流式细胞术及其应用教程
流式细胞术——原理,操作及应用(一)
流式细胞术——原理,操作及应用(一)流式细胞术——原理,操作及应用1. 原理•流式细胞术（Flow Cytometry）是一种用于分析和计数悬浮在溶液中的个体细胞的技术。
•通过利用激光器激发细胞或微粒上荧光探针或吸光染料产生的荧光信号或散射光信号进行检测和分析。
2. 操作步骤样本制备•通过细胞培养、组织消化等方法获得需要检测的细胞样品。
•样本可能需要进行染色或标记以便于特定细胞或分子的检测。
流式细胞仪设置•调整激光器和探测器以适应所用标记物的激发和发射波长。
•设置仪器参数，如流速、放大倍数等。
数据采集和分析•将样本注入流式细胞仪，使其以单个细胞的方式流过激光束。
•通过荧光或散射光信号来检测和记录每个细胞的特征。
•利用专业软件对采集到的数据进行分析和解读。
3. 应用免疫表型分析•流式细胞术可以用于检测和分析细胞表面标记物的表达情况。
•可以用于分离和鉴定各种免疫细胞亚群，如T细胞、B细胞和NK 细胞等。
细胞周期分析•通过染色剂标记DNA，流式细胞术可以区分细胞的不同周期阶段。
•可以用于评估细胞增殖能力和细胞周期的营养、药物等因素影响。
细胞凋亡检测•利用荧光探针标记凋亡标记物，流式细胞术可以检测和计数凋亡细胞比例。
•可以用于评估药物对细胞凋亡的影响以及疾病状态的分析。
粒子分析•可以用于分析和鉴定不同大小、不同形状的微粒，如细胞、细胞器、胞外囊泡等。
•可以用于研究细胞的分泌和吞噬过程等。
其他应用•流式细胞术还可用于检测和分析细胞内钙离子浓度、细胞内蛋白、RNA和DNA含量等。
•可以应用于疾病诊断、药物筛选、生命科学研究等领域。
以上是流式细胞术的原理、操作步骤及一些常见应用的介绍。
流式细胞术的广泛应用使其成为现代生命科学研究和临床实践中必不可少的技术之一。
流式细胞术之基本原理及运用
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1.3 流式细胞术光信号检测
光信号的类型 • 散射光信号：与标记荧光素无关，
是细胞的固有参数。 – 前向散射光(forward scatter, FSC); – 侧向散射光(side scatter, SSC).
• 荧光信号
– 自发荧光 ：微弱 – 特异荧光：标记的荧光素分子发出 的荧光，比自发荧光强很多倍。
FITC、Alexa Fluor 488 PE PI PE-Cy5、PerCP APC、AF647
FL3
FL4 640 FL10
• 多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素； 各个通道之间的荧光素可以随意搭配。
B 根据抗原表达强弱合理选择 抗体
• 不同的荧光素强度有所不同； • 高表达的抗原可用不太“亮” 的染料，更“亮”的荧光素分 配给表达低的抗原：
流式细胞仪的发展及商品化
• • • • • • • • 1934 Moldavanl: First try (固定式细胞分析-流动式)； 1953 Crosland-Taylor: 鞘流系统(解决难题)； 1956 Coulter原理(血细胞计数器)； 1965 Kamentsky: 分光光度计定量细胞成分和散射光应用； 1967 Kamentsky等设计了细胞分选的装置； 1969 Vandilla等: 第一台荧光检测细胞计(鞘流聚焦、激光)； 1972 斯坦福大学: 研制出荧光激活细胞分选仪(FACS)； 1973 BD公司与斯坦福大学合作，研制生产第一台商用流 式细胞仪-FACS Ⅰ。 • 1975 Kohler和Milstein: 单克隆抗体技术(促进流式发展)。
• 光路系统
– 激发光源 – 光束收集系统
• 电子系统
– 光电转换器 – 数据处理系统
流式细胞术简介及应用进展课件
流式细胞术简介及应用进展
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▪高速度：分析细胞数：1000个/s→60000个/s ▪高灵敏度：荧光分子数/细胞：3000→100个FITC； ▪高准确度：区分两个细胞：参数：相差5% →1%； ▪高精度：CV值：7% →< 1%; ▪多参数：荧光：1个 →12个参数； ▪高纯度：分选细胞：80-90% →99.9%; ▪其 它：荧光信号：线性检测→对数检测
电子程序化单细胞分选仪——Electronically programmable individual cell sorter, EPICS (Coulter公司）
流式细胞术简介及应用进展
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BD FACSCalibur型 FCM （单L，3F）
