流式细胞

1 、点图
纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量 参数,在图中每一个点代表一个细胞
2 、二维等高图
用等高线来表示细胞数，在一条等高线上细胞数相 同，不同的等高线上细胞数不同。
3 、假三维等高图
纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参 数,Z轴为细胞数。
(三) 三参数直方图
三维坐标匀为参数（散射光或荧光）而 非细胞数。
细胞碎片 细胞团块 离心漂洗 固定剂
（一）外周血淋巴细胞样品的制备
淋巴细胞分离液分离外周血中单个核细胞。 Ficoll,40kd，高密度，低渗透压，无毒性。 （比重为1.0177±0.001的分层液).
利用红细胞裂解液去除红细胞后，得到外周血 中所有白细胞的流式细胞分析的二维散色光点图
（二) 培养细胞的样品制备
F+P +PeCy5
F+P+APC
488
488 633
525、575、675
525、575、675 525 、 575 670
绿、橙、红色
绿、 橙红色、红色 绿色、橙色 红色
F+ ECD +PeCy5 488
(三) 细胞的自发荧光
FITC的激发 波长处于自发 荧光的光谱区 内，因此FITC 荧光易受自发 荧光的干扰。
90 Degree Light Scatter
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关.
前向散色光FSC
侧向散色光SSC
散射光的测定
利用前向角和 测向角散射光可 以把外周血白细 胞分成三群，淋 巴细胞、单核 细胞和粒细胞。
三 荧光测量
荧光检测器检测特定荧光的特定发射波长 （一）光信号测量
Sheath fluid
荧光信号
激光束
2、光学系统
激光、透镜组、光电倍增等。
Dichroic Filters
PMT
2
PMT 4
PMT
3
Flow cell
Bandpass Filters
PMT
1
Laser
（二） 基本工作原理
单细胞流：流动室
单细胞照明：激光
488 nm laser
单细胞检测：信号处理
(四）单细胞悬液的保存
防止细胞自溶，保持细胞膜原有的特性保存的方法：
1、深低温保存法：深低温冰箱，保存一年。
2、乙醇与甲醇保存法：70%冷乙醇、75%的甲醇。
3、甲醛或多聚甲醛固定法：细胞不具有生物活性，但
细胞表面荧光染色分析不受影响。
二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色
染料的选择和标记染色保证了荧光信号的产生 （一）免疫荧光标记最常用的荧光染料
Th细胞受损而导致全身免疫功能下降。
六、自身免疫性疾病相关HLA 抗原分析
强直性脊柱炎 HLA-B27/HLA-B7双标记 FCM检测：病人58%-97% 正常人仅2%-7%
（二） 双参数显示 （三） 三参数显示
(一) 单参数直方图的显示
Single-Parameter Histogram Displays
以分布直方图( distribution histogram )
来显示，横轴为该参数测量强度相对值，单位是 纵轴一般是细胞数或细胞出现的频数。
道数。强度分布可以是线性的，也可以是对数的。
（一）细胞介导细胞毒性试验 （二）细胞内细胞因子测定 小分子可溶性蛋白质 T细胞和巨噬细胞
参与细胞免疫、体液免疫、炎症反应、造血调控、
细胞增殖和分化、损伤修复重要生理和病理过程。
流式细胞细胞因子分析图
流式细胞细胞因子分析图
三、淋巴造血系统分化抗原 及白血病免疫分型
用多参数 FCM测定白血病免疫表型可以把病人
流式细胞仪 分析技术及应用
什么是流式细胞术(FCM)？
FCM是以流式细胞仪为检测手段的一项 能快速、精确的对单个细胞理化特性进
行多参数定量分析和分选的新技术。
特点:
单细胞的流动的 活细胞的 定量的 多参数的 高统计学精度的 分选细胞
第一节 流式细胞仪的分析及分选原理 第二节 数据的显示与分析
第三节 流式细胞仪分析的技术要求
单层培养细胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法 使细胞从培养皿上消化下来，然后离心漂洗。 悬浮培养细胞，可不用酶消化，直接吹打制备 成单细胞悬液。
(三)新鲜实体组织单细胞悬液的制备
机械法：剪碎法、网搓法、研磨法。 酶处理法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原酶等。
化学试剂处理法：EDTA、EGTA等。
表面活性剂处理法： Triton-100、皂素等。
（四）流式细胞仪的多参数分析
一般利用所得参数的两两组合并利用设门（Gate) 技术，来分析参数之间的相互关系。
