流式细胞仪结果分析
sybergreen流式细胞结果解读
Sybergreen流式细胞仪是一种用于检测细胞遗传学和细胞分化的先进工具，其结果解读需要结合实验的具体情况以及相关知识和技能。
首先，Sybergreen流式细胞仪主要用于检测细胞内Syber Green I染料标记的DNA的荧光强度，从而确定细胞的DNA倍体和细胞类型。
在正常的情况下，二倍体细胞和单倍体细胞的荧光强度会有明显的差异，而异常倍体细胞的荧光强度可能会下降。
因此，Sybergreen流式细胞仪结果通常会显示不同倍体细胞的荧光强度分布图。
其次，对于结果的分析，需要注意以下几点：
1. 阳性细胞数量：观察荧光强度分布图中的阳性细胞数量，如果数量较多，则说明该指标在某些细胞中存在异常。
2. 倍体类型：观察荧光强度分布图中的各倍体类型的比例，如果某一种异常倍体细胞的荧光强度明显高于其他倍体类型，则说明该异常倍体细胞的数量较多。
3. 阳性细胞的形态：在观察异常细胞时，需要注意阳性细胞的形态是否与正常细胞存在差异。
异常细胞的数量增多时，需要观察是否有一些特殊形态的细胞出现。
在具体的应用中，Sybergreen流式细胞仪可以用于检测肿瘤细胞的DNA倍体和增殖活性，从而判断肿瘤的恶性程度、患者的预后以及治疗效果等。
同时，该仪器还可以用于干细胞研究、组织分化研究等领域。
但是需要注意的是，在解读Sybergreen流式细胞仪结果时，需要结合患者的临床资料、病理诊断、免疫组化染色以及其他检测结果等进行综合分析。
综上所述，解读Sybergreen流式细胞仪结果需要具备一定的细胞遗传学和流式细胞仪方面的知识，并结合患者的具体情况进行分析。
只有在充分理解实验数据的基础上，才能准确地评估病情、制定治疗方案和评估治疗效果。
最详细的流式细胞仪实验方法
流式细胞仪实验方法一、实验准备1．标本制备：2．最小化非特异性结合：二、凋亡1．凋亡的检测方法：网站和其它2．PI染色法3．Annexin V 法4．TUNNEL法三、细胞因子1．激活的细胞因子2．CBA四、血小板1．活化2．活化检测3．网织血小板五、红细胞1．网织红细胞2．PNH3．胎儿红细胞六、肿瘤学1．DNA 细胞周期2．蛋白3．多药耐药4．微小残留白血病第一部分标本处理一、流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。
孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。
本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。
虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。
(二)间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。
本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。
但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。
所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。
另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。
二、最小化非特异性结合的方法1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。
2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。
流式细胞术分析PMA诱导THP1分化为巨噬细胞的表型特征
流式细胞术分析PMA诱导THP1分化为巨噬细胞的表型特征一、本文概述流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种在液流中快速分析单个细胞的多参数特性的强大技术。
该技术通过标记特异性抗体与细胞表面或内部抗原的结合，结合流式细胞仪的高通量分析能力，使我们能够精确测量细胞群体的表型特征。
在生物医学研究中，流式细胞术广泛应用于细胞分化、细胞周期、细胞凋亡、信号转导等多个领域。
本文旨在利用流式细胞术分析佛波酯（Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）诱导人急性单核细胞白血病细胞系THP-1分化为巨噬细胞的表型特征。
我们将通过流式细胞术检测分化过程中细胞表面标志物的表达变化，如CDCD68等，以及细胞内分子如肿瘤坏死因子TNF-α、白介素IL-1β等的表达情况，从而全面揭示PMA诱导THP-1细胞向巨噬细胞分化的分子机制。
通过本文的研究，我们期望能够为深入理解巨噬细胞分化过程中的分子事件提供新的视角，并为开发针对巨噬细胞相关疾病的治疗策略提供理论依据。
本文还将探讨流式细胞术在细胞分化研究中的应用价值，以期为生物医学领域的研究人员提供有益的参考。
二、材料与方法1 细胞系：人单核细胞系THP-1，购自美国ATCC（American Type Culture Collection）。
2 试剂：佛波酯（Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA），购自Sigma-Aldrich公司；RPMI 1640培养基、胎牛血清（FBS）、青霉素/链霉素双抗，购自Gibco公司；流式细胞术抗体，包括但不限于CDCDHLA-DR等，购自BD Biosciences或eBioscience公司。
3 仪器：流式细胞仪（如FACS Canto II，BD Biosciences）；二氧化碳培养箱；离心机；倒置显微镜。
1 细胞培养：THP-1细胞在含有10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素双抗的RPMI 1640培养基中，于37℃、5% CO2的条件下培养。
流式细胞仪数据分析
流式细胞仪数据分析5.1 数据采集及显示光信号转换成电压脉冲后，再通过模数转换器转换成为计算机可以储存处理的数字信号。
流式细胞仪的数据以FSC标准格式存储，该标准由“分析细胞学协会〞制定。
