流式细胞术基本原理详版(医学相关)
流式细胞术的基本原理
流式细胞术的基本原理流式细胞术是一种广泛使用的细胞分析技术，可以用于分离、鉴定和计数单个细胞，同时可以对细胞的形态、大小、表面分子、细胞器和细胞活性等方面进行分析。
这项技术已经成为生物医学研究和临床诊断的重要工具之一。
流式细胞术的基本原理是将细胞悬浮液通过一根细长的玻璃管，使细胞单个地通过一束激光束，利用光学和电子学技术分析细胞的特性。
这个过程可以分为样本制备、细胞计数和细胞分析三个步骤。
样本制备在进行流式细胞术之前，需要对样品进行一系列的处理，以便得到单个、均匀分布的细胞悬浮液。
样品处理的方法包括细胞分离、细胞培养和细胞染色等。
通常使用的染色剂有荧光素、荧光素同工异构体、荧光素酯和荧光素类核酸探针等。
这些染色剂能够与细胞特定的分子结合，从而标记细胞并使其在流式细胞术中被检测到。
细胞计数细胞计数是流式细胞术的重要步骤之一。
在流式细胞术中，使用一种称为细胞计数器的设备，可以精确地计算细胞的数量。
细胞计数器通常由一个光源、一个流式细胞术仪和一个计算机组成。
在进行细胞计数时，将细胞悬浮液置于流式细胞术仪中，通过一束激光束照射细胞，从而产生荧光信号。
计算机会根据荧光信号的数量和强度来确定细胞的数量。
细胞分析在细胞计数后，可以对细胞进行分析。
流式细胞术中常用的分析方法包括细胞分类、细胞分选和细胞表面分析等。
细胞分类是将细胞根据其形态、大小和荧光特性分为不同的亚群。
细胞分选是将目标细胞从混合的细胞群中分离出来。
细胞表面分析是通过标记细胞表面分子，然后利用流式细胞术检测这些标记物，以确定细胞的特殊表面分子。
总结流式细胞术作为一种高效的细胞分析技术，已经广泛应用于生物医学研究和临床诊断。
其基本原理是利用激光束对单个细胞进行分析，以确定细胞的特殊特性。
在进行流式细胞术前需要进行样品制备和细胞计数，然后可以对细胞进行分类、分选和表面分析等分析方法。
流式细胞术的应用范围广泛，可以用于癌症诊断、药物筛选和免疫学研究等领域。
流式细胞术之基本原理及运用
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1.3 流式细胞术光信号检测
光信号的类型 • 散射光信号：与标记荧光素无关，
是细胞的固有参数。 – 前向散射光(forward scatter, FSC); – 侧向散射光(side scatter, SSC).
• 荧光信号
– 自发荧光 ：微弱 – 特异荧光：标记的荧光素分子发出 的荧光，比自发荧光强很多倍。
FITC、Alexa Fluor 488 PE PI PE-Cy5、PerCP APC、AF647
FL3
FL4 640 FL10
• 多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素； 各个通道之间的荧光素可以随意搭配。
B 根据抗原表达强弱合理选择 抗体
• 不同的荧光素强度有所不同； • 高表达的抗原可用不太“亮” 的染料，更“亮”的荧光素分 配给表达低的抗原：
流式细胞仪的发展及商品化
• • • • • • • • 1934 Moldavanl: First try (固定式细胞分析-流动式)； 1953 Crosland-Taylor: 鞘流系统(解决难题)； 1956 Coulter原理(血细胞计数器)； 1965 Kamentsky: 分光光度计定量细胞成分和散射光应用； 1967 Kamentsky等设计了细胞分选的装置； 1969 Vandilla等: 第一台荧光检测细胞计(鞘流聚焦、激光)； 1972 斯坦福大学: 研制出荧光激活细胞分选仪(FACS)； 1973 BD公司与斯坦福大学合作，研制生产第一台商用流 式细胞仪-FACS Ⅰ。 • 1975 Kohler和Milstein: 单克隆抗体技术(促进流式发展)。
• 光路系统
– 激发光源 – 光束收集系统
• 电子系统
– 光电转换器 – 数据处理系统
流式细胞术原理及应用
流式细胞术原理及应用
流式细胞术是通过一种名为流式细胞仪的仪器完成的，它能够以非常
高的精确度进行分析和检测。
流式细胞仪通过一根轴，从这个轴上有三根
弹性管，细胞进行注射，从而使细胞在管中行进，细胞同时也受到外界信
号的影响，这种信号可以来自磁场、电场或光场。
当细胞运行到仪器的另
一端时，它们会被照亮，通过一台摄像机可以拍摄到高清晰度的照片，然
