流式细胞术基本原理
流式细胞仪(Flow Cytometer)基本原理
流式细胞术的特点
检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； 检测参数：多参数； 检测特点：单细胞水平分析； 检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒； 检测结果：精度高、准确性好； 可对目标细胞进行分选；
2、流式细胞术光信号检测
光信号的类型 散射光信号：与标记荧光素无关，
是细胞的固有参数。
FL1-FITC stain
D、 FMO对照
多色实验中，阴性对照和单染对照并不是严谨的设门对照， FMO对照区分阴性群体和阳性群体更准确。
Fluorescence Minus One 荧光减一对照
(-) PE
FITC
PE
补偿调节引起背景荧光增强。 颜色越多背景荧光越强，限制了多色流式技术的发展。
C、 单标对照 Single Staining Control
由于荧光素的宽发射谱特点，荧光通道间有光谱重叠现象。 多色流式实验的时候需要通过补偿调节消除光谱重叠影响。
FL1 530/30 FL2 585/42
FITC 发射谱
PE 发射谱
Wavelength
补偿调节方法：
FL-2(PE)
1、流式细胞术简介
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式细胞仪为检 测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒)的 理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。
流式细胞仪（Flow Cytometer ）是集细胞与分子生物学、 流体力学、激光技术、光电子技术、计算机技术、细胞荧光 化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种高科技仪器。
粘连 细胞 死细胞
死细胞 或碎片
肿瘤细胞株FSC/SSC散点图
加药处理后FSC/SSC散点图
流式细胞技术原理
流式细胞技术原理
流式细胞技术是一种高效的细胞分析方法，它可以对单个细胞进行快速、准确的分析。
该技术主要基于细胞在流动状态下通过激光束时所
产生的散射和荧光信号，通过对这些信号的测量和分析，可以获得有
关细胞形态、大小、表面标记物、内部结构和功能等方面的信息。
流式细胞技术基本原理如下：
1. 细胞样品制备：将待检测的细胞样品进行处理，如离心、洗涤等操作，使其达到单个细胞状态，并加入荧光染料或抗体等标记物，以便
在流式仪中进行检测。
2. 细胞在流式仪中流动：将制备好的样品注入到流式仪中，在高速液
体流动中被逐个单独地通过激光束。
3. 激光束照射：当细胞通过激光束时，会发生散射和荧光现象。
散射
现象包括前向散射（FSC）和侧向散射（SSC），前者与细胞大小相关，后者与细胞复杂程度和内部结构相关。
荧光现象则是标记物受激发后
发出的荧光信号，可以用于检测细胞表面标记物或内部结构。
4. 信号检测：流式仪会收集细胞产生的散射和荧光信号，并将其转化
为电信号，通过光电倍增管等装置进行放大和转换。
同时，流式仪还
会记录细胞通过激光束的时间和位置信息。
5. 数据分析：通过对上述收集到的信息进行分析，可以得到有关样品
中细胞数量、大小、形态、表面标记物、内部结构和功能等方面的信息。
这些数据可以用于研究细胞生理学、病理学、药理学等领域。
总之，流式细胞技术利用了细胞在流动状态下产生的散射和荧光信号，通过对这些信号的测量和分析，实现了对单个细胞的快速、准确分析。
该技术在生命科学研究中有着广泛应用，在临床诊断、药物筛选等方
面也有着重要作用。
FCM(流式细胞术检测)原理及临床应用
流式细胞术(flow cytometry FCM)是利用流式细 胞仪对单个生物颗粒(红细胞、白细胞、各类组织细 胞、血小板、微生物等)以及人工合成微球的物理和 生物学特性进行多参数定量分析，并能对特定细胞 群体加以分选的分析技术。
FCM的工作原理
流式细胞仪组成：
1.液流系统 2.光学系统 3.数据处理系统
双标记或多标记分析：目前使用的流式细胞仪 能用一个激光束激发检测三色甚至四色荧光信 号。检测时需注意荧光补偿。
常用免疫荧光染料组合
荧光染料 FITC+PE
激发波长 （nm）
