流式细胞仪实验方法及常见问题分析
流式检测上机前细胞处理流程与注意事项
流式检测上机前细胞处理流程与注意事项流式细胞检测是一种常见的细胞学技术，用于研究和分析细胞的表型特征。
流式细胞检测通常包括细胞样品的处理、染色和分析等步骤。
下面将介绍流式检测上机前的细胞处理流程及注意事项。
流式细胞检测的基本流程包括：细胞样品制备、细胞染色、样本处理与检测。
在上机前的细胞处理阶段，需要进行以下步骤：1.细胞培养和扩增：首先，选择所需的细胞系进行培养和扩增。
细胞应该在适当的培养基和培养条件下生长，并保持细胞的活性和稳定性。
2.细胞收获：当细胞达到适当的生长状态后，使用适当的方法（例如胰蛋白酶消化、细胞刮取等）将细胞从培养瓶中收获。
3.细胞计数和离心：将收获的细胞进行计数，以确定要投入到流式细胞仪中的细胞数量。
通常使用血球计数板或自动细胞计数仪进行计数。
然后，用适当的速度进行离心，以收集和清洗细胞。
4.细胞固定和渗透化：对细胞进行固定和渗透化处理，以保持细胞在染色过程中的形态和结构。
常用的方法包括用乙醇固定和洗涤溶液进行渗透化处理。
5.抗体染色：根据研究的目的和需要，选择适当的标记抗体对细胞样品进行染色。
可以选择直接染色或间接染色方法，通过荧光标记的抗体对特定的细胞表面标记物或细胞内标记物进行检测。
6.控制样品的制备：在流式细胞检测中，为了进行质量控制和校准，需要准备确定性阳性和阴性对照样品。
阳性对照样品含有已知的标记物，用于评估流式细胞仪的性能和染色的品质。
注意事项：1.选择适当的细胞培养条件：细胞培养的条件对于细胞的生长和功能非常重要。
细胞应在适当的培养基和培养条件下生长，并定期检查细胞的健康状态。
2.加入适量的细胞：投入到流式细胞仪中的细胞数量应根据实验需要和仪器的要求来确定，过多或过少的细胞都会对结果产生影响。
3.使用合适的固定和渗透化方法：细胞固定和渗透化处理要严格按照方法的要求进行，以确保细胞在染色过程中保持完整和稳定。
4.选择适当的抗体和染色方案：根据研究的目的和需要选择合适的抗体和染色方案。
最详细的流式细胞仪实验方法
最详细的流式细胞仪实验方法流式细胞仪（Flow cytometry）是一种高精度的细胞分析技术，可用于快速鉴定和分离多种类型的细胞。
本文将介绍一种常用的流式细胞仪实验方法，包括样品准备、细胞染色、细胞分析和数据分析等步骤。
一、样品准备1.收集细胞：制备单细胞悬液，如细胞培养物等。
2.细胞计数：使用细胞计数器或血细胞计数板等工具，计算细胞密度。
3. 调整浓度：根据流式细胞仪系统的要求，将细胞悬液的浓度调整至适当的浓度（一般建议在1×10^5至1×10^6个细胞/ ml之间）。
二、细胞染色1.封闭非特异结合位点：为了减少非特异性结合，可使用FBS（胎牛血清）或BSA（牛血清蛋白）等以阻断非特异位点。
2.添加荧光染料：选择合适的染料，如草酰胺（CFSE）、丙酮染料(ATTO)或FITC等。
按照厂家说明书中建议的浓度将染料添加到样品中，好洗脱或者可用来鉴定细胞的抗体，如表面标记、核酸染色剂或功能性抗体。
3.染色溶液：在4°C下孵育细胞悬液至少30分钟（具体时间根据实验需要决定）。
4.洗涤：向样本管中加入足够的缓冲液，使细胞悬液稀释五倍，并离心沉积细胞。
5.弃去上清液：将上清液弃去，然后用足够的缓冲液再次洗涤沉积的细胞。
6.重悬：向样品管中加入适量的缓冲液，使细胞形成合适的细胞密度。
三、设置流式细胞仪1.打开仪器：确保仪器已开启并运行正常，各通道和检测器已连接好，并预热至适当温度。
2.校正：根据仪器的手册，对流式细胞仪进行校正和标定，以确保流式细胞仪的准确性和稳定性。
3.样品管固定：将样品管插入到流式细胞仪中相应的槽中，以确保准确读取。
4.设置参数：在计算机或流式细胞仪仪器的界面上设置所需参数，如细胞个数、细胞染色等。