流式细胞术简介及应用进展
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Coulter EPICS XL/XL-MCL （单L，4F）
流式细胞术简介及应用进展
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BD FACSAria
BD FACSCount
CD3\4\8 专为HIV监测设计的经济普及型流式细胞仪
流式细胞术简介及应用进展
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BD FACSCanto 2L 6C
流式细胞术简介及应用进展
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BD FACS Calibur 1L 4C
流式细胞术简介及应用进展
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三、流式细胞术应用的新进展
流式细胞术简介及应用进展
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2、cytometric bead array (CBA)
微球流式芯片技术(CBA)是一种微球多参数检测分析技 术，它用一系列的微球组合来捕获并结合流式细胞术检 测溶液中被检测物质的量，其采用夹心法分析策略。用 已知的标准品和对照标准曲线就可得出被测样品的浓度。 这种检测方法，既不受样品量的限制，也可同时检测多 项指标参数；客观、省时、人为因素影响小。
流式细胞术分析及应用
Compensation
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二、流式细胞术的应用
细胞表型分析 胞内蛋白的检测 细胞周期分析 细胞因子测定 分选 细胞内钙离子测量 ……
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1.细胞表型分析
CD3 20
CD4
2.胞内蛋白的检测
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3. 细胞周期的检测
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CFSE（羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂）
Capture antibody Beads
Capture beads
+
+
Antigen (cytokines) Fluorescence Detector antibody
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Beads Provide a Flexible Platform
Beads provide an expandable assay platform for use with a flow cytometer
Shades of a color
Antibody coupled PE label, emitting at FL2 intensity proportional to analyte conc.
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Example 6-bead assay
IL-8 IL-1b
IL-6 IL-10 TNF
Detector Antibodies
3
现代流式细胞仪包括
液流系统
聚焦细胞以供检测
光学系统
激发和收集光信号
电子系统
将光信号转化为电信号，并使其数字化以供计 算机分析
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液流系统
液流系统将样本悬液聚焦在光源的中心处
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Sample Flow in Optical CuRate
流式细胞实验原理及应用
流式细胞实验原理及应用首先，样品准备是流式细胞实验的关键步骤之一、细胞需处于悬浮液中才能通过流式细胞仪。
样品准备包括细胞分离、洗涤和调整浓度等步骤。
通常，细胞样品从组织或培养物中分离，离心沉淀后经过洗涤去除细胞培养液中的残留物，最后将细胞悬浮于缓冲液中。
其次，细胞标记是流式细胞实验的核心步骤之一、在流式细胞实验中，细胞表面或内部的特定分子可以通过适当的标记物进行标记，以便在流式细胞仪中进行检测。