根据FSC标准，数据存储格式应包括三个文件：样本获取文件，数据设置文件和数据分析结果。
4参数〔FSC，SSC，FITC和PE〕的单细胞分析会生成8位数据。
当单个样品累计搜集到10000个细胞时，FCS数据文件为80kB。
数据采集存储完毕后，细胞亚群可以几种不同格式显示。
单参数如FSC或FITC〔FL1〕可使用直方图，横轴表示荧光通道。
纵轴表示在该通道内搜集到的细胞数量〔如图5-1〕。
处在同一通道的每一细胞均符合该通道的信号值，而且具有一样的信号密度。
通道右侧信号的荧光强度明显高于左侧，越靠右侧荧光亮度越强。
图5-1 流式数据分析图双参数可在二维散点图中同时显示，X轴显示通道1〔FL1〕，Y轴显示通道2〔FL2〕。
3维图通过X，Y，Z三个轴分别显示每个通道的细胞量〔如图5-1〕。
习题：数据采集及显示1 在直方图中横轴和纵轴分别表示。
2 二维点图用于显示参数。
3 在CellQuest软件中3维图中Z轴代表。
5.2 设门通过设门的方法可以定义细胞亚群的区域。
如：血样本是混合细胞群，假如想单独分析淋巴球细胞，可根据FSC或细胞大小，在FSC，SSC的散点图中设门，其数据结果只反映淋巴细胞亚群的荧光特性。
图5-2 全血样本中淋巴细胞亚群的数据分析图习题：设门1 设门的方法通常用于分析样本内的指定细胞。
〔对错〕5.3 细胞亚群的数据分析数据分析包括从点图中的list-mode文件中显示数据,然后统计点图中的细胞分布情况。
如前所述，分别有几种形式的点图用于显示数据，而且可通过设门的方法区分指定的细胞亚群。
如图5-3所示，在淋巴细胞亚群周围设门，以单独分析或分选该亚群细胞。
图5-3 选定淋巴细胞亚群设门门内细胞的数据结果可在随后的图中显示。
流式细胞分析技术
ü 光电倍增管（PMT）：
检测散射光和荧光；同时将光学信号转换成 电脉 冲信号。
14
滤光片
分色反光镜
15
PMT 滤光片
荧光和散射光检 测系统
分色反光镜
激发光
激光聚光系统
16
数据处理系统
• 计算机及其软件组成 • 进行实验数据的分析、存储、显示
Photons/Detector (V)
光信号转化为电脉冲信号
特点：单细胞、快速、高通量、多参数、准确、灵敏
经典流式细胞仪（分析型和分选型） 量化成像分析流式细胞仪 质谱流式细胞仪
单激发光；4个 荧光检测通道
经典流式细胞仪
双激发光；6个 荧光检测通道
Coulter EPICS XL
6
量化成像分析流式细胞仪
美国merck millipore公司
质谱流式细胞仪
11
经典流式细胞仪
液流系统-液流聚焦原理
喷 嘴
鞘液(Sheath）
喷嘴
荧光信号或 侧向散射光
样本流
前向散射光 单个细胞流
12
液流系统形成单 个细胞流示意图
13
光路系统
ü 激发光：
常用的是空冷式的氩离子激光光源（488nm）；氦氖 激光光源（633nm)；紫外光源
ü 各种光学镜片：
分色反光镜 光束成形器；透镜 滤光片：长通滤片；短通滤片；带通滤片
(一）标本采集、运输、保存和操作 l标本来源
l几乎所有组织细胞均可用于FCM检测 l免疫标本主要来源于外周血、骨髓、 淋巴器官或组织等
l抗凝剂选择
l肝素钠(首选) lEDTA-Na2
l标本保存
标本制备
ü 外周血或骨髓样本
不同流式细胞分析仪检测淋巴细胞亚群的比较研究重点
ｏｆ ＭｅｄｉｃｉＭ，Ｓｈａｎｇｈａｉ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏ凡ｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：Ｓｈｅｎ Ｌｉｓｏｎｇ，Ｅｍａｉｌ：ｆｉｓｏｎｇｓｈｅｎ＠ｈｏｔｍａｉＬ ｃｏｍ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｃｙ ａｍｏｎｇ ３ ｂｒａｎｄｓ ｏｆ ｆｌｏｗ ｅｙｔｏｍｅｔｅｒｓ （ＢｒｉＣｙｔｅ Ｅ６，ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏⅡａｎｄ Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＦＣ ５００）ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｓｕｂｓｅｔｓ． Ｍｅｔｈｏｔｉｓ Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，ｔｈｅ ＢｒｉＣｙｔｅ Ｅ６ ｗａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ２ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒｓ ｃｏｍｍｏｎｌｙ
ｗａｓ
ｎｏ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｅｅ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ３ ｆｌｏｗ ｃ”ｏｍｅｔｅｒｓ（Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ
ａｒｅ
４．２４２。３．９１６．０．８５２．
２．５９５，１．８３５ ａｎｄ ０．５７８，Ｐ＝０．１１９ ９，０．１４１ ２，０．６５３ ２，０．２７３ ３，０．３９９ ６，０．７４９ ０．ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ Ｅ６ ｍａｙ ｂｅ
Ｍｅ４ ２０１６，３９：３６１－３６５）
Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ；Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｓｕｂｓｅｔｓ；Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ Ｆｕｎｄ ｐｒｏｇｒａｍ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎａ（８１３０１７８８）