四、细胞分析1.利用流式细胞仪：启动流式细胞仪软件，并确保硬件与软件连接正常。
2.定位细胞：在细胞分析开始前，调整激光位置和侦测器的灵敏度，以确保对准确获取细胞。
流式细胞仪及流式细胞术
流式细胞仪及流式细胞术流式细胞仪技术流式细胞仪技术，主要是测量群体中单个细胞经适当染色后其成分所发出的散射光和荧光，经染色的细胞在悬液中以单行流过高强度光源的焦点，当每个细胞经过焦点时，发出一束散射光/或荧光。
它们经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器(光电倍增管或一个固态装置)，光检测器把散射光定量转化成电信号，经数字转换器进行数字化后而成整数，然后进行电子存储，以后数据可以调出显示和进行分析。
其优点如下：1、具有操作简便，只要将染色的单个细胞推入仪器中，就会得出数据。
2、具有较高的灵敏度及测定速度，而且每次可测出许多数据，一般情况下，每秒可测5000个细胞，能迅速分析和记数大量细胞，并能准确统计群体中荧光标记细胞的比例。
3、应用广泛，即可用于测定细胞活力、繁殖周期和细胞定型分析，也可区别死亡细胞、分裂细胞和静止细胞群，既可测定DNA和RNA、测凋亡峰，又可测蛋白含量，特别是胞浆蛋白。
基本流程原理：1、将待测细胞染色后制成单细胞悬液，用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定的角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。
2、流式细胞仪通常以激光作为发光源。
经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。
这两种信号同时被前向光电二极管和90度方向的光电倍增管接收。
散射光不依赖任何细胞样品的制备技术，被称为细胞的物理参数或固有参数，散射光有包括前向角散射和侧向叫散射，前向角散射与被测细胞直径的平方密切相关，侧向角散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信号。
荧光信号也有两种，一种是细胞自身在激光照射下发出的微弱荧光信号，另一种是经过特异荧光素标记后的细胞受激发照射后得到的荧光信号。
流式细胞仪使用注意事项
流式细胞仪使用注意事项流式细胞仪是一种现代化的生物技术仪器，可以快速、准确地进行单个细胞的分析和分类，被广泛应用于生命科学、医学、药物研发等领域。
然而，由于其操作复杂、灵敏度高、易受污染等特点，使用过程中需要注意一些细节和技巧，以确保数据的准确性和可靠性。
本文将从以下几个方面介绍流式细胞仪的使用注意事项。
一、仪器准备在使用流式细胞仪前，需要对仪器进行一系列准备工作，包括检查仪器是否正常、清洁仪器表面、校准仪器参数等。
具体步骤如下： 1. 检查仪器是否正常：首先检查仪器的电源、冷却系统、激光器、光路等部件是否正常运转，确保仪器处于良好的工作状态。
2. 清洁仪器表面：使用干净柔软的布擦拭仪器表面，避免使用含有酸碱等腐蚀性成分的清洁剂，以免损坏仪器。
3. 校准仪器参数：根据实验需要，对仪器的激光功率、PMT增益、流速等参数进行校准，确保仪器的准确性和稳定性。
二、样品准备样品的准备是流式细胞仪实验的重要环节，不同的样品类型需要不同的处理方法。
下面介绍几种常见的样品类型及其处理方法：1. 细胞悬液：将细胞培养物或组织切片等样品离心收集，用PBS 等缓冲液洗涤，最后用适当的缓冲液稀释至合适的浓度。
2. 血液样品：采集静脉血或指尖血液，使用抗凝剂（如EDTA、肝素等）处理，离心收集血细胞，用PBS等缓冲液洗涤，最后用适当的缓冲液稀释至合适的浓度。
3. 粒子悬液：将纳米颗粒、微珠等样品用PBS等缓冲液稀释至合适的浓度，加入荧光染料等标记物后进行分析。