后在计算机上进行分析处理。
流式细胞术广泛应用于早筛检、医学诊断、药物发现、药理学实验和
抗生素耐药性研究等方面，它能够更加精确、快速地进行细胞分析。
此外，流式细胞术也可以用于分析抗原抗体，免疫细胞介导的反应，以及细胞因
子如细胞因子和表面受体等的表达情况。
这种技术还可以用来监测血液中细胞水平的变化，如血小板、红细胞、白细胞等。
流式细胞术原理
流式细胞术原理流式细胞术（Flow Cytometry）是一种用于分析和计数溶液中单个细胞的技术。
它结合了细胞生物学、免疫学和光学原理，可以对细胞的形态、大小、表面标记物、细胞内分子和细胞功能进行高度灵敏和高通量的检测。
流式细胞术在医学研究和临床诊断中被广泛应用，例如免疫表型分析、癌症诊断、染色体分析和细胞周期分析等。
流式细胞术的基本原理是将细胞溶液通过一个微小的流动池，细胞在流动池中被依次单个地通过一个激光束，同时检测和测量细胞的荧光信号和散射光。
这里主要介绍基于光散射和荧光信号的流式细胞术原理。
光散射是指细胞与入射光发生相互作用后，在各个方向上散射出的光。
光散射信号主要包括前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）。
前向散射光与细胞的大小相关，大细胞产生强烈的散射信号，小细胞产生较弱的散射信号。
侧向散射光与细胞的内部复杂性和粒子的复杂性相关，比如细胞的细胞器、蛋白质聚集体和细胞颗粒等。
荧光信号是基于染料的荧光分子在光激发下发射出的荧光信号。
细胞表面的抗原可以通过荧光标记的抗体进行特异性检测。
荧光染料可以与抗体结合，并通过激光的作用激发染料分子，产生荧光信号。
通过使用不同波长的激光器和荧光探针，可以同时检测多个不同的荧光信号。
为了实现对不同细胞类型的准确检测和计数，流式细胞仪使用光学系统和电子学系统进行信号采集和处理。
光学系统包括激光器、光学滤镜和光电二倍频管（PMT）。
激光器产生高能量、单色的激光束，通常使用激光器输出的可见光波长，如蓝色（488nm）、绿色（532nm）和红色（633nm）等。
光学滤镜用于选择和隔离特定波长范围的光信号。
PMT是用来接收荧光信号和散射光信号的光电器件，能够将光信号转换为可计量的电信号。
电子学系统包括脉冲幅度分析器、数据采集系统和计算机。
脉冲幅度分析器将接收到的电信号转换为数字信号，并分析信号的幅度、持续时间和频率等参数。
数据采集系统将脉冲信号转换为数字数据，并存储在计算机中。
流式细胞术基本原理_
流式细胞术基本原理_流式细胞术（flow cytometry）是一种通过激光照射、细胞荧光标记和单个细胞分析的技术，用于研究和识别细胞的性质和功能。
它可以分析多种类型的细胞，包括细菌、酵母、植物细胞和动物细胞。
流式细胞术具有高通量、快速并且可以同时分析多个参数等优势，因此被广泛应用于生物学研究、临床诊断和治疗等领域。
1.激光照射：流式细胞仪使用一束高能激光照射通过细胞悬液。
通常使用的激光有紫外线、蓝色、绿色和红色等多种波长。
激光束通过透镜系统聚焦，使细胞悬液中的细胞逐个经过照射点。
2.细胞荧光标记：在流式细胞仪实验前，细胞需要进行荧光染色，以便能够准确地测量和分析不同细胞参数。
荧光标记通常是通过将细胞与特定的标记分子（包括化学荧光染料、抗体或融合蛋白等）结合。
这些标记物可以与细胞的特定结构（如表面抗原、内源性蛋白等）相互作用，从而使细胞在流式细胞仪中发出荧光。
3. 光散射和荧光检测：经过激光照射后，细胞会散射光线。
光散射可以分为两种类型：前向散射（forward scatter，FSC）和侧向散射（side scatter，SSC）。
FSC反映细胞的大小，而SSC反映细胞的复杂性和内部结构。
同时，通过引入适当的滤光片和光学分束器，可以同时检测细胞所发出的荧光信号。
流式细胞仪通常具有多个荧光探测器，可以同时检测多个荧光染料。
4.数据分析：通过流式细胞仪获得的数据是复杂的多维数据，需要进行后续的数据分析和解释。
常见的数据分析方法包括数据精炼、数据规范化、聚类分析、细胞子群分析等。
可以通过计算机软件对数据进行处理和可视化，以获得有关细胞种群组成和特征的更深入的理解。
流式细胞术在许多研究领域和临床应用中发挥着重要作用。
例如，通过流式细胞术可以定量检测一些细胞亚群的数量和频率，用于检测和监测疾病的发生和发展，如肿瘤、免疫性疾病等。