常用的细胞标记方法包括荧光染色、酶联免疫吸附试验（ELISA）和利用特定的抗体与细胞表面受体结合等。
通过流式细胞实验，我们可以通过标记特定分子表达来研究细胞的功能、状态和变化。
最后，细胞检测是流式细胞实验的最后一步。
通过流式细胞仪，可以对标记的细胞进行检测和分析。
流式细胞仪通过激光束照射样品中的细胞，测量细胞发射的荧光信号和散射光等物理性质，从而获得与细胞特性有关的数据。
这些数据可以用于定量和定性分析，例如分析细胞表面标记物的表达水平、颗粒物的大小和形状等。
流式细胞实验在生命科学研究中有着广泛的应用。
它可以用于研究细胞的免疫表型，例如探究免疫细胞亚型的分布和功能状态。
同时，流式细胞实验还可用于分析细胞凋亡、细胞周期、细胞增殖和细胞分化等生理过程。
此外，流式细胞实验还可应用于肿瘤学研究和临床诊断，如肿瘤细胞表面标记物的检测和癌症患者的免疫监测等。
总之，流式细胞实验是一种快速、准确的细胞检测和分析技术。
它通过针对特定分子的标记和仪器的测量，实现对单个细胞的定量和定性分析。
由于其高通量、高灵敏度和高特异性的特点，流式细胞实验被广泛应用于细胞学、免疫学、遗传学等领域，并为相关研究提供了有力的工具和方法。
微生物检测技术中的流式细胞术的应用教程
微生物检测技术中的流式细胞术的应用教程流式细胞术是一种广泛应用于微生物检测技术的高效、准确的方法。
它利用流式细胞仪对微生物细胞进行快速而准确的检测和分析，为微生物学研究、病原体诊断和环境监测等领域提供了重要的工具。
本文将为读者介绍流式细胞术的基本原理、实验步骤和常见应用。
流式细胞术的基本原理是利用流式细胞仪的光学系统将待测样品中的微生物细胞逐个通过一个狭窄的流道，并通过激光束照射细胞，然后测量经过细胞的散射和荧光信号。
利用这些信号，流式细胞仪可以快速确定微生物细胞的数量、大小、形态以及特定标记物的表达情况，从而对样品进行定性和定量分析。
在进行流式细胞术前，首先需要准备样品。
样品可以是来自培养基中生长的微生物细胞、环境样品（如水、土壤）中的微生物细胞，或者是体内组织、血液等样品中的微生物细胞。
样品通常需要进行处理，如细胞固定、细胞染色或荧光标记等，以便流式细胞仪可以准确识别和测量细胞。
接下来是样品的处理和染色步骤。
在流式细胞术中，常用的样品处理方法包括离心、过滤等，以获得单个细胞的悬浮液。
然后，可以通过荧光染色或标记物标记细胞，以便流式细胞仪可以进行荧光检测。
染色既可以针对整个样品中的细胞，也可以特异性染色，以检测感兴趣的微生物细胞。
样品处理和荧光染色完成后，就可以开始使用流式细胞仪进行细胞检测和分析了。
将样品注入流式细胞仪的进样室中，仪器会将细胞逐个引入流道，并通过激光照射细胞。
细胞与激光相互作用后，产生的信号会被流式细胞仪捕捉和测量。
流式细胞术常用的参数有三个：前向散射光（forward scatter, FSC）、侧向散射光（side scatter, SSC）和荧光信号。
前向散射光与细胞的大小和形态相关，侧向散射光与细胞的复杂度和颗粒含量相关，而荧光信号则与标记物的特异性结合情况相关。
通过测量和分析这些参数，可以获得关于细胞数量、大小、形态和特定标记物表达的信息。
除了基本的细胞检测和分析，流式细胞术还可以进行更加复杂的功能性分析和分选操作。
流式细胞术的原理和应用
流式细胞术的原理和应用流式细胞术（Flow cytometry）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的生物技术，它通过将单个细胞悬浮在溶液中，利用激光器照射并检测细胞表面或内部的荧光标记物，实现对细胞的定量和质量分析。
流式细胞术具有高通量、高准确性和高灵敏度的特点，被广泛应用于细胞表型分析、细胞分选、DNA含量测定、蛋白质定量、染色体分析、细胞凋亡测定等领域。
本文将对流式细胞术的原理和应用进行详细介绍。
一、流式细胞术的原理1. 细胞悬浮流式细胞术的第一步是将待检测的细胞悬浮在生理盐水或缓冲液中，以确保细胞处在单个状态，方便后续的激光检测。
2. 细胞标记细胞通常会被标记上与特定蛋白或分子结合的荧光标记物，通过特异性和高亲和力结合到细胞表面或内部的特定结构上。
这些标记物可以是荧光染料、荧光免疫球蛋白（Fluorescent-labeled antibodies）等。
3. 激光照射悬浮细胞通过流式细胞仪中的微流道单个流经，在通过激光照射后，激光与标记物产生光散射或荧光发射。
4. 光散射和荧光检测流式细胞仪通过多个检测器检测光散射和荧光发射强度，这些数据被传输到计算机中进行分析和图形呈现。
5. 数据分析通过计算机软件对检测到的数据进行图形处理和数据分析，包括各种细胞表型的区分、细胞计数、蛋白质表达水平、细胞周期分析等。