488
发射波长（nm） 525、575
颜色 绿色、橙色
FITC+PeCy5
488
525、675
绿色、红色
FITC+ECD
488
实体瘤以多倍体居多；
G0 期：DNA 合成静止期 G1 期：DNA 合成前期 S 期： DNA 合成期 G2 期：DNA 合成后期 M 期： 细胞分裂期
DNA 倍体 2N 2N
2N-4N 4N 4N
DNA非2倍体出现是鉴别良性与恶性肿瘤的特异性指 标:
良性肿瘤和正常组织良性增生不出现DNA非2倍体细 胞而恶性肿瘤常可出现异倍体细胞；
过去认为 FCM测定残存白血病细胞不可靠， 因为现用的 McAb不能鉴别正常血细胞与白血 病细胞。虽然至今尚未发现白血病细胞特异抗 原，但近来有人提出根据白血病细胞的以下特 征， FCM检测的敏感度可明显提高
白血病细胞的某些抗原表达量明显高于相应 的正常血细胞
如小儿ALL，其CDl0+细胞的荧光强度可 高达3-4个对数值，而其 CD45则为弱阳性或 阴性。
525、625
流式细胞术的原理和应用
流式细胞术的原理和应用1. 引言流式细胞术（Flow Cytometry）是一种广泛应用于生命科学研究和临床诊断的技术。
通过使用流式细胞仪，可以对生物细胞进行快速、精准的多参数分析，为科学家和医生提供了大量的有关细胞的信息。
流式细胞术已成为生物学领域的重要工具，被广泛应用于细胞分析、免疫表型分析、药物筛选等领域。
2. 原理流式细胞术基于细胞在封闭流动系统中单个通过的原理。
其基本流程包括样本制备、细胞标记、细胞检测和数据分析。
2.1 样本制备样本制备是流式细胞术的第一步，它需要将待检测的细胞样本制备成单细胞悬浮液。
这可以通过细胞培养、组织切片或体液等方式获得细胞样本。
重点是要避免细胞凝聚和聚集，以确保细胞在流式细胞仪中单个通过。
2.2 细胞标记细胞标记是流式细胞术的关键步骤之一。
它使用荧光染料或抗体等标记物与目标细胞发生特异性反应。
荧光染料可以通过不同的通道发出不同波长的荧光信号，从而实现多参数分析。
细胞表面标记的抗体通常与荧光素共价结合，以产生可检测的荧光信号。
同时，可以利用染料进行细胞内部器官或分子的标记，以更详细地研究细胞的功能和结构。
2.3 细胞检测细胞检测是流式细胞术中最关键的步骤之一。
它通过流式细胞仪将标记后的细胞悬浮液以单个细胞的形式通过单个检测区域。
这些细胞在流式细胞仪中被激活并产生荧光信号。
光电传感器将捕获和记录这些荧光信号，并将其转化为数字信号，供数据分析使用。
2.4 数据分析数据分析是流式细胞术的最后一步。
通过对获得的荧光信号的数字化处理，可以获得有关细胞的详细信息，包括细胞表面标记物的表达水平、细胞数量统计、细胞大小等信息。
数据分析可以使用专业的流式细胞仪软件完成，也可以使用其他数据分析软件进行更复杂的数据处理。
3. 应用流式细胞术作为一种全面、高通量的细胞分析技术，广泛应用于各个领域。
3.1 免疫学研究流式细胞术在免疫学研究中得到了广泛应用。
通过对免疫细胞的表面标记物进行检测，可以评估免疫细胞亚群的数量、功能和表达水平。
流式细胞术原理
流式细胞术原理流式细胞术原理概述：1.什么是流式细胞术：流式细胞术是将多种特定条件下的离体细胞（即细胞不在原生质上）置入一个流式细胞仪，并利用各种仪器和仪器注入液体，通过细胞之间物质交换，使其在有限时间内受到良好的刺激、富集和选择，从而在定量和质量上均匀地输出体外驯化后的细胞。
2.流式细胞术应用：（1）表型分析：基因表达分析、蛋白质表型分析、抗原检测以及多种分子诊断测试；（2）免疫学应用：免疫细胞排序（FACS）、免疫细胞鉴定、免疫细胞功能分析；（3）其他研究：血液细胞分离以及人类疾病细胞的示蹤。
3.Flow Cytometry的原理：首先，将活细胞置于流式细胞术仪中，然后，在仪器里运动，在仪器里的运动速度是一个恒定的流动；接着，激光会从另一边投射进去，在有特定滤波器的情况下，激光射线就会倒射，与细胞中存在的染料结合，以此来分析表达位点上的基因和蛋白的表达情况，并且在此过程中会记录下所有的数据；最后，细胞会流经检测仪的椭圆形游标，当单束仪检测到某个细胞时，就会发出一个电信号，这样就可以将其标记出来，最后可以将所有细胞记录下来，便于分析表达位点或者染料反应情况，从而分析细胞的类型及其分布情况。
