流式细胞术应用概述分析解析
流式细胞术及其应用(1)
血小板检测指标：
质膜糖蛋白：CD41/CD61（gpⅡb/Ⅲa）、
CD42b(GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ)
颗粒膜糖蛋白：CD62P、CD63、TSP。
活化：gpⅡb/Ⅲa复合物—活化早期标志物
CD62P—活化后期的表面标志
血小ห้องสมุดไป่ตู้抗体（PAIgG）。
网织血小板计数：常用染料为TO。
应用 血小板无力症诊断：
而现代流式细胞术，更是由于结合 了单克隆抗体技术、定量细胞化学和定 量荧光细胞化学的应用，使其在生物学、 临床医学、药物学等众多研究领域的应 用将会越来越广泛。
五、流式样品的制备中应注意的几个问题
㈠荧光素和抗体的选择
⒈荧光素的选择：现在国内引进的大多数流式 细胞仪只装有一个激光光源，即488nm光源，所以 我们在选择荧光素时要选择能被488nm激光激发的 荧光素，常用的荧光素有：
选择纯度高的抗体、用同型对照抗 体或双标记排除非特异荧光
在细胞生长状态良好时测试、避 免反复吹打
彻底消化、在用酒精固定细胞时 加入终浓度为1.5-3％的小牛血清
一、 流式细胞术的概念
流式细胞术（FCM）就是对在高速 流动的鞘液包括下的细胞、粒子进行分 析和分选的技术，这种细胞或粒子是经 过特异荧光标记的。其特点是测量速度 快，每秒钟能测数千个乃至上万个细胞， 且可进行多参数测量，另一特点是在分 析的同时可把具有指定特征的细胞分离 出来，这就是分选技术。
FCM(Flow Cytomytry 流式细胞术)
流式样品制备过程中常见的问题及解决对策
常见问题
原因
解决对策
细胞密度低 制备过程中细胞损失 增加离心时间、吸弃上清
非特异荧光强 碎片多
细胞聚集
荧光弱
流式细胞术的医学应用现状与前景
流式细胞术的医学应用现状与前景1. 引言1.1 流式细胞术的概述流式细胞术是一种高度精密的细胞分析技术，通过将细胞悬浮液通过一根细小的管道，使细胞以单个细胞为单位通过流式细胞仪进行检测和分析。
它可以同时测量多个不同参数，包括细胞大小、形状、表面分子的表达、细胞内蛋白质的含量等，从而提供了关于细胞特性和功能的重要信息。
流式细胞术的主要原理是利用激光束照射细胞，分析细胞对激光的反射、散射或荧光发射，从而得到关于细胞的信息。
由于流式细胞术可以快速高效地分析大量细胞，并且提供了高度精确的数据，因此在医学研究和临床诊断中得到了广泛的应用。
除了在癌症诊断中广泛使用外，流式细胞术还可以用于免疫学研究、干细胞疗法和传染病检测等领域。
随着技术的不断进步和发展，流式细胞术在医学领域的应用前景将更加广阔，为医学研究和临床诊断带来更多的可能性。
1.2 流式细胞术的重要性1. 诊断疾病：流式细胞术可以帮助医生快速准确地诊断各种疾病，特别是癌症。
通过对患者血液或组织样本中的细胞进行分类、分析和计数，可以帮助医生确定疾病的类型、分期和预后，从而为患者制定更有效的治疗方案提供依据。
2. 研究免疫学：流式细胞术在免疫学研究中扮演着重要角色，可以帮助科学家快速准确地分析和分类免疫细胞，研究免疫应答机制、自身免疫性疾病发生机制等，为免疫疗法的发展提供重要数据支持。
3. 干细胞疗法：流式细胞术可以帮助筛选和分离出特定类型的干细胞，用于干细胞治疗和再生医学研究。
通过流式细胞术可以精确地检测和分选出干细胞群，提高治疗效果和减少患者的风险。
4. 传染病检测：流式细胞术可以帮助快速检测感染病原体的细胞，如病毒、细菌等。
通过流式细胞术可以提高传染病的早期诊断率和治疗效果，有助于控制传染病的传播。
流式细胞术在医学领域中具有重要的应用意义，为疾病诊断和治疗提供了重要的技术支持，同时也为医学研究提供了重要的数据和手段。
随着技术的不断发展和完善，流式细胞术在医学领域的重要性将会愈发凸显，为医学领域的发展提供更多的可能性和机遇。