此外，流式细胞术还可以用于筛选新药的有效性和安全性评估，以及研究细胞信号转导、基因表达和细胞分化等生物学过程。
简述流式细胞术的原理与应用
简述流式细胞术的原理与应用一、流式细胞术的原理介绍流式细胞术（Flow cytometry）是一种利用流式细胞术仪（Flow cytometer）对单个活细胞进行多参数分析的技术。
它基于细胞的光学性质和生物化学特性，通过探针标记、荧光染料和细胞表面抗原的相互作用，对细胞进行高速连续检测和分离。
流式细胞术的原理如下：1.细胞悬浮和样本处理：将细胞样品作为悬浮液，通过离心等方法将细胞分散在液体中，去除细胞的团块和碎片，保证单个细胞的流式检测。
2.细胞标记：采用流式细胞术特定的探针和染料对细胞进行标记，以便后续检测和分析。
常用的标记方法包括荧光染料标记、抗体标记和细胞分子探针标记。
3.细胞分离和传送：将标记的细胞悬浮液通过流式细胞术仪，以流速每秒数千个细胞的速度单个分子传送到探测点。
4.光散射与荧光探测：细胞经过流式细胞术仪后，以激光束照射细胞，通过散射光和荧光信号的检测，对细胞进行空间分布和化学信息的获得。
5.数据采集与分析：通过计算机系统采集和记录细胞经过流式细胞术仪后所产生的光散射和荧光信号，在分析软件中对数据进行处理和解读，获得有关细胞的信息。
二、流式细胞术的应用流式细胞术是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的技术，它在细胞学、免疫学、血液学、肿瘤学等领域有着重要的应用价值。
下面列举几个流式细胞术的应用示例：1.血液学研究：流式细胞术结合细胞表面标记和荧光染料标记，可以对血液中的不同细胞类型进行快速的鉴定和数量分析。
例如，通过流式细胞术可对血液中的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞等进行分类和计数，从而判断患者的免疫状态和疾病进展。
2.癌症诊断与治疗：流式细胞术对肿瘤细胞的检测和分析有着重要的作用。
通过流式细胞术，可以检测和定量肿瘤细胞的表面抗原和细胞内信号分子，进一步了解肿瘤细胞的类型、分化程度和增殖状态，为癌症的诊断和治疗提供指导。
3.免疫学研究：流式细胞术能够对免疫系统中的各种细胞类型进行鉴定、计数和功能分析。
FCM(流式细胞术检测)原理及临床应用
流式细胞术(flow cytometry FCM)是利用流式细 胞仪对单个生物颗粒(红细胞、白细胞、各类组织细 胞、血小板、微生物等)以及人工合成微球的物理和 生物学特性进行多参数定量分析，并能对特定细胞 群体加以分选的分析技术。
FCM的工作原理
流式细胞仪组成：
1.液流系统 2.光学系统 3.数据处理系统
双标记或多标记分析：目前使用的流式细胞仪 能用一个激光束激发检测三色甚至四色荧光信 号。检测时需注意荧光补偿。
常用免疫荧光染料组合
荧光染料 FITC+PE
激发波长 （nm）
488
发射波长（nm） 525、575
颜色 绿色、橙色
FITC+PeCy5
488
525、675
绿色、红色
FITC+ECD
488
实体瘤以多倍体居多；
G0 期：DNA 合成静止期 G1 期：DNA 合成前期 S 期： DNA 合成期 G2 期：DNA 合成后期 M 期： 细胞分裂期
DNA 倍体 2N 2N
2N-4N 4N 4N
DNA非2倍体出现是鉴别良性与恶性肿瘤的特异性指 标:
良性肿瘤和正常组织良性增生不出现DNA非2倍体细 胞而恶性肿瘤常可出现异倍体细胞；
过去认为 FCM测定残存白血病细胞不可靠， 因为现用的 McAb不能鉴别正常血细胞与白血 病细胞。虽然至今尚未发现白血病细胞特异抗 原，但近来有人提出根据白血病细胞的以下特 征， FCM检测的敏感度可明显提高
白血病细胞的某些抗原表达量明显高于相应 的正常血细胞
如小儿ALL，其CDl0+细胞的荧光强度可 高达3-4个对数值，而其 CD45则为弱阳性或 阴性。
525、625
流式细胞术基本原理与实用技术
流式细胞术基本原理与实用技术流式细胞术（Flow Cytometry）是一种常用的细胞分析技术，它基于光学、电子和计算机技术，能够对单个细胞进行快速、准确的多参数分析。
本文将介绍流式细胞术的基本原理和实用技术。
一、基本原理流式细胞术的基本原理是利用细胞在液体中悬浮的特性，在流动状态下通过一个细胞计数器，同时对细胞进行多参数的检测和分析。
