流式细胞术及其应用生化经典
流式细胞术——原理,操作及应用(一)
流式细胞术——原理,操作及应用(一)流式细胞术——原理,操作及应用1. 原理•流式细胞术（Flow Cytometry）是一种用于分析和计数悬浮在溶液中的个体细胞的技术。
•通过利用激光器激发细胞或微粒上荧光探针或吸光染料产生的荧光信号或散射光信号进行检测和分析。
2. 操作步骤样本制备•通过细胞培养、组织消化等方法获得需要检测的细胞样品。
•样本可能需要进行染色或标记以便于特定细胞或分子的检测。
流式细胞仪设置•调整激光器和探测器以适应所用标记物的激发和发射波长。
•设置仪器参数，如流速、放大倍数等。
数据采集和分析•将样本注入流式细胞仪，使其以单个细胞的方式流过激光束。
•通过荧光或散射光信号来检测和记录每个细胞的特征。
•利用专业软件对采集到的数据进行分析和解读。
3. 应用免疫表型分析•流式细胞术可以用于检测和分析细胞表面标记物的表达情况。
•可以用于分离和鉴定各种免疫细胞亚群，如T细胞、B细胞和NK 细胞等。
细胞周期分析•通过染色剂标记DNA，流式细胞术可以区分细胞的不同周期阶段。
•可以用于评估细胞增殖能力和细胞周期的营养、药物等因素影响。
细胞凋亡检测•利用荧光探针标记凋亡标记物，流式细胞术可以检测和计数凋亡细胞比例。
•可以用于评估药物对细胞凋亡的影响以及疾病状态的分析。
粒子分析•可以用于分析和鉴定不同大小、不同形状的微粒，如细胞、细胞器、胞外囊泡等。
•可以用于研究细胞的分泌和吞噬过程等。
其他应用•流式细胞术还可用于检测和分析细胞内钙离子浓度、细胞内蛋白、RNA和DNA含量等。
•可以应用于疾病诊断、药物筛选、生命科学研究等领域。
以上是流式细胞术的原理、操作步骤及一些常见应用的介绍。
流式细胞术的广泛应用使其成为现代生命科学研究和临床实践中必不可少的技术之一。
流式细胞术原理及应用
流式细胞术原理及应用
流式细胞术是通过一种名为流式细胞仪的仪器完成的，它能够以非常
高的精确度进行分析和检测。
流式细胞仪通过一根轴，从这个轴上有三根
弹性管，细胞进行注射，从而使细胞在管中行进，细胞同时也受到外界信
号的影响，这种信号可以来自磁场、电场或光场。
当细胞运行到仪器的另
一端时，它们会被照亮，通过一台摄像机可以拍摄到高清晰度的照片，然
后在计算机上进行分析处理。
流式细胞术广泛应用于早筛检、医学诊断、药物发现、药理学实验和
抗生素耐药性研究等方面，它能够更加精确、快速地进行细胞分析。
此外，流式细胞术也可以用于分析抗原抗体，免疫细胞介导的反应，以及细胞因
子如细胞因子和表面受体等的表达情况。
这种技术还可以用来监测血液中细胞水平的变化，如血小板、红细胞、白细胞等。
简述流式细胞术的原理与应用
简述流式细胞术的原理与应用一、流式细胞术的原理介绍流式细胞术（Flow cytometry）是一种利用流式细胞术仪（Flow cytometer）对单个活细胞进行多参数分析的技术。
它基于细胞的光学性质和生物化学特性，通过探针标记、荧光染料和细胞表面抗原的相互作用，对细胞进行高速连续检测和分离。
流式细胞术的原理如下：1.细胞悬浮和样本处理：将细胞样品作为悬浮液，通过离心等方法将细胞分散在液体中，去除细胞的团块和碎片，保证单个细胞的流式检测。
2.细胞标记：采用流式细胞术特定的探针和染料对细胞进行标记，以便后续检测和分析。
常用的标记方法包括荧光染料标记、抗体标记和细胞分子探针标记。
3.细胞分离和传送：将标记的细胞悬浮液通过流式细胞术仪，以流速每秒数千个细胞的速度单个分子传送到探测点。
4.光散射与荧光探测：细胞经过流式细胞术仪后，以激光束照射细胞，通过散射光和荧光信号的检测，对细胞进行空间分布和化学信息的获得。
5.数据采集与分析：通过计算机系统采集和记录细胞经过流式细胞术仪后所产生的光散射和荧光信号，在分析软件中对数据进行处理和解读，获得有关细胞的信息。
二、流式细胞术的应用流式细胞术是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的技术，它在细胞学、免疫学、血液学、肿瘤学等领域有着重要的应用价值。