4.Flow Cytometry技术优势：（1）快速：流式细胞术可以在几秒钟内完成大量细胞的分析；（2）灵敏：细胞可以通过可调的激光强度以及多样的滤波器在流式细胞术下被准确检测；（3）准确：使用低酵母可以对细胞表面抗原以及内在细胞特性有更加准确的测定；（4）方便：整个实验过程只需要较少的样本量即可完成，且可以重复性进行，从而可以进行大量的分析和比较。
综上所述，流式细胞术是目前用于研究表型分析、免疫细胞排序以及细胞表面抗原及细胞内特性检测等多个研究领域，功能强大，分析快速准确，整个实验过程便捷、经济等特点，极大地拓展了体外实验、单细胞研究和诊断测试领域，成为细胞及分子生物学研究的有力工具。
流式细胞术工作原理
流式细胞术工作原理流式细胞术又称为流式细胞分析（FACS），是一种用于快速测定和分析细胞及其组分的工具和技术。
它通过对单个细胞的多重参数进行单细胞测量和分析，可对不同种类和状态的细胞进行区分和识别，从而为细胞学、免疫学、实验室诊断和药物研发等领域提供了重要的实验手段和数据支持。
流式细胞术工作原理基于一定的光学原理和电子信号转换技术，其主要步骤包括样本准备、流式细胞仪检测和数据分析等三个部分。
下面将详细介绍各个部分的工作原理：1. 样本准备样本准备是流式细胞术的第一步，它主要是为了将待测细胞或细胞组分转化成能够被流式细胞仪检测和分析的样品，其中包括以下几个步骤：（1）细胞收集：这是流式细胞术的前提条件，它要求待测细胞必须单个存在，不能形成团块或粘连。
通常采用利用酶或化学试剂将细胞从组织、器官、培养基或体液中分离出来进行收集。
其中细胞来源各不相同，可以是血液、骨髓、组织癌变、分离免疫细胞等等。
细胞处理在流式细胞学中是个棘手的问题。
该过程既需要最大程度地维持细胞的原始形态和性质，又不影响流式细胞仪对细胞的检测和分析。
样本处理的方式包括细胞染色、标记、吸释样本预处理等方法，处理条件严格，样品要求高纯度，无污染。
细胞染色是为了能够让细胞在仪器中产生不同的光谱信号。
染色剂的种类有非常多，它们包括活细胞染色剂、细胞膜染色剂、DNA染色剂、标记抗体等。
一般情况下，染色前细胞都要进行适当的处理，如调节pH值、添加细胞破解液等，扩大染色剂与待测细胞的作用。
2. 流式细胞仪检测流式细胞仪是用于测量和分析单个细胞的主要工具和设备，它是由激光器、光学器件、检测单元和计算机组成的。
在具体工作中，样品通过采用压力推动等技术被强制通过一个光学器件中的微细通道，流式细胞仪则通过这个微细通道对其进行检测和分析。
具体步骤如下：（1）激光器发出激光：激光是流式细胞仪最核心的光源，它可以发射可见光、激光、紫外线等光谱范围内的单色光束。
光线经过反射器作用，形成光束。
流式细胞术原理
流式细胞术原理流式细胞术工作原理是在细胞分子水平上通过单克隆抗体对单个细胞或其他生物粒子进行多参数、快速的定量分析。
操作步骤包括细胞表面标记的检测和细胞内细胞因子的检测。
流式细胞技术是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选技术。
流式细胞术是单克隆抗体及免疫细胞化学技术、激光和电子计算机科学等高度发展及综合利用的高技术产物。
流式细胞仪由液流系统、光学系统和电子系统三部分形成。
流式细胞技术基本原则：1.并使各种液体和漂浮细胞样本新鲜，尽快顺利完成样本制取和检测；2.针对不同的细胞样本进行适当洗涤、酶消化或edta处理，以清除杂质，使粘附的细胞彼此分离而形成单细胞状态；3.对新鲜实体瘤非政府可以采用或单胺酶消化法，机械收编法和化学集中法去赢得足够多数量的单细胞悬液；4.对石蜡上皮组织非政府应先切开若干40-50um薄的蜡片，经二甲苯重熔至水后，再用前述方法制取单细胞悬液；5.单细胞悬液的细胞数不该多于个。
流式细胞的具体实验步骤基本是细胞表面标记的检测和细胞内细胞因子的检测两部分。
一、细胞表面标记的检测1.试剂平衡至室温。
准备：消毒台面；穿戴工作服，帽子，口罩和手套，放置棉签，草纸和有盖垃圾桶（内装有消毒剂）；2.写编号纸并编号；3.每管加相应的抗体10l/每种和50l全血，震荡，室温避光20分钟。
加血前摇匀血样；4.加入溶血素1ml，震荡后室温避光10分钟；5.离心，转， 5分钟。
弃上清，震荡；6.加入pbs洗液2ml，震荡，离心，转， 5分钟。
弃上清，震荡；7.加入pbs l。
上机前4度保存；8.上机。