流式细胞术原理及应用
流式细胞术原理及应用
流式细胞术是通过一种名为流式细胞仪的仪器完成的，它能够以非常
高的精确度进行分析和检测。
流式细胞仪通过一根轴，从这个轴上有三根
弹性管，细胞进行注射，从而使细胞在管中行进，细胞同时也受到外界信
号的影响，这种信号可以来自磁场、电场或光场。
当细胞运行到仪器的另
一端时，它们会被照亮，通过一台摄像机可以拍摄到高清晰度的照片，然
后在计算机上进行分析处理。
流式细胞术广泛应用于早筛检、医学诊断、药物发现、药理学实验和
抗生素耐药性研究等方面，它能够更加精确、快速地进行细胞分析。
此外，流式细胞术也可以用于分析抗原抗体，免疫细胞介导的反应，以及细胞因
子如细胞因子和表面受体等的表达情况。
这种技术还可以用来监测血液中细胞水平的变化，如血小板、红细胞、白细胞等。
流式细胞术分析的工作原理及应用
流式细胞术分析的工作原理及应用1. 工作原理流式细胞术（Flow Cytometry）是一种广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域的细胞分析技术。
它基于细胞在流式细胞仪中通过单个细胞传感器单元的原理，可以实时、快速地检测和分析细胞的各种特性。
1.1 流式细胞仪原理流式细胞仪是流式细胞术分析的核心工具。
它将细胞悬浮液注入到一个窄小的液流中，并通过雷射束（Laser Beam）对细胞进行激发。
当细胞经过激发光束时，会发射出特定波长的荧光信号。
流式细胞仪通过光学设备收集并分析这些信号，从而获得关于细胞的信息。
1.2 细胞荧光标记在流式细胞术分析中，细胞通常会被标记上特定的荧光染料，以便测量其特定特征。
这些标记可以是单一的，也可以是多重的，用于同时分析多个参数。
1.3 数据分析流式细胞仪在测量细胞荧光信号的同时，还会记录细胞的大小、形状和荧光强度等参数。
这些数据可以通过特定的软件进行分析和解释，以获得关于细胞数量、细胞类型和细胞功能等方面的信息。
2. 应用领域流式细胞术分析具有广泛的应用领域，在生物医学研究和临床诊断中发挥着重要作用。
2.1 免疫学研究流式细胞术在免疫学研究中广泛应用，可以用于分析免疫系统中不同类型的细胞数量和功能。
通过对白细胞表面标记物的检测，可以检测特定细胞亚群的存在，并研究其在疾病和免疫反应中的作用。
2.2 肿瘤学研究流式细胞术在肿瘤学研究中也扮演重要角色。
它可以用来研究肿瘤细胞的增殖、存活和死亡等关键特性，进而评估药物治疗对肿瘤细胞的影响。
此外，流式细胞术还可以检测循环肿瘤细胞，从而提供肿瘤早期诊断和治疗监测的手段。
2.3 微生物学研究流式细胞术被广泛应用于微生物学研究中，可以用于分析微生物的数量和生物学特性。
通过对细菌、真菌和病毒等微生物的荧光标记，可以确定它们的种类、数量和活性，从而研究其生长规律和致病机制。
2.4 干细胞研究流式细胞术在干细胞研究中也扮演重要角色。
简述流式细胞术的原理与应用
简述流式细胞术的原理与应用一、流式细胞术的原理介绍流式细胞术（Flow cytometry）是一种利用流式细胞术仪（Flow cytometer）对单个活细胞进行多参数分析的技术。
它基于细胞的光学性质和生物化学特性，通过探针标记、荧光染料和细胞表面抗原的相互作用，对细胞进行高速连续检测和分离。
流式细胞术的原理如下：1.细胞悬浮和样本处理：将细胞样品作为悬浮液，通过离心等方法将细胞分散在液体中，去除细胞的团块和碎片，保证单个细胞的流式检测。
2.细胞标记：采用流式细胞术特定的探针和染料对细胞进行标记，以便后续检测和分析。
常用的标记方法包括荧光染料标记、抗体标记和细胞分子探针标记。
3.细胞分离和传送：将标记的细胞悬浮液通过流式细胞术仪，以流速每秒数千个细胞的速度单个分子传送到探测点。