下面列举几个流式细胞术的应用示例：1.血液学研究：流式细胞术结合细胞表面标记和荧光染料标记，可以对血液中的不同细胞类型进行快速的鉴定和数量分析。
例如，通过流式细胞术可对血液中的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞等进行分类和计数，从而判断患者的免疫状态和疾病进展。
2.癌症诊断与治疗：流式细胞术对肿瘤细胞的检测和分析有着重要的作用。
通过流式细胞术，可以检测和定量肿瘤细胞的表面抗原和细胞内信号分子，进一步了解肿瘤细胞的类型、分化程度和增殖状态，为癌症的诊断和治疗提供指导。
3.免疫学研究：流式细胞术能够对免疫系统中的各种细胞类型进行鉴定、计数和功能分析。
流式细胞术简介及应用进展课件
流式细胞术简介及应用进展
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▪高速度：分析细胞数：1000个/s→60000个/s ▪高灵敏度：荧光分子数/细胞：3000→100个FITC； ▪高准确度：区分两个细胞：参数：相差5% →1%； ▪高精度：CV值：7% →< 1%; ▪多参数：荧光：1个 →12个参数； ▪高纯度：分选细胞：80-90% →99.9%; ▪其 它：荧光信号：线性检测→对数检测
电子程序化单细胞分选仪——Electronically programmable individual cell sorter, EPICS (Coulter公司）
流式细胞术简介及应用进展
5
BD FACSCalibur型 FCM （单L，3F）
流式细胞术简介及应用进展
6
Coulter EPICS XL/XL-MCL （单L，4F）
流式细胞术简介及应用进展
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BD FACSAria
BD FACSCount
CD3\4\8 专为HIV监测设计的经济普及型流式细胞仪
流式细胞术简介及应用进展
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BD FACSCanto 2L 6C
流式细胞术简介及应用进展
13
BD FACS Calibur 1L 4C
流式细胞术简介及应用进展
14
三、流式细胞术应用的新进展
流式细胞术简介及应用进展
17
2、cytometric bead array (CBA)
微球流式芯片技术(CBA)是一种微球多参数检测分析技 术，它用一系列的微球组合来捕获并结合流式细胞术检 测溶液中被检测物质的量，其采用夹心法分析策略。用 已知的标准品和对照标准曲线就可得出被测样品的浓度。 这种检测方法，既不受样品量的限制，也可同时检测多 项指标参数；客观、省时、人为因素影响小。
流式细胞术分析及应用
Compensation
18
二、流式细胞术的应用
细胞表型分析 胞内蛋白的检测 细胞周期分析 细胞因子测定 分选 细胞内钙离子测量 ……
19
1.细胞表型分析
CD3 20
CD4
2.胞内蛋白的检测
21
22
3. 细胞周期的检测
23
CFSE（羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂）
Capture antibody Beads
Capture beads
+
+
Antigen (cytokines) Fluorescence Detector antibody
31
Beads Provide a Flexible Platform
Beads provide an expandable assay platform for use with a flow cytometer
Shades of a color
Antibody coupled PE label, emitting at FL2 intensity proportional to analyte conc.
