如何看流式细胞术结果中的图(转)资料讲解
sybergreen流式细胞结果解读
Sybergreen流式细胞仪是一种用于检测细胞遗传学和细胞分化的先进工具，其结果解读需要结合实验的具体情况以及相关知识和技能。
首先，Sybergreen流式细胞仪主要用于检测细胞内Syber Green I染料标记的DNA的荧光强度，从而确定细胞的DNA倍体和细胞类型。
在正常的情况下，二倍体细胞和单倍体细胞的荧光强度会有明显的差异，而异常倍体细胞的荧光强度可能会下降。
因此，Sybergreen流式细胞仪结果通常会显示不同倍体细胞的荧光强度分布图。
其次，对于结果的分析，需要注意以下几点：
1. 阳性细胞数量：观察荧光强度分布图中的阳性细胞数量，如果数量较多，则说明该指标在某些细胞中存在异常。
2. 倍体类型：观察荧光强度分布图中的各倍体类型的比例，如果某一种异常倍体细胞的荧光强度明显高于其他倍体类型，则说明该异常倍体细胞的数量较多。
3. 阳性细胞的形态：在观察异常细胞时，需要注意阳性细胞的形态是否与正常细胞存在差异。
异常细胞的数量增多时，需要观察是否有一些特殊形态的细胞出现。
在具体的应用中，Sybergreen流式细胞仪可以用于检测肿瘤细胞的DNA倍体和增殖活性，从而判断肿瘤的恶性程度、患者的预后以及治疗效果等。
同时，该仪器还可以用于干细胞研究、组织分化研究等领域。
但是需要注意的是，在解读Sybergreen流式细胞仪结果时，需要结合患者的临床资料、病理诊断、免疫组化染色以及其他检测结果等进行综合分析。
综上所述，解读Sybergreen流式细胞仪结果需要具备一定的细胞遗传学和流式细胞仪方面的知识，并结合患者的具体情况进行分析。
只有在充分理解实验数据的基础上，才能准确地评估病情、制定治疗方案和评估治疗效果。
细胞流式图，你都看懂了吗？
细胞流式图，你都看懂了吗？流式图最常用的是：直方图、散点图、等高线图。
流式通道流式通道分散射光通道和荧光通道：散射光通道有两个，FSC和SSC通道；FSC(Forward scatter)，即前向角散射，它的值代表细胞的大小。
细胞越大，背景墙上留下的阴影就越大。
SSC(side scatter, SSC)，即侧向角散射，它的值代表细胞的颗粒度（granularity）。
反应细胞内部细胞器或者颗粒性物质分布规则，细胞表面突起。
一般在硏究细胞样品时首先关注FSC-SSC散点图（不需要标记任何荧光素偶联抗体），x轴代表FSC值，y轴代表SSC值，分别代表细胞的大小和颗粒度这两个基本的物理特征，所以样品的FSC-SSC散点图又称为样品细胞的“物理图”。
荧光通道表示的不是细胞特有的物理特征，而是其化学特征。
如需检测样品中是否有细胞表达某分子，则需标记荧光素偶联的该分子抗体，荧光素被相应的激光激发后产生荧光，该荧光信号通过光路系统被相应的荧光通道接收。
荧光通道值反映接收到的荧光信号的强弱，从而反映细胞上结合的荧光素的量，进一步反映细胞上表达该分子的数量，最后间接反映细胞表达某分子这一化学特征。
不同细胞群的FSC值和SSC值最多相差几倍，而荧光信号强弱之间一般相差很大，阴性细胞与阳性细胞之间、强阳性与弱阳性之间有时可以相差几十倍、几百倍，甚至几千倍，呈指数关系。
所以，流式图数轴上FSC值和SSC值以“一般数序形式”表示，而荧光通道值常以“对数形式”（logarithmic scale）表示，在识图时需要注意数轴的表示形式。