4.光散射与荧光探测：细胞经过流式细胞术仪后，以激光束照射细胞，通过散射光和荧光信号的检测，对细胞进行空间分布和化学信息的获得。
5.数据采集与分析：通过计算机系统采集和记录细胞经过流式细胞术仪后所产生的光散射和荧光信号，在分析软件中对数据进行处理和解读，获得有关细胞的信息。
二、流式细胞术的应用流式细胞术是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的技术，它在细胞学、免疫学、血液学、肿瘤学等领域有着重要的应用价值。
下面列举几个流式细胞术的应用示例：1.血液学研究：流式细胞术结合细胞表面标记和荧光染料标记，可以对血液中的不同细胞类型进行快速的鉴定和数量分析。
例如，通过流式细胞术可对血液中的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞等进行分类和计数，从而判断患者的免疫状态和疾病进展。
2.癌症诊断与治疗：流式细胞术对肿瘤细胞的检测和分析有着重要的作用。
通过流式细胞术，可以检测和定量肿瘤细胞的表面抗原和细胞内信号分子，进一步了解肿瘤细胞的类型、分化程度和增殖状态，为癌症的诊断和治疗提供指导。
3.免疫学研究：流式细胞术能够对免疫系统中的各种细胞类型进行鉴定、计数和功能分析。
FCM(流式细胞术检测)原理及临床应用
流式细胞术(flow cytometry FCM)是利用流式细 胞仪对单个生物颗粒(红细胞、白细胞、各类组织细 胞、血小板、微生物等)以及人工合成微球的物理和 生物学特性进行多参数定量分析，并能对特定细胞 群体加以分选的分析技术。
FCM的工作原理
流式细胞仪组成：
1.液流系统 2.光学系统 3.数据处理系统
双标记或多标记分析：目前使用的流式细胞仪 能用一个激光束激发检测三色甚至四色荧光信 号。检测时需注意荧光补偿。
常用免疫荧光染料组合
荧光染料 FITC+PE
激发波长 （nm）
488
发射波长（nm） 525、575
颜色 绿色、橙色
FITC+PeCy5
488
525、675
绿色、红色
FITC+ECD
488
实体瘤以多倍体居多；
G0 期：DNA 合成静止期 G1 期：DNA 合成前期 S 期： DNA 合成期 G2 期：DNA 合成后期 M 期： 细胞分裂期
DNA 倍体 2N 2N
2N-4N 4N 4N
DNA非2倍体出现是鉴别良性与恶性肿瘤的特异性指 标:
良性肿瘤和正常组织良性增生不出现DNA非2倍体细 胞而恶性肿瘤常可出现异倍体细胞；
过去认为 FCM测定残存白血病细胞不可靠， 因为现用的 McAb不能鉴别正常血细胞与白血 病细胞。虽然至今尚未发现白血病细胞特异抗 原，但近来有人提出根据白血病细胞的以下特 征， FCM检测的敏感度可明显提高
白血病细胞的某些抗原表达量明显高于相应 的正常血细胞
如小儿ALL，其CDl0+细胞的荧光强度可 高达3-4个对数值，而其 CD45则为弱阳性或 阴性。
525、625
流式细胞术简介及应用进展课件
流式细胞术简介及应用进展
15
▪高速度：分析细胞数：1000个/s→60000个/s ▪高灵敏度：荧光分子数/细胞：3000→100个FITC； ▪高准确度：区分两个细胞：参数：相差5% →1%； ▪高精度：CV值：7% →< 1%; ▪多参数：荧光：1个 →12个参数； ▪高纯度：分选细胞：80-90% →99.9%; ▪其 它：荧光信号：线性检测→对数检测
电子程序化单细胞分选仪——Electronically programmable individual cell sorter, EPICS (Coulter公司）
流式细胞术简介及应用进展
5
BD FACSCalibur型 FCM （单L，3F）
流式细胞术简介及应用进展
6
Coulter EPICS XL/XL-MCL （单L，4F）
流式细胞术简介及应用进展