三、操作注意事项在使用流式细胞仪时，需要注意以下几点：1. 样品处理：样品的处理过程中需要避免受到光、热、震动等外界因素的干扰，以免影响实验结果。
同时，需要注意样品的稀释倍数，过高或过低都会影响数据的准确性。
2. 样品注入：将样品注入流式细胞仪时，需要根据样品的性质和浓度选择适当的注入速度和压力，以避免样品堵塞或破坏仪器。
3. 数据分析：在数据分析过程中，需要根据实验设计和样品类型选择适当的数据处理方法，如峰值分析、群体分析、细胞周期分析等。
流式细胞仪荧光结果分析中的常见问题及解决方法
流式细胞仪荧光结果分析中的常见问题及解决方法流式细胞仪是一种用于细胞分析的实验室仪器，它能够对单个细胞进行快速而精确的定量和质量分析。
它主要通过将细胞悬浮液注入到仪器中，利用激光器照射细胞并检测经过细胞的光线散射和荧光信号，从而获取大量有关细胞形态、大小、复杂度、表面标记以及内部分子的信息。
它可同时测量多个参数，并具备高通量性能，能够快速分析数以万计的细胞，并提供详细的统计学数据。
它广泛应用于免疫学、细胞生物学、药理学、肿瘤学等领域的研究和实验中。
然而，在分析流式细胞仪得到的荧光结果时，常常会遇到一些问题，如信号强度弱、背景高、细胞群分布异常等。
本文将介绍常见问题，并提供相应的解决方法。
一、信号强度弱1. 信号补偿不正确：检查流式细胞仪上的单色阳性对照是否设置正确，并确保门控和补偿设置正确。
2. 用于检测的抗体不足：增加抗体的量或浓度。
二、荧光强度高1. 抗体浓度过高：减少每个样本中添加的抗体量。
2. 过量抗体被捕获：洗涤步骤要充分，并在洗涤缓冲液中加入吐温或Triton，以保持细胞的透化作用。
3. 封闭不足：在抗体混合液中加入1%-3%的封闭剂，并增加封闭步骤。
三、背景高/阳性细胞百分比高1. 增益设置过高/补偿过低：使用阳性对照正确设置流式细胞仪，并使用补偿减少小颗粒背景信号和降低增益。
2. 抗体过量：降低抗体的浓度，并在洗涤缓冲液中加入去污剂，确保洗去过量的抗体。
四、在应该只有一个细胞群的情况下观察到两个或多个细胞群1. 表达靶蛋白的细胞群不止一个：检查样本中包含的细胞类型预期的蛋白表达水平，并确保细胞充分分离。
2. 出现细胞双峰：细胞双峰显示为第二大细胞群，其荧光强度大约是单细胞荧光强度的两倍。
在染色前用移液枪将细胞轻柔混匀，并在细胞仪中运行之前再次混匀。
五、侧向散射背景偏高（来自小颗粒）1. 细胞裂解：确保样本中的细胞没有裂解和破碎，样本应新鲜并正确制备，避免高速离心或激烈涡旋的操作。
流式细胞仪结果分析
流式细胞仪结果分析一、获取数据在进行流式细胞仪结果分析之前，首先需要获取实验数据。
流式细胞仪会输出每个样本细胞的荧光强度、散射性质等参数。
这些参数可以代表细胞的表型特征或者亚细胞结构。
根据实验的需要，可以选择一种或多种指标进行数据分析。
二、数据清洗和预处理由于实验过程中可能会受到一些随机因素的干扰，比如机器灵敏度、噪声等，得到的数据可能存在一些异常值。
因此，在进行数据分析之前，首先需要对数据进行清洗和预处理，以减少这些异常值的干扰。
数据清洗可以通过以下几种方法进行：1.去除非细胞事件：流式细胞仪在采集数据时可能会采集到一些非细胞事件，比如细胞碎片、空白颗粒等，可以通过设置或者后续数据处理来去除这些非细胞事件。
2.去除离群值：根据实验的需要和数据的分布情况，可以使用统计学方法或者软件工具来判断和去除离群值。
3.数据归一化：如果实验中使用了多个荧光探针，不同探针之间的信号强度可能有差异。
可以通过归一化处理来消除这种差异，以确保数据的可比性。
三、统计分析数据清洗和预处理之后，可以进行统计分析来描述和解析数据。
流式细胞仪的数据通常是多维的，可以使用多种统计分析方法来从不同角度揭示数据的特点和规律。
1.基本统计分析：包括均值、标准差、中位数等指标，可以帮助了解数据的集中趋势和离散程度。