当然，并不是所有的荧光通道值都以“对数形式”表示，当荧光信号值相差不多时，也可以“一般数序形式”表示，如P染色检测细胞内DNA含量以及Hoechst33342染色分析和分选侧群干细胞时，均以“一般数序形式”表示。
1. 直方图（一个通道的信息）流式直方图形成的原理与统计学中的直方图相似,是在统计学直方图的基础上进一步发展而成的。
流式细胞术实验技巧及数据分析
670
红色
能量传递染料：
用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一 起，在488nm波长激发光激发后产生的发射波长 激发另一荧光染料产生的荧光信号。
Laser
488nm
ECD 620
PE CY5 670
CY7 755
流式细胞术操作流程：
培养细胞 新鲜组织 石蜡包埋
单细胞悬液 制备
荧光抗体标记
上机检测
胸腺嘧啶掺入到细胞新合成的DNA分子中，成为S 期细胞的一种标记物。流式细胞术采用抗BrdUrd 单克隆抗体免疫荧光和PI双参数检测细胞，不仅 可检测一个细胞群体的动力学参数和DNA含量，同
时可以了解不同细胞的DNA合成能力高低。
BrdUrd与PI检测
BrdUrd与PI检测
BrdUrd与PI检测
细 胞 三 色 荧 光 检 测
细胞因子测定
*检测T细胞(CD69)活化
G6=R1*R5
*CD4抗原分子结构引起CD4荧光强度下调
细胞因子分析图
*过敏性鼻息肉与鼻息肉细胞因子比较
纯化单核细胞
调节性T细胞检测
G3=R1*R3 G4=R1*R4
凋亡细胞测定
凋亡细胞测定
细胞凋亡检测
阴性的设置
光
补
偿
FL2
FL1
利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻
荧光通道的信号加以扣除的方法称“荧光补偿”
荧光补偿
Mean值判断补偿
双或多参数荧光抗体的组合标记
荧光染料
激发波长（nm) 发射波长（nm)
颜色
FITC+PE
488
FITC+T red
488
568
FITC+PeCy5 488
流式细胞术报告单解读
• • •
CD45 Dim------36.1 主要为原始/幼稚B 淋巴细胞，其免疫表型为CD34-、 CD117-、CD19+、HLA-DR+和CD10+。 非白细胞------6.1 主要为细胞碎片。
•
流式细胞术检测表明结果原始/幼稚B淋巴细胞约占骨髓细胞白细胞总数30%， 其免疫表型为CD34-、CD117-、CD19+、HLA-DR+和CD10+，提示为前B淋巴细 胞。结果符合急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）。
如何寻找异常细胞?
正常细胞群的分布
粒细胞
单核细胞 淋巴细胞
CD45:白细胞共同抗原，表达于所有白细胞
异常细胞群
异常细胞群
异常细胞的量如何计算?
• 流式如何定义细胞?
--以白血病细胞表达的抗原标志作为依据
粒细胞成熟过程
不同粒
表达
CD45+CD34++CD117++DR+ CD13++CD33++
CD34, HLA-DR, CD11b,CD16
CD34, CD117, DR, CD16 CD34, CD117, DR, CD10
CD34, CD117,DR
单核细胞的成熟过程
不同阶段单核细胞CD分子的表达情况
阶段 I 原单 II 幼单 表达 CD45+CD34++CD117++ DR++CD13++CD33++ 不表达 CD11b, CD14,CD15
• 流式报告单的结论如何得出?