11
BD FACSAria
BD FACSCount
CD3\4\8 专为HIV监测设计的经济普及型流式细胞仪
流式细胞术简介及应用进展
12
BD FACSCanto 2L 6C
流式细胞术简介及应用进展
13
BD FACS Calibur 1L 4C
流式细胞术简介及应用进展
14
三、流式细胞术应用的新进展
流式细胞术简介及应用进展
17
2、cytometric bead array (CBA)
微球流式芯片技术(CBA)是一种微球多参数检测分析技 术，它用一系列的微球组合来捕获并结合流式细胞术检 测溶液中被检测物质的量，其采用夹心法分析策略。用 已知的标准品和对照标准曲线就可得出被测样品的浓度。 这种检测方法，既不受样品量的限制，也可同时检测多 项指标参数；客观、省时、人为因素影响小。
流式细胞术分析及应用
Compensation
18
二、流式细胞术的应用
细胞表型分析 胞内蛋白的检测 细胞周期分析 细胞因子测定 分选 细胞内钙离子测量 ……
19
1.细胞表型分析
CD3 20
CD4
2.胞内蛋白的检测
21
22
3. 细胞周期的检测
23
CFSE（羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂）
Capture antibody Beads
Capture beads
+
+
Antigen (cytokines) Fluorescence Detector antibody
31
Beads Provide a Flexible Platform
Beads provide an expandable assay platform for use with a flow cytometer
Shades of a color
Antibody coupled PE label, emitting at FL2 intensity proportional to analyte conc.
33
Example 6-bead assay
IL-8 IL-1b
IL-6 IL-10 TNF
Detector Antibodies
3
现代流式细胞仪包括
液流系统
聚焦细胞以供检测
光学系统
激发和收集光信号
电子系统
将光信号转化为电信号，并使其数字化以供计 算机分析
4
液流系统
液流系统将样本悬液聚焦在光源的中心处
5
Sample Flow in Optical CuRate
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流式细胞术应用概述
主要内容
流式细胞术的一般介绍 流式细胞术在临床检测和科研中的应用
免疫学检测和科研应用
肿瘤学检测和科研应用
凋亡分析
血液学检测和科研应用 其它应用
第 一 部 分
流式细胞术的一般介绍
什么是流式细胞术？
流式细胞仪(Flow Cytometer): 是集合光电子物理，光电测量技术， 液流技术， 计算机技术等现代高科技技术为一体的细胞测量 和分析仪器。 流式细胞术(Flow Cytometry，FCM):
S G2/M
Debris Agg reg ates Apoptosis Dip G1 Dip G2 Dip S
Debris Agg reg ates Dip G1 Dip G2 Dip S An1 G1 An1 G2 An1 S
Diploid: 64.50 % Dip G1: 92.45 % at 49.24 Dip G2: 2.30 % at 98.48 Dip S: 5.26 % G2/G1: 2.00 %CV: 3.21 Aneuploid 1: 35.50 % An1 G1: 97.69 % at 58.53 An1 G2: 0.00 % at 123.89 An1 S: 2.31 % G2/G1: 2.12 %CV: 3.14 DI: 1.19