2.相关性分析：通过计算各个参数之间的相关系数，可以研究不同指标之间的关系。
例如，可以使用皮尔逊相关系数来衡量两个参数之间的线性相关性。
3.差异分析：比较不同样本或不同组的数据之间的差异。
常用的差异分析方法有t检验、方差分析等。
四、数据可视化为了更好地理解和传达数据的结果，可以使用数据可视化技术将数据以图表、图像等形式展示出来。
常用的数据可视化方法包括散点图、条形图、箱线图等。
通过数据可视化，可以帮助研究者直观地观察数据的分布情况、群体几何形状和特征变化趋势等。
五、结果解读在进行流式细胞仪结果分析时，需要根据实验目的和样本特性进行结果的解读。
流式细胞术实验技巧及数据分析
流式细胞术实验技巧及数据分析一、实验技巧1.细胞样本的准备在进行流式细胞术之前，首先需要准备好细胞样本。
对于悬浮细胞，可以通过离心分离获得单细胞悬浮液；对于贴壁细胞，需要利用胰酶等方法将细胞从培养皿上剥离。
样本的细胞浓度需要适当调整，以保证在实验过程中细胞数目在仪器检测范围内。
2.细胞标记与染色3.样本的处理与染色控制为了减少噪音和误差，需要进行相应的样本处理和染色控制。
常用的处理包括细胞固定、膜破裂和核酸溶解等。
另外，对照组的设置也非常重要，包括负对照、单标对照和血细胞淋巴细胞控制等，以校正仪器和标记的相关性。
4.流式细胞仪的设置与操作流式细胞仪是进行流式细胞术的关键仪器，需要正确设置和操作。
首先，要校准仪器的激发光源、滤光片和检测器等参数，以确保获得准确的荧光信号。
其次，要根据标记物的激发光和发射光波长选择合适的检测通道。
最后，通过检测标记物阳性细胞的信号强度和分布，调整仪器的敏感度和流速，以获得符合实验要求的数据。
二、数据分析1.数据获取与记录在流式细胞术实验结束后，需要用相应的软件（如FlowJo、CellQuest等）获取和记录仪器所产生的原始数据。
这些数据包括细胞整体的荧光信号和散点图等。
2.质量控制与后处理对于数据质量的控制，首先需要排除掉背景信号。
通过设置负对照，根据荧光信号的阈值来确定阳性细胞的比例。
另外，还需要剔除激活的、死亡的和颗粒干扰的细胞等。
3.数据可视化通过制作直方图、散点图和轮廓图等，可以直观地展示细胞的其中一种特定特征（如表达一些蛋白质、细胞周期等）在整个细胞群体中的分布情况。
从图形中可以得出相应的统计结果，并可以进一步比较不同样本之间的差异。
4.数据统计与分析对于一些研究问题，需要计算不同细胞亚群的百分比、中位数、平均值和标准差等。
此外，还可以利用双参数散点图，通过计算相关系数（如Pearson相关系数）来分析两个特征之间的相关性。
总结：流式细胞术作为一种快速、高通量和灵敏的细胞分析技术，对于研究细胞标记物的表达和功能等提供了有力的手段。
流式细胞术实验报告
一、实验目的本实验旨在通过流式细胞术技术，对细胞群体进行快速、精确的分析和定量测定，研究细胞的物理与化学性质，并对细胞进行分类和分选。
通过本次实验，掌握流式细胞仪的工作原理，了解其在细胞生物学研究中的应用。
二、实验原理流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒逐个进行快速定量分析和分选的技术。
其基本原理是将经过荧光标记的细胞或微粒，在流动系统中以高速通过，同时利用激光束照射细胞，通过光散射和荧光信号来获取细胞的大小、形态、表面标记物等信息。
最后，通过数据分析和可视化展示，对细胞进行计数、分类和分析。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 细胞样本：小鼠脾细胞、Jurkat细胞- 荧光标记抗体：CD45-FITC、CD3-PE、CD4-APC- 溶液：磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）、荧光染料（如PI）2. 实验仪器：- 流式细胞仪（如BD FACS Calibur）- 离心机- 恒温培养箱- 移液器四、实验步骤1. 细胞制备：- 收集小鼠脾细胞或Jurkat细胞，用PBS洗涤后，调整细胞浓度为1×10^6个/mL。
