MolecularProbes流式细胞分析-ThermoFisherScientific
流式细胞术分析的工作原理及应用
流式细胞术分析的工作原理及应用1. 工作原理流式细胞术（Flow Cytometry）是一种广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域的细胞分析技术。
它基于细胞在流式细胞仪中通过单个细胞传感器单元的原理，可以实时、快速地检测和分析细胞的各种特性。
1.1 流式细胞仪原理流式细胞仪是流式细胞术分析的核心工具。
它将细胞悬浮液注入到一个窄小的液流中，并通过雷射束（Laser Beam）对细胞进行激发。
当细胞经过激发光束时，会发射出特定波长的荧光信号。
流式细胞仪通过光学设备收集并分析这些信号，从而获得关于细胞的信息。
1.2 细胞荧光标记在流式细胞术分析中，细胞通常会被标记上特定的荧光染料，以便测量其特定特征。
这些标记可以是单一的，也可以是多重的，用于同时分析多个参数。
1.3 数据分析流式细胞仪在测量细胞荧光信号的同时，还会记录细胞的大小、形状和荧光强度等参数。
这些数据可以通过特定的软件进行分析和解释，以获得关于细胞数量、细胞类型和细胞功能等方面的信息。
2. 应用领域流式细胞术分析具有广泛的应用领域，在生物医学研究和临床诊断中发挥着重要作用。
2.1 免疫学研究流式细胞术在免疫学研究中广泛应用，可以用于分析免疫系统中不同类型的细胞数量和功能。
通过对白细胞表面标记物的检测，可以检测特定细胞亚群的存在，并研究其在疾病和免疫反应中的作用。
2.2 肿瘤学研究流式细胞术在肿瘤学研究中也扮演重要角色。
它可以用来研究肿瘤细胞的增殖、存活和死亡等关键特性，进而评估药物治疗对肿瘤细胞的影响。
此外，流式细胞术还可以检测循环肿瘤细胞，从而提供肿瘤早期诊断和治疗监测的手段。
2.3 微生物学研究流式细胞术被广泛应用于微生物学研究中，可以用于分析微生物的数量和生物学特性。
通过对细菌、真菌和病毒等微生物的荧光标记，可以确定它们的种类、数量和活性，从而研究其生长规律和致病机制。
2.4 干细胞研究流式细胞术在干细胞研究中也扮演重要角色。
6 2008年04医检-流式细胞术(2008.3.14)
区能保证样品中细胞是一个一个分别受到光照，并且每
一受检细胞都受到一致的光照激发，此为流式细胞仪中 的单细胞照明技术；
（3）细胞信号检测与分析处理系统：细胞受到激
发光照射时，产生散射光和荧光信号。光电倍增管及 其电子线路将每一细胞的光信号转换为相应的电信号， 后者再通过模数转换器( ADC )量化为数字信号，由 计算机采集、分析、显示与存贮等，此为流式细胞仪 的单细胞检测技术。
CD8等。
四、肿瘤耐药基因分析
MDR(+)表示对化疗药物耐药
五、AIDS病检测中的应用
CD4+Th细胞、CD4+/CD8+比例
六、自身免疫病相关HLA抗原分析
HLA-B27可出现在58%～97%的强直性脊 柱炎(As) 患者
思考题
名词解释：流式细胞术（flow cytometry，FCM）， 细胞分选(cell sorting)，荧光补偿技术
T淋巴细胞及其亚群分析
Th(CD3+CD4+CD8-T); Tc(CD3+CD4-CD8+T)
B淋巴细胞及其亚群分析
B1(CD19+CD5+):产生IgM型自身抗体, 参与免 疫调节、与自身免疫病的发生有关 B2(CD19+CD5-):受外来抗原刺激, 产生高亲和 性特异性抗体
NK细胞分析
NK(CD3-CD16+CD56+)
二、荧光染色
染色：荧光染料与细胞成分的结合过程
方法：
间接免疫荧光标记 ：信号放大作用，非特异干扰信号较强。 直接免疫荧光标记 ：常用细胞表面标志的染色分析。
常用荧光染料的特性
荧光染料 激发波长 (nm)
流式细胞术实验技巧及数据分析
流式细胞术应用领域
免疫学研究
用于检测免疫细胞表面标志物、 细胞亚群分类和功能分析等。
生殖医学研究
用于精子分析和胚胎发育监测等 。
血液学研究
用于检测白血病、淋巴瘤等血液 肿瘤细胞的表面抗原和基因表达 。
肿瘤学研究
用于检测肿瘤细胞的生长、凋亡 和转移等生物学特性。
流式细胞术实验技巧 及数据分析
日期：
• 流式细胞术简介 • 流式细胞术实验技巧 • 流式细胞术数据分析 • 流式细胞术实验问题与解决 • 流式细胞术实验案例分享
目录
Part
01
流式细胞术简介
流式细胞术定义
流式细胞术是一种在液流中快速检测和分离单个细胞的生物技术。通过将细胞悬 浮在液流中，并使用激光束照射细胞，可以测量细胞的物理和化学特性，如细胞 大小、颗粒质量和荧光标记等。
物的群体结构、进化关系和生态分布等方面。
THANKS
感谢您的观看
仪器参数，如光电倍增管
电压、滤波器等。
数据采集
3 确保数据采集的完整性和
准确性，避免丢失或重复 采集数据。
Part
03
流式细胞术数据分析
流式细胞术数据分析
• 请输入您的内容
Part
04
流式细胞术实验问题与解决
荧光补偿设置问题
总结词
荧光补偿设置是流式细胞术实验中的 重要环节，用于消除不同荧光染料间 的光谱重叠。
细胞群体识别问题
总结词
细胞群体识别是流式细胞术实验的重要环节，直接影响实验 结果的分析和解读。
详细描述
在流式细胞术实验中，需要准确识别和区分不同的细胞群体 。通过优化抗体标记组合、采用多参数分析等方法，可以提 高细胞群体识别的准确性和可靠性，为后续的数据分析和解 读提供有力支持。