2、肿瘤相关基因编码蛋白检测
P53 乳腺癌
与病理学分级有关, 并与乳腺癌的淋巴结转移显著相关
胃 癌 与预后相关 大肠肿瘤
早期发现大肠癌
肝细胞癌 与组织分级, 肿瘤预后, 转移及肿瘤大小密切相关
Bcl-2 Bcl-2在正常组织中的表达
造血系统细胞 — 淋巴, 单核细胞等 受激素或生长因子调节的腺上皮 — 前列腺上皮, 子宫内膜等 干细胞或增值细胞 — 皮肤的基底细胞, 肠上皮 寿命长的分裂细胞 — 神经元 胚胎组织
淋巴细胞亚群检测意义 鉴别活动期和非活动期SLE
Control （n=20) Active SLE (n=17) CD3 70.4± 5.87 65.8± 10.9 Stable SLE
(n=13)
68.5± 8.95
CD4
CD8 CD4/CD8 NK
35.0± 5.70
27.9± 5.73 1.27± 0.14 17.8± 5. 48
淋巴细胞亚群检测： T cells, T subsets, NK cells, B cells
T淋巴细胞
淋巴细胞亚群及功能
T淋巴细胞(CD3+) CD3+CD4+ CD3+CD4+CD29+ CD3+CD4+CD29CD3+CD8+ CD3+CD8+CD28CD3+CD4+CD29CD3+CD4+CD8+ CD3+CD4-CD8CD4+/CD8+比值 CD45RA+CD45RO幼稚的/静止的T淋巴细胞 当免疫系统没有能力更新辅助性或抑 制性/细胞毒性淋巴细胞的祖细胞时此 细胞亚群较低 病菌感染时升高 , 但在慢性病毒感染 , 如HIV患者中降低 感染时升高 具有免疫抑制作用 名 称 辅助性/诱导性T细胞(Th/Ti) 辅助性T细胞(Th) 诱导性T细胞(Ti) 抑制性/杀伤性T细胞(Ts/Tc) 抑制性T细胞(Ts) 杀伤性T细胞(Tc) 活化的T细胞 表达 / T细胞受体(TCR / ) 功 能 辅助和诱导细胞免疫和体液免疫 辅助细胞免疫和体液免疫 诱导细胞免疫和体液免疫 抑制免疫反应/杀伤异源细胞 抑制细胞和体液免疫 细胞毒性T细胞 在T细胞恶性增生时升高
卵巢癌，乳腺癌，结肠癌，子宫内膜癌，原发部位不明的癌症 --早期 (I/II期)
DNA倍体和DNA指数--预后长期和无病生存期[2]
卵巢癌--晚期
1. Ross JS. DNA Ploidy and Cell Cycle Analysis in Pathology. New York: Igaku-Shoin;1996:47-60 2. The Recommend Medicare National Coverage Policy for Flow Cytometry. HCFA Website,1999
Bcl-2在肿瘤组织中的表达
肾脏肿瘤 — 肾癌, 肾盂乳头瘤, Wilms瘤, 肾嗜酸细胞瘤 前列腺癌 B细胞性淋巴瘤 乳腺癌 (43%) 甲状腺癌
nm23
nm23与多种肿瘤的转移及预后相关
肝细胞癌 甲状腺肿瘤 乳腺癌 结肠癌 肉瘤
CD44(CD44s/CD44v)
人 体 肿 瘤 肺癌 胃肠道癌
G0/G1期DNA含量为 2C
S期细胞,DNA含量开始增加,>2C
细胞经荧光染料(碘化丙啶，PI)染色，用流式细胞仪测定细胞 DNA含量，可得到细胞周期三个时相(G0/G1、S和G2/M期)的DNA 含量（％），可以反映细胞的增殖状态和非二倍体（异倍体）的 DNA含量
G0/G1
Diploid: 100.00 % Dip G1: 54.38 % at 46.90 Dip G2: 15.91 % at 91.61 Dip S: 29.71 % G2/G1: 1.95 %CV: 5.23
是应用流式细胞仪，对处于快速流动液体中的细
胞或生物颗粒进行多参数、快速测量和定量分析，
以及分选的技术。
流式细胞仪特点