33
Example 6-bead assay
IL-8 IL-1b
IL-6 IL-10 TNF
Detector Antibodies
3
现代流式细胞仪包括
液流系统
聚焦细胞以供检测
光学系统
激发和收集光信号
电子系统
将光信号转化为电信号，并使其数字化以供计 算机分析
4
液流系统
液流系统将样本悬液聚焦在光源的中心处
5
Sample Flow in Optical CuRate
流式细胞术的原理和应用
流式细胞术的原理和应用流式细胞术（Flow cytometry）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的生物技术，它通过将单个细胞悬浮在溶液中，利用激光器照射并检测细胞表面或内部的荧光标记物，实现对细胞的定量和质量分析。
流式细胞术具有高通量、高准确性和高灵敏度的特点，被广泛应用于细胞表型分析、细胞分选、DNA含量测定、蛋白质定量、染色体分析、细胞凋亡测定等领域。
本文将对流式细胞术的原理和应用进行详细介绍。
一、流式细胞术的原理1. 细胞悬浮流式细胞术的第一步是将待检测的细胞悬浮在生理盐水或缓冲液中，以确保细胞处在单个状态，方便后续的激光检测。
2. 细胞标记细胞通常会被标记上与特定蛋白或分子结合的荧光标记物，通过特异性和高亲和力结合到细胞表面或内部的特定结构上。
这些标记物可以是荧光染料、荧光免疫球蛋白（Fluorescent-labeled antibodies）等。
3. 激光照射悬浮细胞通过流式细胞仪中的微流道单个流经，在通过激光照射后，激光与标记物产生光散射或荧光发射。
4. 光散射和荧光检测流式细胞仪通过多个检测器检测光散射和荧光发射强度，这些数据被传输到计算机中进行分析和图形呈现。
5. 数据分析通过计算机软件对检测到的数据进行图形处理和数据分析，包括各种细胞表型的区分、细胞计数、蛋白质表达水平、细胞周期分析等。
二、流式细胞术的应用1. 细胞表型分析流式细胞术可以用来分析细胞的表面标记物和内部标记物，比如CD标记、HLA标记、细胞凋亡标记等，帮助研究者深入了解细胞的功能和特性。
2. 细胞分选基于细胞表面标记物的差异，流式细胞术结合细胞分选仪可以实现对不同亚群细胞的快速纯化和分离，广泛应用于免疫学、干细胞研究等领域。
3. DNA含量测定通过DNA特异性荧光染料，流式细胞术可以对细胞的DNA含量进行测定，帮助研究细胞周期的变化、细胞增殖速率的测定等。
4. 蛋白质定量利用荧光标记的免疫球蛋白，流式细胞术可以对细胞中蛋白质的表达水平进行定量分析，比如研究细胞信号通路的活性等。
流式细胞术的原理和应用
流式细胞术的原理和应用流式细胞术是一种广泛应用于生物医学领域的先进技术，它通过对细胞的特定特征进行高效、快速的检测和分析，为科学研究和临床诊断提供了强大的工具。
流式细胞术的原理和应用涉及到许多方面，包括仪器原理、标记技术、数据分析等，下面将对这些内容进行详细阐述。
一、流式细胞术的原理流式细胞术的原理基于细胞在流动液体中依次通过激光束后的单个检测区域，通过检测细胞在不同参数下的散射或荧光信号来获取关于细胞数量、大小、形态、表面标记物等信息。
流式细胞术通常包括以下步骤：1. 样本制备：将样本中的细胞进行适当的处理，如酶消化、离心、过滤等，以获得单细胞悬浮液。
2. 细胞标记：利用标记物（如荧光染料、抗体等）对待测细胞进行特异性标记，以便在流式细胞仪中对其进行检测和分析。
3. 流式细胞仪检测：将标记后的细胞悬浮液通过流式细胞仪，激光束依次照射每个细胞，并通过检测散射光和荧光信号来获得相关信息。
4. 数据分析：通过专门的流式细胞数据分析软件对获得的数据进行处理和分析，获取细胞的数量、特征等信息。
二、流式细胞术的应用1. 免疫学研究：在免疫学领域，流式细胞术可用于分析免疫细胞的类型、数量和功能，如淋巴细胞亚群的鉴定、T细胞的活化状态等，为免疫学研究提供了重要的数据支持。
2. 癌症诊断和治疗：流式细胞术可用于检测肿瘤细胞的类型和数量，分析肿瘤细胞的表面标记物，评估肿瘤的侵袭性和预后，指导临床治疗方案的选择和疗效监测。
3. 干细胞研究：流式细胞术可用于干细胞的鉴定和分离，分析干细胞的表面标记物和多能性，为干细胞研究和应用提供重要的技术支持。
4. 病原微生物检测：流式细胞术可用于检测微生物感染，分析微生物的数量、类型和毒力，评估感染的严重程度和治疗效果。
5. 血液分析：流式细胞术可用于分析血液中各类细胞的数量和功能，如白细胞亚群的鉴定、血小板的活化状态等，为临床诊断和治疗提供重要信息。
