流式细胞术
细菌学检验-13-流式细胞技术
液流系统（流动室、液流驱动系统）示意图
流动室
鞘液
进样孔
喷嘴
荧光信号
Fluorescence signals
激光束
Focused laser beam
FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱
（2）光学系统：激光光源、光收集系统
激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射较长波长的光，通过较
BD LSR
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点： 多数字化 适用用各类细胞分选 4路分选
FACSAria
科研型
特点： 分辨率高
选配多种波长和 类型激光器
可把感兴趣细胞 分选到特定培养孔 或板上（4路和24 孔板）
适用于高速分选 和多色分析
（4）分选系统
配有分选装置，分选带有某 种特性的细胞
单波长、高强度、高稳定性
多采用氩离子激光器或氦氖激光器
一般选配2~4根激光，488nm 、633nm和 355nm、407nmUV激光
最多检测13个荧光参数
光收集系统：滤光片
Longpass
460 500 540
Shortpass
460 500 540
Bandpass
460 500 540
• 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的 多个不同特征。
• 线性放大器和对数放大器
流式细胞术的特点
流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及 细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下， 通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种 信号对细胞进行定量分析或纯化分选。
细胞不被破坏，单个细胞，测量快速、大量、多参数、 准确、灵敏、定量
流式细胞术——原理,操作及应用(一)
流式细胞术——原理,操作及应用(一)流式细胞术——原理,操作及应用1. 原理•流式细胞术（Flow Cytometry）是一种用于分析和计数悬浮在溶液中的个体细胞的技术。
•通过利用激光器激发细胞或微粒上荧光探针或吸光染料产生的荧光信号或散射光信号进行检测和分析。
2. 操作步骤样本制备•通过细胞培养、组织消化等方法获得需要检测的细胞样品。
•样本可能需要进行染色或标记以便于特定细胞或分子的检测。
流式细胞仪设置•调整激光器和探测器以适应所用标记物的激发和发射波长。
•设置仪器参数，如流速、放大倍数等。
数据采集和分析•将样本注入流式细胞仪，使其以单个细胞的方式流过激光束。
•通过荧光或散射光信号来检测和记录每个细胞的特征。
•利用专业软件对采集到的数据进行分析和解读。
3. 应用免疫表型分析•流式细胞术可以用于检测和分析细胞表面标记物的表达情况。
•可以用于分离和鉴定各种免疫细胞亚群，如T细胞、B细胞和NK 细胞等。
细胞周期分析•通过染色剂标记DNA，流式细胞术可以区分细胞的不同周期阶段。
•可以用于评估细胞增殖能力和细胞周期的营养、药物等因素影响。
细胞凋亡检测•利用荧光探针标记凋亡标记物，流式细胞术可以检测和计数凋亡细胞比例。
•可以用于评估药物对细胞凋亡的影响以及疾病状态的分析。
粒子分析•可以用于分析和鉴定不同大小、不同形状的微粒，如细胞、细胞器、胞外囊泡等。
•可以用于研究细胞的分泌和吞噬过程等。
其他应用•流式细胞术还可用于检测和分析细胞内钙离子浓度、细胞内蛋白、RNA和DNA含量等。
•可以应用于疾病诊断、药物筛选、生命科学研究等领域。
以上是流式细胞术的原理、操作步骤及一些常见应用的介绍。
流式细胞术的广泛应用使其成为现代生命科学研究和临床实践中必不可少的技术之一。
流式细胞术基础知识
讲者：***
目录
1、流式细胞术基本定义 2、流式细胞仪介绍 3、荧光染料介绍 4、不同型号流式细胞仪简介 5、流式细胞仪应用
流式细胞术定义
流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快速、 准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多 项特性（多参数）的技术，同时可以对特定群体加以分选
淋巴细胞亚群分析可以了解机体在不同条件下的免疫功能 状态，主要包括细胞免疫功能和体液免疫功能。在临床上，主要用 于对免疫系统造成明显干扰的相关疾病的辅助诊断，分析疾病的发 病机理，监控疾病的病程进展，观测疗效及监测预后等等。
流式细胞仪临床应用
临床意义 CD3+ CD3+ CD4+ CD3+ CD8+ CD4+ / CD8+ B细胞 NK细胞
FITC, PE,ECD,PC5 or PECy5.5,PE-Cy7
APC, APC-Cy7
国食药监械(进)字 2014第2403463号
FITC, PE,ECD,PC5 or PC5.5,PC7
红光:638nm 紫光：405nm
APC，APC-Cy5 or APCAlexa Fluor 700, APC-Cy7 or APCAlexa Fluor
谢谢！