其主要包括以下几个步骤：1. 细胞样品的制备：将待检测的细胞样品进行预处理，如离心、洗涤等，以获得单细胞悬浮液。
2. 细胞的进样：将细胞悬浮液通过微细管道进入流式细胞仪的流动系统中，形成单细胞的液体流。
3. 细胞的定位和聚焦：利用激光束对细胞进行定位和聚焦，使其逐个通过探测区域。
4. 细胞的激发和发射：通过激光束的照射，激发细胞中的荧光染料或标记物，使其发射特定波长的荧光信号。
5. 光信号的收集和处理：收集细胞发射的荧光信号，并经过光学系统进行分光、分束、分光和聚焦，最后通过光电倍增管或光电二极管转换为电信号。
6. 数据的获取和分析：将电信号转化为数字信号，并通过计算机系统进行数据采集、存储和分析，得到细胞的各项参数及相关统计学分析。
二、实用技术1. 细胞标记技术：为了能够准确地检测和分析细胞的特定性质，常常需要对细胞进行特异性的染色或标记。
常用的标记方法包括荧光染料、抗体标记和基因表达标记等。
2. 多参数分析技术：流式细胞术可以同时检测多个参数，如细胞大小、形态、表面标记物的表达、细胞周期等。
通过合理选择和配置荧光染料和滤光片组合，可以实现多重标记和多参数分析。
3. 数据分析软件：流式细胞术产生的数据量庞大，需要借助计算机软件进行数据的分析和解读。
常用的数据分析软件有FlowJo、CellQuest、ModFit等，它们可以对细胞的分布、比例、相关性等进行统计学分析和图形展示。
4. 高通量流式技术：随着科学研究的深入和技术的发展，高通量流式技术逐渐兴起。
它通过提高仪器的样品处理速度和自动化程度，实现对大量样品的快速检测和分析，广泛应用于生物医学研究和临床诊断。
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两者相结合就能说明 细胞种类
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二维等高图和密度图
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Pseudo 3D Plot 假三维图与三维图
15
3Dห้องสมุดไป่ตู้Plot
流式细胞仪如何获取细胞信号？
—FSC —SSC —FL
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— 前向角信号（Forward Scatter，FSC）
—吸收某一波长的光波后能发射出大于吸收光波 长的光波的物质
488n
激发光
>600nm
PI
26
荧光染料种类
荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途
FITC
488
525
免疫荧光
PE(RD1) 488
575
免疫荧光
PerCP 488
670
免疫荧光
PI
488
620
DNA染色
ECD
488
620
免疫荧光
阴性对照
理想状态
实际情况
补偿效果
46
阈值
— 信号放大过程会产生不需要的脉冲信号，通常来自于
碎片。通过设定某一信号的最低强度值，可将不需要
的脉冲信号去除，这一设定值称为阈值。
屏蔽噪音信号和碎片信号
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门（Gate）
— 分析/分选感兴趣的细胞群
48
对照
— 同型对照：为没有特异性、与荧光抗体蛋白亚型一致 的免疫球蛋白，通常是未进行免疫小鼠血清的纯化 IgG1或IgG2，用于检测和消除（一抗）非特异性结合 到组织细胞而产生的背景染色。
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电脉冲信号类型
—将与电脉冲信号 强弱相关的电压 数字化
—有三类电脉冲信号 – 高度信号H – 面积信号A – 宽度信号W
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CV值
CV值（变异系数）： 样品均一度及仪器分辨率的标志
CV值一般<2%
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样本流速
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样本流速选择
—高流速：一般用于定性分析，如免疫分型。采 集速度快,但分辨率低.
