消化法
组织块洗去血液
37℃，15-30min
剪成小块
胰蛋白酶
100目 单
含血清的培养基 PBS 洗2次
钢筛网过滤
离心
300目尼龙网过滤
1000r/min，5min
细胞悬液。
（2）、机械法
单细胞制备仪
组织块洗去血液
100目钢筛网过滤
1982年世界卫生组织和国际免疫学会联合会， 将所有抗体根据白细胞分化抗原反应性的类型划 分为25群，把每一群抗体称为一个分化抗体群 (Cluster of Differentiation，CD)，进行编号、 命名，即为单克隆抗体的国际命名法。由CD抗体 群识别的分化抗原就称为CD分子。目前已有339个 分化抗体群被鉴定并命名
原染色，细胞内标记需要固定、破膜等步骤 1.细胞表面抗原的标记法（外周血为例 ） 全血50ul（5×105）+10ul相应抗体→避光孵 育15-30min → 溶血素→ 室温10min → PBS洗1次 →上机分析（1% 多聚甲醛固定）。
2. 细胞浆或核内抗原标记法 收集单细胞悬(1×106)+固定剂A 去固定液 破膜剂B及抗体
体时，将DNA含量直
方图分为三部分，
G0/G1 (2C)
S (2C→4C)
即G0/G1、S、G2/M
三个细胞峰。
G2/M G2/M
(4C) (4C)
方法：
细胞悬液（1*106） 70%冰乙醇
4º C ，24h
离心去固定液
30min
PBS洗2次
PI
避光,30min
RNase
上机
PBS洗1次
采集10000细胞，MultiCycle软件进行细胞
100目钢筛网过滤 1000r/min，5min PBS 洗2次
300目尼龙网 单细胞悬
5. 脱落细胞单细胞悬液的制备
包括：
尿液脱落细胞
胸水、腹水脱落细胞 冲洗液脱落细胞
收集胸水、腹水、尿液、冲洗液 沉淀 取底部10-20ml 300目尼龙滤网过滤 收集方法、沉淀时间
置 4℃ 冰箱中 PBS洗 3 次
剪成小块 PBS 洗2次
剪至浆状
制备仪
2-3min
300目尼龙网过滤
离心
剪碎法
1000r/min，5min
单细胞悬液。
吸管轻轻吹打
组织块洗去血液
100目钢筛网过滤 300目尼龙网过滤 离心 1000r/min，5min PBS 洗2次 单细胞悬液。
网搓法
组织块洗去血液 收集滤液 PBS 洗2次 100目钢筛网轻搓 离心 单细胞悬液。
激光
前向散射
FALS Sensor
Freq
Fluorescence
侧向散射，荧光信号
FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
近30年来流式细胞术在我国得到很 快的发展，应用范围不断增大。目前， 流式细胞术作为一门生物检测技术广泛 应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞 遗传学、细胞生物学、生物化学等临床 医学和基础医学研究领域。
六、荧光染色对照设置(空白对照
同型对照 )
、阳性对照、阴性对照、
1、空白对照
用缓冲液（PBS）代替单克隆抗体进行实验
2、阳性染色对照 用现有试剂和方法检测已知表达某种特 异性抗原的细胞即为阳性细胞。如检测血小板CD62P时， 可用被ADP诱导活化血小板作为CD62P检测的阳性对照细 胞。
3.阴性染色对照已知不表达某种抗原的细胞即为阴 性细胞群，如CD3/CD19双染检测健康人血液淋巴 细胞亚群时，应有一群不表达这两种抗原的双阴 性细胞群（主要是NK细胞），可作阴性对照。 4. 同型对照 与染色的单克隆抗体特异性无关的免 疫球蛋白亚型，如IgG-FITC、IgG-PE
周期分析
G0/G1 (2C)
S (2C→4C) G2/M (4C)
当人体癌变或者具有恶性潜能的癌前病变时， 在其发生、发展过程中可伴随有细胞DNA倍体及S期 的改变（异倍体） 恶性肿瘤细胞增殖周期的判断： S>10、G2/M>15或S>20、G2/M>5
2、 淋巴细胞亚群分析
白细胞分化抗原（CD分子）的命名：
四色分析：三色分析+ECD DNA含量分析： PI 凋亡与坏死分析： 凋亡用Annexin V-FITC/PI双染
四、标本的收集、单细胞悬液的制备
骨髓、外周血、细胞株、组织器官、 胸水、腹水、尿液脱落细胞等
1、骨髓及外周血细胞单细胞悬液的制备
骨髓及外周血都是天然的单个细胞，可直接标记， 再溶血。 单细胞的分离制备 分离液 离心 血液+生理盐水
CD3+
CD3+CD8+ CD3+CD4+
NK+/CD3-
CD（16+56）+/CD3+ （T-cell）
NK细胞: CD(16+56)+/CD3-