部分演示内容来源于网络，如有侵权，请联系删除！谢谢！
APC, APC-Cy7
浙械注准 20192220121
流式细胞仪应用
临床研究
血液，肿瘤， 药理，免疫…
环境研究
湖泊，海洋 生态研究…
生物学研究
遗传，生殖， 微生物，细胞 生物，毒理， 分子生物…
食品制药工业
食品检测、药物筛 选，疫苗研究…
流式细胞术名词解释
流式细胞术名词解释
流式细胞术（flow cytometry）是一种高速、高效的单细胞分析
技术，广泛应用于生命科学中。
该技术利用激光束和多重探针对单个
细胞进行多参数分析，可以快速获取细胞表面、内部分子以及细胞特
性的详细信息。
在流式细胞术中，细胞被分散在流动液体中，通过细胞分流器进
入流式细胞仪的测量单元。
激光器对细胞进行激发，然后由散射仪和
荧光仪收集并分析激发光信号。
散射光可以提供关于细胞大小和形状
的信息，而荧光探针可以用于检测细胞表面抗原、内部蛋白、DNA含量、RNA含量等多种细胞特征。
流式细胞术的优势在于可以快速高效地处理大量的样本，适用于
单细胞和多种细胞的分析。
同时，该技术还可以对细胞进行有效的分
选和分离，具有极高的精确性和灵敏度。
因此，流式细胞术在生物学、医学、生物工程等领域中得到了广泛的应用。
例如，在癌症诊断中，
通过流式细胞术可以区分不同类型的癌细胞，进一步指导治疗方案的
设计和实施。
总之，流式细胞术已经成为现代生命科学中不可或缺的工具之一。
其在高通量、高精度分析和细胞分选中的优势，可以为研究细胞和疾
病提供重要的科学基础。
细胞鉴定 流式和ngs
细胞鉴定流式和ngs
细胞鉴定是对细胞的种类、性质和功能进行确定的过程。
流式细胞术和二代测序（NGS）是两种常用的细胞鉴定技术，它们各有优缺点。
流式细胞术是一种基于细胞表面标志物的快速、高通量的细胞分析技术。
它通过将细胞悬液逐个通过激光束，检测细胞表面标志物的荧光信号，从而实现对细胞的分类和鉴定。
流式细胞术具有快速、灵敏、多参数、高通量等优点，可用于检测细胞表面标志物、细胞周期、细胞凋亡等。
然而，流式细胞术只能检测已知的标志物，对于未知的标志物则无法进行鉴定。
二代测序（NGS）则是一种高通量的基因测序技术，它可以对细胞中的所有基因进行测序，从而实现对细胞的全面鉴定。
NGS 可以检测细胞中的基因突变、基因表达、表观遗传学等信息，从而深入了解细胞的生物学特征和功能。
然而，NGS 技术相对复杂，需要专业的实验技能和生物信息学分析能力，同时成本也较高。
综上所述，流式细胞术和二代测序（NGS）各有优缺点，在细胞鉴定中应根据具体需求选择合适的技术。
如果需要快速、高通量地检测已知的标志物，流式细胞术是一个不错的选择；如果需要全面了解细胞的基因信息，NGS 则更为适合。
简述流式细胞术的原理与应用
简述流式细胞术的原理与应用一、流式细胞术的原理介绍流式细胞术（Flow cytometry）是一种利用流式细胞术仪（Flow cytometer）对单个活细胞进行多参数分析的技术。
它基于细胞的光学性质和生物化学特性，通过探针标记、荧光染料和细胞表面抗原的相互作用，对细胞进行高速连续检测和分离。
流式细胞术的原理如下：1.细胞悬浮和样本处理：将细胞样品作为悬浮液，通过离心等方法将细胞分散在液体中，去除细胞的团块和碎片，保证单个细胞的流式检测。
2.细胞标记：采用流式细胞术特定的探针和染料对细胞进行标记，以便后续检测和分析。
常用的标记方法包括荧光染料标记、抗体标记和细胞分子探针标记。
3.细胞分离和传送：将标记的细胞悬浮液通过流式细胞术仪，以流速每秒数千个细胞的速度单个分子传送到探测点。
4.光散射与荧光探测：细胞经过流式细胞术仪后，以激光束照射细胞，通过散射光和荧光信号的检测，对细胞进行空间分布和化学信息的获得。
5.数据采集与分析：通过计算机系统采集和记录细胞经过流式细胞术仪后所产生的光散射和荧光信号，在分析软件中对数据进行处理和解读，获得有关细胞的信息。
二、流式细胞术的应用流式细胞术是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的技术，它在细胞学、免疫学、血液学、肿瘤学等领域有着重要的应用价值。
下面列举几个流式细胞术的应用示例：1.血液学研究：流式细胞术结合细胞表面标记和荧光染料标记，可以对血液中的不同细胞类型进行快速的鉴定和数量分析。
例如，通过流式细胞术可对血液中的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞等进行分类和计数，从而判断患者的免疫状态和疾病进展。
2.癌症诊断与治疗：流式细胞术对肿瘤细胞的检测和分析有着重要的作用。
通过流式细胞术，可以检测和定量肿瘤细胞的表面抗原和细胞内信号分子，进一步了解肿瘤细胞的类型、分化程度和增殖状态，为癌症的诊断和治疗提供指导。
3.免疫学研究：流式细胞术能够对免疫系统中的各种细胞类型进行鉴定、计数和功能分析。
流式细胞术简介及应用进展课件
流式细胞术简介及应用进展
15
▪高速度：分析细胞数：1000个/s→60000个/s ▪高灵敏度：荧光分子数/细胞：3000→100个FITC； ▪高准确度：区分两个细胞：参数：相差5% →1%； ▪高精度：CV值：7% →< 1%; ▪多参数：荧光：1个 →12个参数； ▪高纯度：分选细胞：80-90% →99.9%; ▪其 它：荧光信号：线性检测→对数检测