二、细胞内细胞因子的检测1.准备：消毒台面；穿戴工作服，帽子，口罩和手套，放置棉签，草纸和有盖垃圾桶（内装有消毒剂）；2.写下编号纸并编号；3.取出pma（1∶），bfa（1∶10）和离子霉素（1∶10），使用无菌无叠氮钠pbs稀释储存液；4.提振：挑全血或pbmcs（细胞数在0.5-1 ）50l/管，再重新加入50l rpmi展开吸收一倍，重新加入刺激剂pma，离子霉素和bfa，搅匀。
流式细胞术的原理
流式细胞术的原理流式细胞术是一种用于分析和分选细胞的技术，广泛应用于生物医学研究领域。
它能够快速、准确地分析细胞的表面标记物、内部结构和功能状态，为细胞生物学和免疫学研究提供了重要的手段。
流式细胞术的原理主要包括细胞样本的制备、激发光源的照射、细胞信号的检测和数据分析等步骤。
首先，对于流式细胞术的样本制备非常关键。
细胞样本需要经过胰酶消化、过筛等步骤，获得单细胞悬浮液。
然后，通过离心等手段将细胞沉淀，去除细胞培养基和其他杂质。
接着，将细胞悬浮液进行染色，使细胞表面或内部的标记物与荧光染料结合，以便后续的检测和分析。
其次，流式细胞术需要激发光源的照射。
常用的激发光源包括氩离子激光、氦氖激光等。
这些激发光源能够激发荧光染料发出荧光信号，不同的荧光染料对应不同的波长，因此可以通过选择不同波长的激发光源来激发不同的荧光信号，实现多参数的细胞分析。
然后，流式细胞术通过检测细胞信号来获取细胞的信息。
当细胞悬浮液经过流式细胞仪时，激发光源照射到细胞上，激发荧光染料产生荧光信号，流式细胞仪通过光学系统收集这些信号，并将其转化为电子信号。
这些电子信号经过放大、数字化等处理后，最终被传输到计算机中进行数据分析。
最后，数据分析是流式细胞术的重要步骤。
通过对细胞信号的数据分析，可以得到细胞的表面标记物表达情况、内部结构的特征、细胞的功能状态等信息。
同时，流式细胞术还可以进行细胞的分选，即根据细胞信号的特征，将特定类型的细胞进行分离和收集，为后续的实验研究提供纯净的细胞样本。
综上所述，流式细胞术通过样本制备、激发光源的照射、细胞信号的检测和数据分析等步骤，能够快速、准确地分析和分选细胞，为生物医学研究提供了重要的技术支持。
它在细胞生物学、免疫学、临床诊断等领域具有广泛的应用前景，对于揭示细胞的生理和病理过程，以及开发新的药物和治疗手段具有重要意义。
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—低流速：一般用于对分辨率要求较高的分析， 如DNA分析。
激光延迟（laser delay）
Laser 1 Laser 2
液滴延迟（drop delay）
颜色补偿
—采用合适的方法校正荧光染料之间叠加所造成 的误差。在完成双色以上荧光标记的样本时， 都需要作颜色补偿。
目前流式细胞仪可以检测的类别
细菌
浮游生物
红细胞
DM：0.2μm ——15μm
单核细胞
淋巴细胞 中性粒细胞
流式细胞仪的基本构造
流动室与液流系统：将 细胞单个压入流动室
光学滤镜
信号收集与数据 处理系统
激光发射器 发出所需要的波长的激光
光源与光学系统
侧向散射光检测器
前向散射光检测器
流动室
荧光信号 聚焦的激光光束
—信号放大
– PMT将光信号转换成电信号，调整PMT的电压， 信号强度将随之改变
光信号
光电倍增管（PMT）
电信号
放大器
放大器两种放大方式： ➢ 线性放大（lin） ➢ 对数放大（log）
线性放大（lin）
—按光强度的线性关系输出信号.适用于在较小 范围内变化的信号以及代表生物过程的信号， 如DNA含量、总蛋白含量等。
门（Gate）
— 分析/分选感兴趣的细胞群
对照
— 同型对照：为没有特异性、与荧光抗体蛋白亚型一致 的免疫球蛋白，通常是未进行免疫小鼠血清的纯化 IgG1或IgG2，用于检测和消除（一抗）非特异性结合 到组织细胞而产生的背景染色。
— 空白对照：即不进行标记的细胞。主要用于确定待测 标本的基础荧光阈值或检测染色方法时候成功。
流式细胞术基本原理
陈晓东 产品技术专员
广州市珈源医学试剂有限公司
流式细胞术
流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种 可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒 （通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特 定群体加以分选