病例分析
病例一
异常细胞
流式细胞仪结果图解读_流式细胞仪技术
流式细胞仪技术流式细胞仪技术，主要是测量群体中单个细胞经适当染色后其成分所发出的散射光和荧光，经染色的细胞在悬液中以单行流过高强度光源的焦点，当每个细胞经过焦点时，发出一束散射光/或荧光。
它们经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器(光电倍增管或一个固态装置)，光检测器把散射光定量转化成电信号，经数字转换器进行数字化后而成整数，然后进行电子存储，以后数据可以调出显示和进行分析。
其优点如下1、具有操作简便，只要将染色的单个细胞推入仪器中，就会得出数据。
2、具有较高的灵敏度及测定速度，而且每次可测出许多数据，一般情况下，每秒可测5000个细胞，能迅速分析和记数大量细胞，并能准确统计群体中荧光标记细胞的比例。
3、应用广泛，即可用于测定细胞活力、繁殖周期和细胞定型分析，也可区别死亡细胞、分裂细胞和静止细胞群，既可测定DNA和RNA、测凋亡峰，又可测蛋白含量，特别是胞浆蛋白。
一、样品的制备流式细胞仪是测定一个或重复的每个颗粒经光路的信号，因此，细胞必须做成单个细胞悬浮状态，不能聚集，也不允许有细胞碎片存在。
所用染料必须特异（如特异单抗），而且不允许渗透至载液中。
标本如果是属于淋巴细胞等血细胞、骨髓细胞或白血病细胞系或类淋巴细胞系，要经Ficoll分离，作单细胞分离处理，但若为实体组织或贴壁生长的上皮成纤维样细胞，需采用酶消化法(胰蛋白酶、胶原酶等)，化学法（EDTA、EGTA和柠檬酸盐）消化分散液或洗液最好用无钙、镁PBS，柠檬酸盐的浓度为40μmol/L，并同时采用机械分散法，将经消化处理的膨松组织，用玻璃珠悬摇或用吸管吹打分散均可，用PBS洗2～3次后重悬，最好过一下尼龙或不锈钢网筛100μm和20μm。
细胞浓度要保证在1-2×106/mL若标本用于测定单个细胞，需加入1～5 mg/L的DNAase，将有助于阻止破碎细胞释放的DNA造成细胞再聚集，但是若分离的细胞要作DNA含量测定之用时，则切勿加DNAase。
流式细胞图谱怎样看
流式细胞术在许多研究生课题中常用到，但对其结果的分析却不是很清楚。
在此收集点相关资料并以实验中的一张图片为例，大家共同学习。
图中白色箭头及尾部G1,G2,S是我用PS加上去的，方便讨论。
流式细胞术分析细胞周期结果示图首先来认识下图：1、纵坐标Cell Number：即计数到的有效细胞数；2、横坐标DNA Content：即DNA量，为什么用DNA量来区别各周期我们等下再讲；3、G1、G2、S三期在上图已经用箭头标示；4、右侧数字含义：Mean G1=195.4即G1期DNA含量平均值为195.4；%G1=73.6即G1期细胞数占总数的73.6%；以此类推……关于结果的具体分析我们会在接下来一起学习讨论。
主要从细胞周期的角度看各参数的意义：1、细胞周期指由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，所需的时间叫细胞周期时间。
可分为四个阶段（见图）：① G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间；② S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期；③ G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间；④ M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。
细胞周期图示2、从增殖的角度来看，可将高等动物的细胞分为三类：①连续分裂细胞，在细胞周期中连续运转因而又称为周期细胞，如表皮生发层细胞、部分骨髓细胞。
②休眠细胞暂不分裂，但在适当的刺激下可重新进入细胞周期，称G0期细胞，如淋巴细胞、肝、肾细胞等。
③不分裂细胞，指不可逆地脱离细胞周期，不再分裂的细胞，又称终端细胞，如神经、肌肉、多形核细胞等等。
细胞周期的时间长短与物种的细胞类型有关，如：小鼠十二指肠上皮细胞的周期为10小时，人类胃上皮细胞24小时，骨髓细胞18小时，培养的人了成纤维细胞18小时，CHO细胞14小时，HeLa细胞21小时。
不同类型细胞的G1长短不同，是造成细胞周期差异的主要原因。
流式细胞周期结果图解读
流式细胞周期结果图解读(附图详解)Time：2010-12-07 PM 19:03Author:bioer Hits: 51 times 流式检测细胞周期操作步骤1. 细胞培养：取对数生长期的细胞，按1×106cells/ mL以1mL接种24孔板或2mL接种于6孔板内，进行所需的处理（比如加入药物），特定时间后终止培养，进行下一步的实验。
2. 细胞固定：800rpm离心5min，收集细胞沉淀，弃上清，用预冷PBS洗涤两次，加入预冷75%乙醇，于4℃固定4h以上。
3. 细胞染色：1500rpm离心5min，弃上清，以3mL的PBS洗涤一次，加入400uL溴化乙锭（PI，50ug/mL），100ul RNase A（100ug/mL ），4℃避光孵育30min。
4. 流式分析：以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2~3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。