电子程序化单细胞分选仪——Electronically programmable individual cell sorter, EPICS (Coulter公司）
流式细胞术简介及应用进展
5
BD FACSCalibur型 FCM （单L，3F）
流式细胞术简介及应用进展
6
Coulter EPICS XL/XL-MCL （单L，4F）
流式细胞术简介及应用进展
11
BD FACSAria
BD FACSCount
CD3\4\8 专为HIV监测设计的经济普及型流式细胞仪
流式细胞术简介及应用进展
12
BD FACSCanto 2L 6C
流式细胞术简介及应用进展
13
BD FACS Calibur 1L 4C
流式细胞术简介及应用进展
14
三、流式细胞术应用的新进展
流式细胞术简介及应用进展
17
2、cytometric bead array (CBA)
微球流式芯片技术(CBA)是一种微球多参数检测分析技 术，它用一系列的微球组合来捕获并结合流式细胞术检 测溶液中被检测物质的量，其采用夹心法分析策略。用 已知的标准品和对照标准曲线就可得出被测样品的浓度。 这种检测方法，既不受样品量的限制，也可同时检测多 项指标参数；客观、省时、人为因素影响小。
流式细胞术简介
流式细胞术简介一、流式细胞术发展简史流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。
其特点是：①测量速度快，最快可在1秒钟内计测数万个细胞；②可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；③是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采集和分析技术等。
FCM目前发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方面的心血和成果。
1934年，Moldavan1首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块的淤阻。
1953年Crosland -Taylor根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流体动力聚集作用。
于是设计了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。
这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。
1956年，Coulter在多年研究的基础上利用Coulter效应生产了Coulter 计数器。
其基本原理是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。
1967年Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。
1973年Steinkamp设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细胞分选的装置。
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流式细胞术检测淋巴细胞表面标记
一、实验目的
1.了解流式细胞仪的组成、原理及应用：初步了解流式细胞仪的工作元件及基本应用原理；能够认识流式细胞术的应用，特别是常用的一些功能。
2. 熟悉用流式细胞术检测小鼠脾脏T细胞表面标志的基本流程
3. 学习并掌握流式细胞术结果的分析：能够基本看懂结果图，重点掌握“门”和“补偿”两个概念。
二、实验原理
1.流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性（多参数）的技术，同时可以对特定群体加以分选。
特点：可检测的样本种类多样，大小范围较广（0.2~50µm）；检测速度快，分析样本量大（快速、大量）；细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏；采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度10000个细胞(微粒)/秒与统计分析精确性。
2. 流式细胞仪组成及原理
Fluidics (液流系统)——流体动力学聚焦样本形成单细胞流。
鞘液是辅助样本流被正常检测的基质液。
主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。
匀速流动，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。
Optics (光学系统)——激发和收集光信号。
激发系统包括：激光器、透镜和反射镜，将激光聚焦到检测区
收集系统包括：光学镜片和滤光片、光信号检测器
流式细胞仪收集的信号：（1）散射光信号：细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为前向散射光(信号强弱与细胞体积大小成正比)和侧向散射光(检测细胞粒度和细胞内相对复杂性)。