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】
２、０．０２７、０．０００ ４、
流式细胞仪结果分析
双 参 数 散 点 图 分 析
散点图
等高线图
密度图
FCM的主要测定指标：FSC, SSC, FL1, FL2, FL3 (FL4)
FCM标记方法
单标：一种单抗/tube--FL1, FSC, SSC（三参数）
双标：两种单抗/tube--FL1, FL2, FSC, SSC（四参数）
三/四标：三种单抗/tube、四种单抗/tube--FL1-FL3/4, FSC, SSC
……
1. 上机检测
单色/双色/多色样本 参数调节
电压、阈值、设门、补偿
2. 细胞分选 3. 细胞表面和胞内标志检测 4. 细胞周期(PI单染) 5. 细胞凋亡（Annexin V与PI双染）
举例：FACS Calibur可检测FL1-4四个通道的4个颜色
检测器组 所需探测器 （激光器） （PMT）位置
流式细胞仪分析细胞周期
依据细胞DNA含量（横坐标）： G1期：DNA复制还没开始，
也 是 DNA 含 量 最 少 的 ， 即 流 式 检测结果图的第一个峰；
S期：DNA开始复制，到完 成 复 制 ， 是 一 个 一 倍 DNA 到 二 倍 DNA 的 过 程 ， 在 流 式 结 果 图
中显示期跨度特别大（第二个 不高但很宽的峰）；
“设门”就是确定阳性细胞群，去除散点部分。
指在细胞分布图中，根据该图的细胞群分布选定其中
想要分析的特定细胞群（细胞基本来自于同一状态，有数据显示
1. 直方图（Histogram）
可比较性）。通过“设门”得到不同的区域，从而对 其中的细胞进行单参数或多参数分析。
设门是流式细胞仪分析中的一种重要技术，只有
颗粒杂质、气泡 对检测的影响
细胞功能的流式细胞仪检测
细胞功能的流式细胞仪检测细胞功能检查在近几年来由于流式细胞仪技术的开展有了很大的提高，不同于其它技术，最大的一点在于流式细胞仪能快速、定量地检测，分析单个不同细胞的功能，并且获得大量同一细胞或不同细胞总体的状况，也就是说常规的一些标本检测即可满足多人份的不同细胞群体的检查结果。
本章节主要涉及的是吞噬细胞（包括巨噬细胞和多形核细胞）。
影响吞噬细胞的数量和功能的因素很多，其中包括各种药物作用，例如皮质类固醇药物常常引起循环血液中白细胞数量的升高，其机理是主要促进骨髓中的白细胞释放，同时降低白细胞粘附血管内皮的能力至减少了白细胞的血管外移，还有轻℃提高了白细胞在循环血液中的半衰期。
正常情况下，中性粒细胞在骨髓中需5-7天后释放至循环血液中，其半衰期仅为7h，当趋向和进入各种组织中，在1至2天内发挥其生理功能，最终不管其功能状况如何（静止或激活），主要经过巨噬细胞的吞噬和粘膜表面的降解来完成。
由于中性粒细胞在人体中数量大、半衰期短，在微环境中稍微有变化，即会产生一些复杂的生理作用。
本节目的是介绍用流式细胞仪检测及阐述中性粒细胞和巨噬细胞的功能。
吞噬功能一般来说，吞噬过程大致分为几步：首先是识别，然后相互间接触、结合，最后才是内吞与消化。
其中关键的一步在于它们之间的正常接触。
当机体调理作用的紊乱和吞噬细胞的分解作用的缺陷，常引起吞噬的异常现象。
介导吞噬的细胞表面受体主要是C3b(CR)和FcR 受体。
Bassoe和 Berbnes运用流式细胞法很好地分析了细菌吞噬现象，指出流式细胞仪测定的两大优点：1. 要求的细胞数量相对较少；2. 白细胞分离步骤不多。
因此它特别适用于儿童等低年龄患者。
其检测原理是利用吞噬细胞内吞标记了FITC的细菌，并且保持吞噬细胞细胞膜的完整性，使后加入的EB染料只能结合未被吞噬的细菌，这样通过流式细胞仪可以区分已吞噬细菌和末吞噬细菌的吞噬细胞等情况。
应用流式细胞仪检测吞噬功能的方案很多，依据被用来内吞的微粒不同而言。
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流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式细胞仪为检测手段的 一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析 和分选的新技术。
流式细胞术的特点
流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及 细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下， 通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种 信号对细胞进行定量分析或纯化分选。
SS and FL Detector
FS Detector
Laser
（3）数据处理系统
主要由计算机及其软件组成
基本工作原理
基本过程
已标记的单细 硅化管 胞悬液和鞘液
流动室 形成稳态 喷嘴 水平激光与之 荧光染料被
单细胞液柱
垂直相交 激发发光
荧光检测系统和
收集光信号 光电倍增管
放大 脉冲信号
散射光感受系统
含细胞的液滴 充电
偏转落入收集器
（二）分选的技术要求
• 分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中 细胞的含量成正比。 • 分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的百 分率。 • 分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点 的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。 • 分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的 总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与 分选速度成反比。
• 单参数直方图 • 双参数直方图:点图
二维等高图 假三维等高图 • 三参数直方图 • 多参数分析
设门分析:REGION和GATE设置
（一）单参数直方图