流式细胞术作为一种高效、敏感的细胞分析技术，在生物医学领域有着广泛的应用前景。
流式细胞术的应用(高艳红)
细增殖周期测定和DNA倍体分析
1）细胞增殖周期：分为G0、G1、S、G2、M期。FCM分析一个群体 细胞峰DNA倍体与细胞周期时，将DNA含量直方图分为三部分，即 G0/G1,S,G2/M期三个细胞峰。G0/G1和G2/M细胞峰DNA的含量成正 态分布，S期细胞峰则是一个加宽的正态分布。 2）利用DNA的荧光染料，如PI（Propidium iodide碘化丙啶）， 与细胞内的DNA结合，可反映细胞内DNA含量。采用DNA直方图显示。 具有2C DNA含量细胞为G0/G1期细胞，4C DNA含量细胞为G2/M期 细胞，DNA含量介于两者之间的细胞为S期细胞。 3）DNA倍体：主要比较G0/G1期细胞DNA含量的变化。用DNA指数 （DI）表示。 DNA指数=测量样本G0/G1期DNA含量/正常人淋巴细胞G0/G1期DNA含量 以正常人淋巴细胞作为对照。 正常细胞DNA指数为1.00，DNA指数＞1，为超2倍体，＜1为亚2倍体， 两者可统称为非整倍体。非整倍体细胞中肿瘤的特异性标志，实 体肿瘤中出现频率较高。
凋亡检测
1）FCM-DNA检测（DNA亚G1峰的检测）：利用PI染色，检测具 有亚G1期DNA含量的细胞比例，代表凋亡细胞数。其原理为在凋
亡过程中，细胞内核酸酶的释放，将DNA降解，分解成小的片段， 在标本制备中的固定处理时，细胞膜的完整性被破坏，使细胞内 降解的DNA片段从细胞内流出，造成总体DNA含量减少，成为 亚2倍体。 注：检测的凋亡细胞数代表晚期的凋亡细胞比例，且易受标本中的 死细胞和碎片的干扰，影响结果的准确性。
●
● ● ● ● ●
免疫治疗监测
肿瘤免疫监测 移植免疫监测
HLA-B27检测的临床意义
强直性脊柱炎 Reiter’s综合症 银屑病性关节炎 阳性率 90%以上 70-90% 50-60%
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圈门去除粘连体， 分析细胞周期
细胞凋亡分析
Annexin V-PE/7-AAD双染色法
双阴：活细胞
Annexin V-PE单阳：早期凋亡细胞
双阳：晚期凋亡细胞 7-AADd单阳：坏死细胞
人外周血淋巴细胞亚群检测
T淋巴细胞检测
淋巴细胞
T淋巴细胞
CD4+T（Th)淋巴细胞检测
488 nm laser
- Charged Plates
Single cells sorted into test tubes
FALS Sensor Fluorescence detector
+
信号检测--散色光
它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射 光，可以把不同类型的细胞群加以区分
FSC（小角散射)光它 反应细胞的相对大小 和截面积的大小
流式细胞仪特点
单细胞悬液 或生物颗粒 分析速度高
多参数
精度高
当代最先进的细 胞定量分析技术
FACSCalibur
特点：
➢光路调节系统固定
➢自动化程度高
➢操作简便
➢使用寿命长
➢配备1-2根激光
临床型（台式机）
➢细胞分选速度慢， 主要用于细胞分析
BD LSR
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点： ➢多数字化 ➢适用用各类细胞分选 ➢4路分选
FACSAria
科研型
特点： ➢分辨率高
➢选配多种波长和 类型激光器
➢可把感兴趣细胞 分选到特定培养孔 或板上（4路和24 孔板）
➢适用于高速分选 和多色分析
流式细胞仪检测范围
细胞大小
细 胞 结 构
细胞粒度
细胞表面面积
细
核浆比例
胞 功
DNA含量与细胞周期 能
特异性抗原 （细胞表面/胞浆/核） 细胞内细胞因子 细胞活性 酶活性
RNA含量 蛋白质含量
激素结合位点 细胞受体
临床研究
淋巴细胞亚群测定、血小板分析、网织红细胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、HLA-B27 分析、PNH诊断、人类同种异体器官移植中应用、细胞因子测定、AIDS诊断与治疗和疗 效评价、flow-FISH法测定端粒长度
基础研究