FS-SS图可对未染色的活细胞进行分析或分选，但不能分析表面分子（2）荧光信号：荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同；每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管；选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。
Electronics (电子系统)——数据处理系统，扩大信号，将光信号转化为电信号，处理信号并存储于电脑。
3.流式步骤
第一步：用带有不同荧光基团的抗体分别识别并结合细胞上不同抗原（染色）；第二步：带有荧光的细胞一个接一个通过激光；第三步：不同荧光基团有不同发射光谱，荧光染料选择原则：必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发、激发光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合适范围内、荧光素光谱的重叠应当尽量减少；第四步：复杂的荧光信号被不同分色镜和滤光片分解；第五步：光电倍增管（PMT）将光信号变成电信号；第六步：模数变换器（ADC）进一步将模拟信号变成计算机能处理的数字信号
4.分选基本原理
细胞悬液形成液流柱→压电晶体产生机械振动，流动室振动→液流断裂成液滴→如果为
空白液滴，则不充电，弃去；如果为含细胞的液滴，则充电，偏转落入收集器。
5.门指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。
根据门的形状又分为线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。
6.由于荧光波长会相互重叠，所以会出现只染了绿色荧光（FITC）的细胞，也会在橘黄色（PE）检测出信号，所以我们需要根据设各种单染管，调整每种荧光阴性群位置，凭观察判断调整补偿多少，使得类似PE与FITC的重叠比较少，
三、实验材料
单个核细胞
抗体：
CD3+ T cell FITC anti-mouse CD3
CD4+ T cell PE anti-mouse CD4
CD8+ T cell APC anti-mouse CD8a
CD3抗体、CD4抗体、CD8抗体按照1：200倍稀释作为工作浓度
吸管、试管、移液器、EP管
四、实验步骤
1.收集细胞：取细胞总数约1x106-5x106脾脏细胞于1.5ml EP 管中（在管盖上标记好组别），1500rpm， 4℃，5min（离心机需预冷）
2.染色：小心用枪吸去上清，用100ul PBS重悬细胞，然后分别加入100ul含荧光抗体的PBS（注意做好标记），混匀，避光，4℃，20-30min。
（此时管中抗体为1：400，即0.5μl/200μlPBS）
上机时共需使用五管——1.No stain、2. 三染管、3. 单染CD3、4. 单染CD4、 5. 单染CD8
3.清洗：加500ul PBS，吹打混匀后， 5000rpm， 4℃，5min
4.检测：小心用枪去除上清，再加入500ul PBS吹打混匀，转入流式管，置于冰上，流式细胞仪检测
五、实验数据处理和分析
图一根据细胞大小和折光分类，圈出了所有淋巴细胞，排除细胞碎片和杂质。
图二横纵轴均为前向散射光，通过比较纵轴的面积大小，圈出单个细胞，排除粘连的细胞。
图三圈出了表面分子为CD3的细胞，即全部T细胞。
图四的Q1区为CD8+CD4-T cell，Q3区为CD4+CD8-T cell，Q4区为CD4-CD8-Tcell，Q2区为CD4+CD8+T cell。
如图可看出，CD4+T cell含量为69.5%，CD8+T cell为21.4%，CD4+/CD8+ 比例约为3.2，查阅得Balb/c小鼠的CD4+/CD8+ 比例约在2-3范围内，所以我认为实验结果属正常情况。
六、思考
T细胞比例在临床检测中的意义？
人体CD4+/CD8+比值正常情况下为1.4-2.0，升高或降低均与疾病相关。
升高——
常见于自身免疫性疾病中，如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、Ⅰ型糖尿病等，此外还可用于监测器官移植的排斥反应，若移植后CD4+/CD8+比值明显升高，则可能发生排异反应。
减小——
CD4+/CD8+比值减小是免疫缺陷病的重要指征。
在获得性免疫缺陷综合征（AIDS）患者中，就存在着CD4+细胞数显著减少的现象
此外，CD4+／CD8+比值的严重减小甚至倒置被认为是病毒感染性疾病的重要指征：在水
痘、猩红热、麻疹患者中就发现有CD3+、CD4+细胞数减少，CD8+细胞数增多，CD4+/CD8+比值降低。
急性期和复发的传染性单核细胞增多症中也有CD4+／CD8+比值降低的现象，它是由CD8+细胞数增高引起的。
骨髓造血细胞的增殖和分化障碍也可造成CD4+／CD8+比值降低，如在再生障碍性贫血与粒细胞减少症中，患者体内外周血CD4+细胞数减少，导致CD4+／CD8+比值明显下降。
CD4+/CD8+比值与肿瘤也相关：实体瘤患者像消化道癌症、肝癌、乳腺癌患者外周血中都有CD3+、CD4+细胞数降低，CD8+细胞数增多，CD4+／CD8+比值明显降低的现象。