由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映 同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。
细 胞 相 对 数 量
信道 (channel )
胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。
前向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细 胞时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内部 结构属性。
侧向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
测得的FS与SS信 号通过计算机处理， 可得到FS-SS图，由此 可仅用散射光信号对 未染色的活细胞进行 分析或分选。
层流水力聚焦技术
光学系统
—Light scattering at FSC represents the particle size and area
—Light scattering at SSC depends on granularity and complexity of the particle
第二节 数据的显示与分析
• 参数：FS,SS,FL • 数据显示方式 （单参数直方图 、双参数散点图 、二维
等高图 、假三维等高图 、三参数散点图 ） • 设门分析技术
一、 参数
FS：反映颗粒的大小 SS：反映颗粒的内部结构复杂程度 FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少
二、数据显示方式
直分析方图
此为血细胞分类 的基本原理，但不能 分析表面分子。
单核细胞
中性粒细胞
淋巴细胞
光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群
三、荧光测量
• 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发 后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。 • 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波 长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信 号区分开，送入不同的光电倍增管。 • 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多 个不同特征。 • 线性放大器和对数放大器
样本来源：各种细胞（如外周血，骨髓， 实体组织、悬浮或贴壁培养的细胞），微 生物，人工合成微球等。 检测大小：一般是0.5um～40um
流式细胞仪的组成
液流系统 光学系统 数据处理系统
分选系统
分析型流式细胞 仪
分选型流式细胞仪
（1液）液流流 系统
流动室
流动室（Flow cell）是液流系统的核心部件，流动室是 由石英玻璃制成，单细胞悬液在流动室里被鞘液流包绕 通过流动室内一定孔径的孔，检测区在该孔的中心，细 胞在此与激光垂直相交。
荧光染料的特性
•激发波长(EXCITING) •发射波长(EMISSION)
荧光补偿
四、细胞分选原理
通过流式细胞仪进行细胞分选 主要是在对具有某种特征的细胞需 进一步培养和研究时进行的。
（一）分选基本原理
细胞悬液形成液流柱 压电晶体 产生机械振动
流动室振动
液流断裂成液滴
空白液滴 不充电
弃去
单参数直方图
（二）双参数直方图
• 双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数， 根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。
• 双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每 个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强 度的颗粒数量的多少。
1.双参数直方图点图
红 色 荧 光 强 度
绿色荧光强度
双参数直方图点图
2. 二维等高图
• 由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。 • 等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等
计算机系统 分析结果
二、散射光的测定
细胞在液柱中与激光束相交时 向周围360°立体角方向散射的光线 信号，它的强弱与细胞的大小、形 状、胞内颗粒折射等有关，主要分
为前向散射光和侧向散射光。
前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光 以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细
光学系统
• 激光光源：气冷式氩离子激光器
• 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长
• 光束成形器：两十字交叉放置的透镜
• 透镜组：形成平行光，除去室内光
• 滤片：长通、短通、带通
• 光电倍增管：FS, SS（散射光）， （荧光）
FL1, FL2, FL3, FL4
光学系统示意图Flow 源自ip特点：检测速度快、检测通量高、单细胞多参数的检测
流式流式细胞仪仪
流式细胞仪 流式细胞仪 流式细胞仪
流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞
分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来
的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、
DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分
类收集的高技术。
流式细胞仪可以做什么？