流式细胞术实验方法及应用描述
抗与待测标本反应后，洗去未结合抗体再加
入荧光标记的二抗，形成有荧光的抗原--抗 体--抗体复合物。其操作复杂、费时，目前
兔抗小鼠
小鼠
很少用。在科研中需要一些新的抗体没有直
接抗体，只能采用此方法。 直接标记是在标记时加入连接着荧光素
单细胞悬液
胸水、腹水：胸、腹水50-100ml，加入1000U/ml 肝
素液，置于4℃ 冰箱中静置 6-12h
尿 液：收集24h 尿液，置4℃冰箱中自然沉淀 2h 冲洗液：300-500ml 生理盐水冲洗膀胱 ，冰箱内置 6-12h
间
标
羊抗兔
五、荧光标记
主要包括间接免疫荧光染色和直接免
疫荧光染色两种方法。 间接标记是采用特异的无荧光标记的一
四色分析：三色分析+ECD DNA含量分析： PI 凋亡与坏死分析： 凋亡用Annexin V-FITC/PI双染
四、标本的收集、单细胞悬液的制备
骨髓、外周血、细胞株、组织器官、 胸水、腹水、尿液脱落细胞等
1、骨髓及外周血细胞单细胞悬液的制备
骨髓及外周血都是天然的单个细胞，可直接标记， 再溶血。 单细胞的分离制备 分离液 离心 血液+生理盐水
二、流式细胞术的特点、优点
速度快 极短时间内可分析大量细胞，每秒可检测上万个 细胞，甚至几万个细胞。
多参数分析 可同时分析单个细胞的多种特性，获得单个细 胞多种信息，也可以根据其细胞表面标志的不同把 细胞群分为各亚群。
定性、定量分析细胞 通过荧光染色对单细胞的某些成分，如：DNA、 抗原或受体等进行定性、定量分析。 灵敏度高 荧光能检测到单个微粒上标有荧光分子少于 <600个 (如FITC或PE)；前向角检测到小于0.3um 颗粒。 分选感兴趣的细胞 纯度达99%，收获率可达90%。
流式细胞仪的构造工作原理及数据分析
流式细胞仪的流动室和液流驱动系统
流式细胞仪的构造工作原理及数据分 析
流式细胞仪的构造工作原理及数据分 析
• (二)激光光源与光束形成系统
流式细胞仪的构造工作原理及数据分 析
• 目前台式机FCM，大多采用氩离子气体 激光器。激光(laser)是—种相干光源， 它能提供单波长、高强度及稳定性高的 光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想 光源。由于细胞快速流动，每个细胞经 过光照区的时间仅为1μs左右，每个细 胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号 强弱，与被照射的时间和激发光的强度 有关，因此细胞需要足够的光照强度。
流式细胞仪的构造工作原理及数据分 析
• (2)侧向角散射：侧向角散射是指 与激光束正交90°方向的散射光 信号，侧向散射光对细胞膜、胞质、 核膜的折射率更为敏感，可提供有 关细胞内精细结构和颗粒性质的信 息。
流式细胞仪的构造工作原理及数据分 析
2．荧光信号
激光的作用原理
流式细胞仪的构造工作原理及数据分 析
流式细胞仪的构造工作原理及数据分 析
• 前向角散射光（FSC, Forward Scatter）
细胞相对大小及其表面积
• 侧向角散射（SSC, Side Scatter）
•
细胞粒度及细胞内相对复杂性
流式细胞仪的构造工作原理及数据分 析
• (1)前向角散射：前向角散射与被测细 胞的大小有关，确切地说，它与细胞 直径的平方值密切相关。通常在FCM 应用中，选取FSC作阈值，来排除样 品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒， 以避免对被测细胞的干扰。
流式细胞仪的构造工作 原理及数据分析
2024/2/1
流式细胞仪的构造工作原理及数据分 析
thermo流式细胞表面和细胞内染色方案
thermo流式细胞表面和细胞内染色方案流式细胞表面染色方案：1. 细胞准备：将待染色的细胞进行离心，去除培养基，用PBS缓冲液洗涤细胞2-3次，离心沉淀后去除上清液。
2. 细胞固定：将细胞用4%的冷甲醛溶液进行固定，固定时间一般为15-30分钟。
3. 细胞洗涤：用PBS缓冲液洗涤细胞2-3次，离心沉淀后去除上清液。
4. 细胞孵育：将细胞悬浮于含有特定抗体的PBS缓冲液中，孵育时间一般为30-60分钟。
5. 细胞洗涤：用PBS缓冲液洗涤细胞2-3次，离心沉淀后去除上清液。
6. 细胞荧光标记：将细胞悬浮于含有荧光标记的二抗的PBS缓冲液中，孵育时间一般为30-60分钟。
7. 细胞洗涤：用PBS缓冲液洗涤细胞2-3次，离心沉淀后去除上清液。
8. 细胞检测：将细胞悬浮于PBS缓冲液中，通过流式细胞仪进行细胞表面染色的检测。
流式细胞内染色方案：1. 细胞准备：将待染色的细胞进行离心，去除培养基，用PBS缓冲液洗涤细胞2-3次，离心沉淀后去除上清液。
2. 细胞固定和渗透：将细胞用4%的冷甲醛溶液进行固定，固定时间一般为15-30分钟。
然后使用0.1%的Triton X-100或0.5%的Saponin进行细胞渗透，渗透时间一般为10-20分钟。
3. 细胞洗涤：用PBS缓冲液洗涤细胞2-3次，离心沉淀后去除上清液。
4. 细胞孵育：将细胞悬浮于含有特定抗体的PBS缓冲液中，孵育时间一般为30-60分钟。
5. 细胞洗涤：用PBS缓冲液洗涤细胞2-3次，离心沉淀后去除上清液。
6. 细胞荧光标记：将细胞悬浮于含有荧光标记的二抗的PBS缓冲液中，孵育时间一般为30-60分钟。