淋巴细胞功能、树突状细胞（DC）研究、造血干细胞研究、细胞周期分析、细胞凋亡分析、 凋亡相关蛋白分析、细胞功能研究、多药耐药基因研究（MDR）、肿瘤相关基因表达研究、 RNA测定、DNA测定、总蛋白测定、癌基因和抑癌基因表达产物测定、血管内皮细胞研究
流式细胞仪的工作原理
• 光学系统
激光光源 光收集系统
离心
两次
PBS漂 洗
37度消化1小时 过300目细胞筛
2.5μl 10μg/μl RNase A
50μl 0.1mg/ml PI （含1%Triton)，
混匀，室温 静止5分钟
0.5 PBS
悬浮细胞
上机
建立获取模式，获取数据
（PI单染分析细胞周期，同时看凋亡）
去甲斑蟊素对肝癌细胞周期的作用
数据分析
流式细胞术及其应用
第一部分 流式细胞术的一般介绍
概念
➢ 流式细胞术（Flow Cytometry，FCM） 利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单 细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特 定群体加以分选的现代细胞分析技术。
➢ 流式细胞仪（Flow Cytometer) 集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算 机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的 一种新型高科技仪器。
• 液流系统
流动室 液流驱动系统
• 电子系统
光电转换 数据处理系统
• 细胞分选系统
激光光源
➢ 单波长、高强度、高稳定性 ➢ 多采用氩离子激光器或氦氖激光器 ➢ 一般选配2-4根激光，488nm 、633nm和355nm、407nmUV激光 ➢ 最多检测13个荧光参数
光收集系统：滤光片
Longpass
两色以上荧 光分析存在 光谱交叉
530 580 630 680 730 780 Emission wavelength (nm)
荧光补偿方法
➢所有补偿调为 “0”
➢调节电压，用同 型对照或阴性对照， 使阴性群位于“左 下角”
➢依单阳群体调节 荧光补偿
抗体使用原则
➢ 根据仪器型号和抗原表达强弱合理选择荧光抗体 ➢ 低表达抗原标记高S/N（信噪比）荧光素，如PE、APC ➢ 使用双标以上抗体必做荧光补偿
淋巴细胞
R1
CD4+
CD8+Ts淋巴细胞检测
淋巴细胞
R1
CD8+
B淋巴细胞检测
B淋巴细胞
淋巴细胞
R1
淋巴细胞
R1
NK细胞检测
NK细胞
结束语
流式细胞术是一种应用范围极广、灵活性很强、 技术含量较高、具有众多开发潜能、富有挑战性 的技术，需要掌握很多交叉学科知识，我们的宗 旨是将这项高新技术灵活运用于临床、科研等领 域，报告最科学、最真实的客观数据，以服务于 全社会。
流式细胞术操作流程
样品 培养细胞 新鲜组织 石蜡包埋
单细胞 悬液
标记 荧光抗体
检测
表型测定
细胞分选
统计学 分析
继续 培养
第二部分 流式细胞术在不同领域的应用
细胞周期 分析
样品制备
1000rpm 5分钟 收集2X106个细胞
PBS漂洗 70%酒精 两次 4度固定过夜
1000rpm 5分钟收集固定的细胞
单参数直方图（Histogram）
二维等高图和密度图
Pseudo 3D Plot3D Plot二维点图Dot Plot
➢便于数据统计
➢不同的细胞群 可以用不同的颜 色标记
➢主要表达方式
光谱交叉
4 colors - simultaneous collection
FITC
PE PETR
PE-CY5
SSC (90度角散射光) 代表细胞的颗粒度和 精细结构的变化
全血细胞流式FSC-SSC图
信号检测--荧光信号
激发 激光
激发态
发射
能量损失 能量级
特异荧光 自发荧光特异荧光
数据显示类型
X轴：代表荧光信号或 散射光信号的强度，用 “通道数”表示，可以 与光强度之间线性关系 或对数关系 Y轴：代表该通道内所出 现具有相同光信号特征 性细胞的频率
460 500 540
Shortpass
460 500 540
Bandpass
460 500 540
LP 500
SP 500
BP500/50
光收集系统：光电倍增管（PMT）
FACSCalibur 光路图
液流系统：流动室、液流驱动系统
液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱
细胞分选系统
Fluorescence Activated Cell Sorting