二、流式细胞术的应用1. 细胞表型分析流式细胞术可以用来分析细胞的表面标记物和内部标记物，比如CD标记、HLA标记、细胞凋亡标记等，帮助研究者深入了解细胞的功能和特性。
2. 细胞分选基于细胞表面标记物的差异，流式细胞术结合细胞分选仪可以实现对不同亚群细胞的快速纯化和分离，广泛应用于免疫学、干细胞研究等领域。
3. DNA含量测定通过DNA特异性荧光染料，流式细胞术可以对细胞的DNA含量进行测定，帮助研究细胞周期的变化、细胞增殖速率的测定等。
4. 蛋白质定量利用荧光标记的免疫球蛋白，流式细胞术可以对细胞中蛋白质的表达水平进行定量分析，比如研究细胞信号通路的活性等。
流式细胞术的原理及应用
流式细胞术的原理及应用前言流式细胞术（Flow Cytometry）是一项基于光学技术的分析和分类细胞及其组分的方法。
通过将细胞悬浮液通过流式细胞仪，实现细胞的快速高通量检测和分析。
流式细胞术在生命科学研究、临床诊断、药物研发等领域得到广泛应用。
本文将介绍流式细胞术的基本原理及其主要应用。
1. 原理1.1 细胞悬浮液的注射流式细胞术的第一步是将待检测的细胞悬浮液注入流式细胞仪。
悬浮液中的细胞会依次通过一个细胞注射口，形成细胞流。
1.2 通过激光激发荧光信号流式细胞仪利用激光束激发细胞或标记物的荧光信号。
细胞通常被染色或标记以便准确识别和分析细胞特定的特征。
1.3 接收荧光信号经过激发后，流式细胞仪会收集荧光信号，并通过各种光学和电子元件将其转化为电信号。
1.4 数据分析与可视化流式细胞仪将收集到的数据传输到计算机进行分析和可视化。
根据不同的荧光信号特性，可以得到细胞的表型、数量、活性等信息。
2. 应用流式细胞术在许多领域有着广泛的应用，在以下几个方面得到了突出的成果和应用：2.1 免疫学流式细胞术在免疫学研究中发挥着重要的作用。
通过流式细胞术，可以对免疫细胞进行表型和功能分析，了解免疫细胞的分布、表达特征、活性等信息，为研究免疫系统的机制提供了强有力的工具。
2.2 癌症研究流式细胞术在癌症研究中广泛应用。
通过流式细胞术，可以对癌细胞进行检测、鉴定和分析，了解癌细胞的异质性、增殖速率、转移能力等特征，为癌症的诊断和治疗提供重要信息。
2.3 微生物学研究流式细胞术在微生物学研究中起到关键作用。
通过流式细胞术，可以快速准确地对微生物进行定量分析和分型鉴定，如对细菌、真菌、病毒的检测和鉴别。
2.4 细胞工程与干细胞研究流式细胞术在细胞工程领域和干细胞研究中有着广泛的应用。
可以通过流式细胞术对干细胞进行分选、分析和富集，并对细胞工程的效果进行评估和监测。
2.5 遗传学研究流式细胞术在遗传学研究中也发挥着重要作用。
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流式细胞术及其应用教程
The course of flow cytometry and its application
课程简介
该课程包括理论和实习两部分，理论课程重点介绍与流式细胞术密切相关的基本原理、结构及其在临床和科研工作中的应用。
内容包括流式细胞术的基本原理、流式细胞仪数据的采集和分析、血细胞分化发育过程、流式细胞术在免疫学、血液学、肿瘤学及科研工作中的应用。
通过理论授课使研究生能够掌握上述领域的基本理论和最新研究进展，达到提高研究生流式细胞术应用水平、拓展研究生思路、开阔眼界，为培养复合型人才打下基础。
实习内容包括标本制备、仪器的调节与质控、淋巴细胞亚群分析、HLA-B27检测、胞膜、内抗原检测、红细胞CD55、CD59检测、血小板膜糖蛋白分析、DNA倍体分析及细胞因子检测。
通过实习使研究生进一步熟悉流式细胞仪的使用程序，操作规程，为今后的工作、学习提高帮助。
This course includes in lecture teaching and practice lesson. The lecture teaching will be focused on flow cytometric basic theory, structure, data collection and analysis, application in clinic and research. The practice lesson will be focused on sample preparation, instrument setting, analysis of lymphocytes, HLA-B27，extracellular antigen and intracellular antigen, analysis of CD55,CD59, DNA ploidy analysis and cytokine detection.