7. 细胞洗涤：用PBS缓冲液洗涤细胞2-3次，离心沉淀后去除上清液。
8. 细胞检测：将细胞悬浮于PBS缓冲液中，通过流式细胞仪进行细胞内染色的检测。
流式细胞术详解
流式细胞术详解一. 流式细胞术概述流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,•它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。
它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA 含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。
在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。
国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D 公司)。
流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。
BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B-D•公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。
EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能,•多用于科学研究。
二.流式细胞仪主要技术指标1．流式细胞仪的分析速度：一般流式细胞仪每秒检测1000～ 5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。
2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。
3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～０.5μm。
4．流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，,一般流式细胞仪能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。
流式细胞术检验白血病的基本原理与流程
流式细胞术检验白血病的基本原理与流程Flow cytometry is a technique used to analyze the physical and chemical characteristics of particles in a fluid as it passes through at least one laser. 流式细胞术是一种用于分析液体中颗粒的物理和化学特征的技术，它通过至少一个激光来实现。
This technique is commonly used in the diagnosis of various medical conditions, including leukemia. 这种技术通常用于诊断多种疾病，包括白血病。
Flow cytometry is based on the principle that cells, when suspended in a fluid and passed through the path of a laser beam, scatter light in patterns that correlate with specific properties of the cells. 流式细胞术的基本原理是，当细胞悬浮在液体中，并通过激光束路径时，它们以与特定细胞特性相关的方式散射光线。
This allows for the identification and analysis of different types of cells, including cancerous cells. 这使得可以鉴定和分析不同类型的细胞，包括癌细胞。
In the context of leukemia, flow cytometry plays a crucial role in the diagnosis and classification of the disease. 在白血病的背景下，流式细胞术对于该疾病的诊断和分类起着至关重要的作用。
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详情请参见第32页内容。
样本制备
样本制备
细胞保护
2
红细胞裂解
2
固定和破膜
2
Dynabeads细胞分离
3
仪器设置和校准
仪器设置和校准
仪器校正
6
大小校准
6
细胞分选设置
7
补偿 调节
7
绝对细胞计数
10
抗原检测
一抗
12
荧光染料概述
12
抗体标记
15
二级检测
19
抗原检测
细胞分析
细胞分析
细胞活性
20
细胞增殖
22
细胞周期
24
细胞凋亡
25
其他细胞功能分析
28
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样本制备
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