多参数测量和分析（散射光和荧光）； 快速测量和分析 每秒可达1000-10000个细胞 分选纯度可达99%以上。 获取的数据分析结果更具有统计学意义； 通常测量的对象如各种细胞细胞必须处在单个细胞悬液 中。此外，也可测量微生物等生物颗粒，或者工合成微 球非生物颗粒
疾病治疗监测
二、流式细胞术在肿瘤学中的应用
肿瘤发生发展
1、DNA倍体和细胞周期分析
G2/M期细 胞,DNA含量开 始增加至4C
细胞周期和DNA倍体分析的原理
1、正常细胞DNA含量稳定在2C水平 2、性细胞DNA含量为1C 3、处于增殖期至分裂期细胞由 2C增加至4C 4、凋亡细胞DNA断裂,含量<2C
引起迟发型过敏反应、巨噬细胞活化、局部炎症
刺激来源：病毒、某些细菌
Th2型介导体液免疫反应
引起B细胞增殖、分泌多克隆免疫球蛋白、
促进I型变态反应（过敏反应） 刺激来源：多细胞寄生虫、过敏原
Th1/Th2细胞
PMA+Ionomycin 刺激4-6hr
流式细胞术检测胞内细胞因子
－自身免疫性疾病
Th1细胞及其细胞因子 －常为炎性增强的标志
Th2细胞及其细胞因子 －免疫耐受/抑制有关
Th2细胞及其细胞因子⇑ －肿瘤发病，
－肿瘤免疫
Th1/Th2细胞检测意义 发病机制研究 疾病治疗
使用Th1和Th2相关的细胞因子
IFN-治疗麻疯病
用抗Th1和Th2相关细胞因子或其受体的抗体 抗IL-4抗体治疗真菌和寄生虫感染 使用调节Th2/Th2细胞因子平衡的药物: 萨力多胺(Thaliodomide) 治疗巨细胞动脉炎
CD45RA-CD45RO+ CD45RA+CD45RO+ CD4+CD25+CD127/FoxP3+
记忆性T淋巴细胞 活化的T细胞, 感染时升高 调节性T细胞（Treg)
CD4+CD25+CD127-Treg检测
淋巴细胞亚群及功能
活化T淋巴细胞 CD3+HLA-DR+ 名 活化T细胞 称 功 能
淋巴细胞亚群与疾病
疾 病 CD3 CD4 CD8 CD4/CD8 NK
自身免疫性疾病 系统性红斑狼疮 类风湿性关节炎 自身免疫性溶血性贫血 重症肌无力 免疫缺陷病 爱滋病 病毒感染 传染性单核细胞增多症
慢性活动性肝炎 活动性肝硬化
肿瘤 消化道癌, 肝癌, 肺癌 再生障碍性贫血 粒细胞减少症
淋巴细胞亚群检测意义 疾病机理研究 疾病辅助诊断
CD4+HLA-DR+
CD8+HLA-DR+ CD4+CD25+ CD8+ CD25+ CD8+CD38+HLA-DR+ B淋巴细胞(19+) CD19+CD23+ CD19+CD5+ CD19+CD5+CD23+ NK细胞 CD3+CD(16+56)+ CD3+CD57+
活化的辅助性/诱导性T细胞
可检测标本
新鲜的血液、骨髓、体液、灌洗液、手 术活检、细针穿刺物等。 冰冻或固定（酒精或甲醛）保存的组织 常规固定/包埋用于组织检查的样本（蜡 块）。 通常最好的结果来自新鲜或冰冻的标本。 蜡块包埋的标本需进行特殊处理
意义
70%人类癌症中存在着异倍体或细胞周期的改变 DNA倍体和S期比例--指导治疗[2]
22.1± 15**
45.7± 9.58** 0.43± 0.12** 4.37± 3.31**
34.5± 4.23
32.7± 9.01 1.05± 0.26* 7.59± 5.01**
2、胞内分子流式细胞术检测 （以Th1/Th2细胞因子检测为例）
Th1/Th2细胞
Th1/Th2细胞
Th1型细胞因子介导 细胞免疫反应
活化的抑制性/杀伤性T细胞 活化的辅助性/诱导性T细胞 活化的抑制性/杀伤性T细胞 在病毒感染的患者中增加; 其增加 意味着HIV患者的预后较差
活化的B细胞
过敏患者中升高 在自身免疫性疾病中升高 慢性 B 细胞白血病及单克隆 B 淋巴 细胞 自身免疫性疾病时降低, 而病毒感 染时升高 CMV(巨细胞病毒)感染的强烈征兆