研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生 物、及人工合成微球等
两者相结合就能说明 细胞种类
二维等高图和密度图
Pseudo 3D Plot 假三维图与三维图
3D Plot
流式细胞仪如何获取细胞信号？
—FSC —SSC —FL
— 前向角信号（Forward Scatter，FSC）
前向角信号：细胞的大小
10
1000
Count Count
FSC
FSC
— 侧向角信号（Side Scatter， SSC）
—侧向角散射信号（SSC） 反映细胞颗粒度
—荧光信号（FL Signals）（FL1、2、3……） 胞内、胞外染色情况
流式细胞仪显示图的种类
FSC和SSC
直方图
散点图
把前向散射光图和侧 向散射光图的一维图 像在二维图像上投影， 便是我们平常所看到 的流式图。
所以横坐标表示的是 细胞的直径大小；纵 坐标表示的是细胞的 复杂程度。
— 阳性对照：即已知表达某种抗原的细胞（阳性细胞） 进行平行实验，通常用于检测抗体是否有问题或确定 实验方法的稳定性、准确性。
谢谢！
— 在流式细胞仪中，一般经过LP或SP滤片将荧光大 致分开后，再经过一BP滤片分离出特征荧光
流式细胞仪的光路
开放式光路 Calibur、Influx
封闭式光路（CantoⅡ、LSR系列、Aria系列）
分选
—将目标细胞 分离并富集 ，进行后续 研究。
—分选纯度 >99%
震荡
激光
偏转板
Fluorescence Activated Cell Sorting
对数放大（log）
—按光强度的对数关系输出信号.在免疫学测量 中通常使用对数放大。
电脉冲信号类型
—将与电脉冲信号 强弱相关的电压 数字化
—有三类电脉冲信号 – 高度信号H – 面积信号A – 宽度信号W
CV值
CV值（变异系数）： 样品均一度及仪器分辨率的标志
CV值一般<2%
样本流速
样本流速选择
—FITC主要由FITC的检测器检测，但部分光也会 进入PE检测器。如果单染FITC，同时打开PE检 测器，则如图：
阴性对照
理想状态
实际情况
补偿效果
阈值
— 信号放大过程会产生不需要的脉冲信号，通常来自于
碎片。通过设定某一信号的最低强度值，可将不需要
的脉冲信号去除，这一设定值称为阈值。
屏蔽噪音信号和碎片信号பைடு நூலகம்
488
525
免疫荧光
PE(RD1) 488
575
免疫荧光
PerCP 488
670
免疫荧光
PI
488
620
DNA染色
ECD
488
620
免疫荧光
PeCy5 488
675
免疫荧光
APC
633
670
免疫荧光
DAPI
359
462
DNA染色
颜色 绿色 橙色 红色 橙红 橙红 红色 红色 蓝色
荧光染料光谱特征
荧光分离原则
Injector Tip
鞘液
光学滤片
— 当光子遇到滤片时，光子或通过滤片，或被滤片吸收 ，或被滤片反射。
光学滤片的种类
➢ 长通滤片（LP）：630LP ➢ 短通滤片（SP）：550SP ➢ 带通滤片（BP）: 488/10
流式细胞仪可获取的信号种类
共有两类：散射信号与荧光信号
—前向角散射信号（FSC） 反映细胞大小
10
1000
Count Count
SSC
SSC
FL
count
FL
FSC、SSC、FL
如何分离90°角内的各种荧光信号？
荧光染料
—吸收某一波长的光波后能发射出大于吸收光波 长的光波的物质
488n
激发光
>600nm
PI
荧光染料种类
荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途
FITC
研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加 以定量
流式细胞仪的特点
单个细胞/生物颗粒分析 同时多参数、多荧光分析 高通量检测/高速度 10000个细胞/秒以上 定性/定量分析 分选特定性状或功能的细胞 可检测的样本种类多样
(1)外周血，骨髓，细针穿刺，洗脱液，实体 组织，培养细胞 (2)血清、血浆、培养上清、细胞裂解液
488 nm laser
FALS Sensor Fluorescence detector
- Charged Plates
+
Single cells sorted into test tubes
几个概念
信号放大模式 信号类型 CV值 样本流速 激光延迟 液滴延迟 荧光补偿 阈值 门 对照