1 、Region设置
2 、
Gate
设 置
第三节 流式细胞仪免疫分析的技术要求
样品制备：单细胞悬液
特定荧光染料的选择：光谱重叠
阴性对照的设置:检测标本的重复性
质量控制
一、免疫检测样品制备
机械法往往常成严重的细胞损伤，而结果却是 较低的细胞产量。 如用低速离心去碎片，用尼龙网过滤团块等， 也可利用电子学技术处理的方法排除团块和碎片 的干扰。 酶学法、化学法对实体组织的分散效果较理想， 但会造成所测化学成份的不良影响。FCM所测细胞 是单个分散状态；对细胞团块，细胞碎片尽可能 少；细胞的活性不受损害，以保证下一步的荧光 染色处理不受影响。
300 nm 400 nm 500 nm
Emisson
600 nm 700 nm
DNA
（ 二 ） 荧 光 补 偿
利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻 荧光通道的信号加以扣除的技术称“荧光补偿”
四 细胞分选原理
（一）分选的基本原理
488 nm laser
FALS Sensor Fluorescence detector
血液中幼稚的白血病细胞和正常的白细胞区分开。
根据白血病细胞所表达相关细胞的种系抗原，将
白血病细胞分为B细胞系(CD19,CD20),T细胞系
(CD7,CD3)，髓细胞系(CD13,CD33)以及红细胞系
(glycophorin A)和巨噬细胞系(CD61)。
幼稚白血病细 胞的表型分析
四、肿瘤耐药基因分析
(二）B淋巴细胞及其亚群
B细胞约为5%-10%，标志 为BCR，膜表面免疫球蛋白 （Smlg）。表达CD19、 CD20、CD21、CD22分子。 B细胞也是免疫系统重要 的免疫细胞，主要功能是 介导体液免疫。抗原递呈 细胞，能摄取、加工和递 呈抗，同时还能分泌细胞 因子调节免疫应答。
（三）NK细胞分析
三、流式细胞免疫学技术的质量控制
（一）单细胞悬液制备的质量控制
（二）细胞悬液免疫荧光染色的质量控制
1、温度对荧光染色的影响
2、pH对荧光发射强度的影响
3、荧光染料浓度的控制 4、固定剂对荧光染色的影响
（三）仪器操作技术的质量控制
（四）免疫检测的质量控制
1、同型对照：选用相同源性的未标记单抗作为
同型对照（阴性对照）
Charged Plates
-
+
Single cells sorted into test tubes
阳 性 选 择
阴 性 选 择
MACS-Magnetic Cell Sorting
磁 珠 分 离
（二）分选的技术要求
1 、分选速度：几千个细胞/秒
2 、分选纯度:99.5%左右
3 、分选收获率:90-95% 4 、分选得率
2、全程质控：在流式检测中，样品标记、溶血、 洗涤、仪器质量控制和上机检测的过程都会直接影 响检测结果。采用标准质控样品来进行全程质控， 使得同类实验室建立质控比对，数据可以互用。
第四节 流式细胞在免疫学检查中的应用
一、淋巴细胞及其亚群的分析
淋巴细胞是机体免疫系 统中的一群重要细胞群， 是参与免疫调节和执行细 胞免疫功能的免疫活性细 胞，T细胞、B细胞和NK 细胞，各自发挥不同的作 用。
X轴表示绿荧光信号(CD3)强弱,Y轴则反应细胞的数量.
(二)双参数数据的显示
Two-Parameter Data Displays
细胞双参数测定不仅能提供二个参数各自与细胞
数量的关系，更重要的是获得了这二个参数之间
的相关关系，其中包含了更多的生物学信息。双
参数数据显示最常用的是二维的散点图( Dot Plot )。在二维图上，横轴代表第一个测量参数， 纵轴代表第二个测量参数。
自然杀伤细胞（Natural killer cell,NK 细胞）为一 组大颗粒的淋巴细胞，5%-10% 左右，标志CD16、CD56、 CD2、CD11a/CD18。用三色荧光标记将CD3-CD16+CD56+淋巴 细胞定为NK细胞。主要功能是参与细胞免疫，在肿瘤免疫 抗病毒感染中均起重要作用。
二、淋巴细胞功能分析
第四节 流式细胞术在免疫学检查中应用
第一节 流式细胞仪的分析及分选原理 一 工作原理： FCM是一种在计算机技术支持下的高度
自动化的细胞显微荧光脉冲分光光度仪。
(一） 基本组成构
1、液流系统 样品流和鞘流
2、光学系统 激光、透镜组、 光电倍增管等。
3、数据处理系统
1、液流系统
样品流和鞘流
Injector Tip
在肿瘤病人使用化疗药物中，会产生药物的 耐受。当检测患者外周的淋巴细胞表达MDR阳
性细胞时，说明患者对化疗药物开始出现耐药性。
提示临床医生应更改治疗方案。
五、在AIDS病检测中的分析
艾滋病又称获得性免疫缺陷综合征
（acquired immune deficiency syndrome,AIDS)