— 空白对照：即不进行标记的细胞。主要用于确定待测 标本的基础荧光阈值或检测染色方法时候成功。
PeCy5 488
675
免疫荧光
APC
633
670
免疫荧光
DAPI
359
462
DNA染色
颜色 绿色 橙色 红色 橙红 橙红 红色 红色 蓝色
27
荧光染料光谱特征
28
荧光分离原则
— 在流式细胞仪中，一般经过LP或SP滤片将荧光大 致分开后，再经过一BP滤片分离出特征荧光
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流式细胞仪的光路
开放式光路 Calibur、Influx
研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加 以定量
2
流式细胞仪的特点
单个细胞/生物颗粒分析 同时多参数、多荧光分析 高通量检测/高速度 10000个细胞/秒以上 定性/定量分析 分选特定性状或功能的细胞 可检测的样本种类多样
(1)外周血，骨髓，细针穿刺，洗脱液，实体 组织，培养细胞 (2)血清、血浆、培养上清、细胞裂解液
- Charged Plates
+
Single cells sorted into test tubes
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几个概念
信号放大模式 信号类型 CV值 样本流速 激光延迟 液滴延迟 荧光补偿 阈值 门 对照
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—信号放大
– PMT将光信号转换成电信号，调整PMT的电压， 信号强度将随之改变
—前向角散射信号（FSC） 反映细胞大小
—侧向角散射信号（SSC） 反映细胞颗粒度
—荧光信号（FL Signals）（FL1、2、3……） 胞内、胞外染色情况
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流式细胞仪显示图的种类
FSC和SSC 直方图
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散点图
把前向散射光图和侧 向散射光图的一维图 像在二维图像上投影， 便是我们平常所看到 的流式图。
光信号
光电倍增管（PMT）
电信号
放大器
放大器两种放大方式： 线性放大（lin） 对数放大（log）
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线性放大（lin）
—按光强度的线性关系输出信号.适用于在较小 范围内变化的信号以及代表生物过程的信号， 如DNA含量、总蛋白含量等。
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对数放大（log）
—按光强度的对数关系输出信号.在免疫学测量 中通常使用对数放大。
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封闭式光路（CantoⅡ、LSR系列、Aria系列）
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分选
—将目标细胞 分离并富集 ，进行后续 研究。
—分选纯度 >99%
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震荡
激光
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偏转板
Fluorescence Activated Cell Sorting
488 nm laser
FALS Sensor Fluorescence detector
流式细胞术基本原理
陈晓东 产品技术专员
广州市珈源医学试剂有限公司
流式细胞术
流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种 可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒 （通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特 定群体加以分选
研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生 物、及人工合成微球等
Injector Tip
鞘液
荧光信号 聚焦的激光光束
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光学滤片
— 当光子遇到滤片时，光子或通过滤片，或被滤片吸收 ，或被滤片反射。
8
光学滤片的种类
长通滤片（LP）：630LP 短通滤片（SP）：550SP 带通滤片（BP）: 488/10
9
10
流式细胞仪可获取的信号种类
共有两类：散射信号与荧光信号
—低流速：一般用于对分辨率要求较高的分析， 如DNA分析。
42
激光延迟（laser delay）
Laser 1 Laser 2
43
液滴延迟（drop delay）
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颜色补偿
—采用合适的方法校正荧光染料之间叠加所造成 的误差。在完成双色以上荧光标记的样本时， 都需要作颜色补偿。
45
—FITC主要由FITC的检测器检测，但部分光也会 进入PE检测器。如果单染FITC，同时打开PE检 测器，则如图：
3
目前流式细胞仪可以检测的类别
细菌
浮游生物
红细胞
DM：0.2μ m ——15μ m
单核细胞
4
淋巴细胞 中性粒细胞
5
流式细胞仪的基本构造
流动室与液流系统：将 细胞单个压入流动室
光学滤镜
信号收集与数据 处理系统
激光发射器 发出所需要的波长的激光
光源与光学系统
侧向散射光检测器
前向散射光检测器
6
流动室
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前向角信号：细胞的大小
18
10
1000
Count Count
FSC
19
FSC
— 侧向角信号（Side Scatter， SSC）
20
10
1000
Count Count
SSC
21
SSC
FL
22
count
FL
23
FSC、SSC、FL
24
如何分离90°角内的各种荧光信号？
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荧光染料