注：上机前要以50um尼龙网膜或35um细胞过滤器过滤细胞！因为PI具有很强的粘附性，容易使细胞聚团！流式细胞周期结果图解读首先来认识一下流式细胞周期结果图：1、纵坐标Cell Number：即计数的有效细胞数；2、横坐标DNA Content：即DNA含量；3、G1、G2、S三期在图中已经标示；4、右侧数字含义：Dip G1-53.84% at 55.56，即G1期DNA含量平均值为55.56；53.84%即G1期细胞数占总数的53.84%；Dip G2-5.64% at 107.72，即G2期DNA含量平均值为107.72，5.64%即G2期细胞数占总数的5.64%；以此类推…流式细胞周期结果图的意义，主要从细胞周期的角度看各参数的意义：1、细胞周期指由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，所需的时间叫细胞周期时间。
可分为四个阶段：①G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间；②S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期；③G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间；④M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。
流式细胞术报告单解读
CD45+CD13++CD33++ CD15++CD11b++CD16+
CD34, CD117, DR, CD10
V 成熟粒
CD45++CD13++CD33++
CD34, CD117,DR
CD15++CD11b++CD16++CD10+ +
单核细胞的成熟过程
病例二
• 淋巴细胞------41.5 T细胞占淋巴细胞 70.9%，CD4:CD8=1.42，未见明显异常； NK细胞占淋巴细胞4.7%，未见明显异 常；成熟B细胞占淋巴细胞17.6%，为多 克隆B细胞,未见明显异常。
• 粒细胞--------10.9 其相对比例明显减 低，免疫表型未见明显异常。
单核细胞------37.7 相对比例明显增多，其中约70%为成熟单 核细胞，免疫表型为CD14+,CD64+,CD11b+, CD13+,CD33+,HLA-DR+ 和CD4+。
CD45 Dim------33.0 相对比例明显增多，为髓性原始/幼稚细 胞,免疫表型为CD34+，CD117+，CD13+,CD33+和HLA-DR+。
成熟 红
CD45, CD71
B淋巴细胞成熟过程
T淋巴细胞的成熟过程
其他血液系统肿瘤的特异性标志
毛细胞性白血病：CD19+，CD103+， CD11c/CD22双阳性高表达
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如何看流式细胞术结果中的图(转)
如何看流式细胞术结果中的图
FCM数据的存贮的方式是FCS2.0（flow cytometry standard），采用列表排队(List Mode)方式。
易于加工处理分析，但缺乏直观性，数据的显示通常有一维直方图、二维点图、等高线图、密度图等几种；由数据还可以做出标准曲线进行定量分析。
Q1：坐标轴的意义？
1、单参数直方图
每一个细胞单参数的测量数据可以整理成统计分布，以直方图的方式来显示。
在图中，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，其单位是道数（channel），可以是线形（line）或者对数（log）。
纵坐标一般是相对细胞/粒子数（count）！
2、二维图
在二维图的中，横坐标/纵坐标都表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，可以是线形（line）或者对数（log）。
双参数图可以将样品细胞群分开，从而方便对感兴趣的细胞进行分析。
Q2：“Gate”和“Regin”？
设门是流式细胞分析中一种重要的技术，只有通过最佳的设门方式，才能准确地获取和分析数据，从而得到临床诊断和科研中有价值的信息。
On-line gating(threshold gating)监测/获取数据
Off-line gating：分析实验数据散射光设门/荧光设门散射光/荧光联合设门多重逻辑门
(组合门)
多重逻辑门 G3=R1 and R2 (G3=R1×R2) 其它： G=R1 or R2 G=R1 not R2
Q3:流式图中的颜色与荧光颜色?
流式图中的颜色为区分不同细胞群而人为指定, 与荧光颜色无关!! Q4：流式图中的阴/阳（N/P）如何划分?
如何做M1阴性界限？实际上，这个M1的划分完全是根据阴性(同型)对照来的！如下图：左图为同型对照，即：您所检测的物质在阴性
组中的基础表达量，可以理解为背景、静息状态下、基础水平、未
受刺激时等。
右图即阳性组，也就是接受刺激后，功能状态下、药
物作用后等。
Q5:这么巧，阴性正好在101划分？？
其实, 我们可以人为地将电压，放大倍数调到相应的大小，使阴性的右边界在某一个值上，（通常划在101附近）这样后期做sample 时好看！当然也可以调到102，103次方。
Q6：为什么要进行荧光补偿？
流式细胞分析中经常要用到2种以上的荧光标记抗体进行染色，而目前所使用的多种荧光染料发射谱间有一定重叠。
“荧光补偿”这个术语是指修正荧光渗漏的过程，如从探测器除去除匹配荧光以外的任何荧光信号。