教学大纲
一、课程名称：流式细胞术及其应用教程
二、总学时数：38学时，2学分
理论课18学时
实验课20学时
三、授课对象：
博士生、硕士生，专业不限
四、教学目的与要求：
掌握流式细胞术基本原理、工作程序、临床及科研工作中的用途，了解相应领域的最新进展，为临床和科研工作奠定基础。
五、理论课内容：
第一章流式细胞术工作原理（3学时）
第一节流式细胞术发展简史
要求：了解流式细胞术的基本概念、发展简史、流式细胞仪的基本结构、工作原理。
第二节流式细胞仪的基本结构、工作原理
要求：了解流式细胞仪的基本结构、工作原理
第三节流式细胞仪的数据分析
要求：了解并熟悉CellQuest分析软件主界面、流式细胞仪数据采集与储存，掌握流式细胞仪数据分析方法。
1．设门技术
2．散射光信号及荧光信号
3．直方图
4．双参数散点图
第二章淋巴细胞的分化发育过程（6学时）
第一节淋巴细胞的分化发育过程
要求：了解T/NK淋巴细胞、B淋巴细胞发育过程，熟悉各阶段淋巴细胞的抗原表达情况。
第二节髓细胞的分化发育过程及白细胞分化抗原
要求：了解髓细胞的分化发育过程，熟悉各阶段髓细胞的抗原表达情况，了解白细胞分化抗原的组成及应用。
第三章流式细胞术的临床应用（6学时）
第一节血液淋巴细胞免疫表型分析及其应用
要求：了解淋巴细胞亚群数量及免疫表型变化的意义，掌握CD4＋细胞计数在艾滋病诊断与治疗中的价值，HLA-B27与强直性脊椎炎的关系。
第二节干细胞工程与流式细胞术干细胞分析
要求：了解干细胞（包括胚胎干细胞、造血干细胞、间充质干细胞等）发育、抗原表达过程，掌握流式细胞术干细胞检测设门技术、注意事项、干细胞绝对数的计算方法。
第三节白血病/淋巴瘤免疫分型及其应用
要求：了解急性白血病、淋巴瘤的WHO分类、熟悉几种特殊类型急性白血病和淋巴瘤的免疫分型特征。
第四节流式细胞术粒细胞、红细胞、血小板分析及其应用
要求：了解各类细胞CD55/CD59表达情况，了解血小板糖蛋白的种类、意义，了解流式细胞术分析红细胞、血小板的注意事项；掌握流式细胞术分析红细胞、血小板的设门技术及CD55/CD59在诊断PNH中的价值。
第四章流式细胞术在科研工作中的应用（3学时）
第一节细胞周期与DNA倍体分析
要求：了解流式细胞术分析DNA/RNA的常用染料、熟悉ModFit LT DNA分析软件使用方法，掌握细胞周期/DNA倍体分析方法。
第二节CBA分析系统
要求：了解CBA分析系统及其检测原理
六、实验课内容：20学时
1．流式细胞术的标本处理(3学时)
要求：掌握流式细胞术标本制备方法
2．仪器的调节与质控(3学时)
要求：熟悉仪器的操作规程及软件额使用方法，了解质控品的使用方法与操作规程3．淋巴细胞亚群分析；HLA-B27检测(3学时)
要求：掌握淋巴细胞亚群、HLA-B27自动分析软件操作规程
4．胞内抗原检测(3学时)
要求：熟悉胞内抗原标记方法
5．红细胞CD55、CD59检测（3学时）
要求：熟悉红细胞表面抗原的检测方法，掌握设门技术
6．血小板膜糖蛋白分析(2学时)
要求：熟悉血小板膜糖蛋白分析方法、注意事项
7．DNA倍体分析（3学时）
要求：熟悉DNA染色步骤，ModFit自动分析软件的使用方法
七、重点、难点：
八、授课方式：
理论授课与实验操作，多媒体教学
九、考试方式：
理论课笔试结合实验操作评分
十．教材及主要参考资料：
1．血液病学，张之南，杨天楹，郝玉书主编，2003年第一版，人民卫生出版社2．白血病，陆道培，卞寿庚主编，2003年第一版，中国医药科技出版社
3．临床流式细胞分析，王建中主编，2005年第一版，上海科学技术出版社
4．医学免疫学,毕爱华主编，2000年第二版，人民军医出版社
5．流式细胞术原理与应用教程，吴后男主编，2008年第一版，北京大学医学出版社6．流式细胞术基本原理与实用技术，梁智辉，朱慧芬，陈九武编著，2008年第一版，华中科技大学出版社
7．Maryalice Stetler-Stevenson, Ejaz Ahmad, David Barnett,et al. Clinical Flow Cytometric Analysis of Neoplastic Hematolymphoid Cells;Approved Guideline-Second
Edition.Clinical and Laboratory Standards Institute.
8．Brent. Wood, Maria Arroz, David Barnett, et al. 2006 Bethesda Internation Consensus Recommendation on the Immunophenotypic Analysis of Hematolymphoid Neoplasis by Flow Cytometry:Optimal Reagents and Reporting for the Floe Cytometric Diagnosis of Hematopoietic Neoplasia. Cytometry Part B,2007,,72B:s14-s22.
十一、开课单位及负责人：
首都医科大学第一临床医学院血液科教研室
教研室主任：徐娟
课程负责人：徐娟
联系电话：83198476。