- 加入荧光标记抗体，室温下孵育30分钟。
- 用PBS洗涤细胞两次，去除未结合的抗体。
2. 流式细胞术分析：- 将处理好的细胞加入流式细胞仪，设置合适的参数进行检测。
- 收集数据，进行细胞分类和分析。
3. 数据分析：- 利用流式细胞术分析软件（如CellQuest、FlowJo）对数据进行分析，包括细胞计数、分类、DNA含量分析等。
五、实验结果与分析1. 细胞分类：- 通过流式细胞术，成功将小鼠脾细胞和Jurkat细胞分为不同的亚群，如T细胞、B细胞等。
2. DNA含量分析：- 通过PI染色，检测细胞的DNA含量，发现小鼠脾细胞和Jurkat细胞均处于G0/G1期。
3. 表面标记物分析：- 通过CD45-FITC、CD3-PE、CD4-APC抗体检测，发现Jurkat细胞为T细胞，小鼠脾细胞中含有B细胞和T细胞。
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间接免疫荧光染色：先用一抗与待测抗原反应，再 用二抗（荧光素标记）进行标记。
选择合适的荧光染料
• 必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发。（激 发光源488nm\633nm\407nm） • 激发的光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合适范围。 • 荧光素光谱的重叠应当尽量减少。 • 一定要选择商业化的流式用单克隆抗体，此类抗体在制 备过程中有严格的质控，非特异荧光弱。最好用直标抗 体，如果是用间标抗体，二抗的选择更应严格。
在上述信号基础上的细胞分选（未开展分选）
单细胞标本的制备
FCM 实 验 流 程
标记荧光抗体
检 测（老师）
数据分析
一、单细胞标本的制备 （关键步骤）
6种标本来源
① 外周血单细胞悬液制备
新鲜的外周血是天然的单细胞悬液，需 要用红细胞裂解液裂解RBC。
② 培养细胞的单细胞悬液制备
③ 脱落细胞的单细胞悬液制备
• 荧光补偿
• 样本收集
• 仪器维护和质控
举例 1 采样软件
举例 2 单参数直方图
举例 3 点图
举例4 凋亡测定
举例5 CBA
下一步的荧光染色处理。
样品制备过程中常见的问题及解决对策
常见问题
细胞密度低 非特异荧光强 碎片多 细胞聚集 荧光弱 测不出亚二倍 体峰
原
因
解决对策
增加离心时间、吸弃上清Fra bibliotek选择纯度高的抗体、用同型对照抗 体或双标记排除非特异荧光
制备过程中细胞损失 抗体不纯、死亡细胞多 细胞死亡、机械损伤 消化不完全、酒精固定 造成的细胞粘连 灵敏度不够、抗体加入 量不饱和、反应时间短 凋亡测试方法选择不当
流式细胞仪实验方法及常见问题 分析
中心实验室 李 琳 2012.09.19
• 流式细胞仪（Flow Cytometer）是集多种 技术为一体的新型高科技仪器。
• 流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流 式细胞仪为检测手段，对处在快速直线 流动状态中的细胞或生物颗粒同时进行 多参数定量分析和分选的高新技术。 • 研究对象：各种细胞、微生物、人工合 成微球等。
脱落细胞应去除取材伴随的杂质后再制备细胞 悬液。 对临床诊断和治疗很有意义，比如脱落的肺泡 细胞。
④ 新鲜实体组织单细胞悬液制备
常用方法：酶消化法、机械法、化学处理法、表 面活性剂处理法等。 不论哪种方法都不可避免会对细胞表面膜结构、 细胞活性和功能造成不同程度的损伤。
⑤ 活检标本单细胞悬液制备
方法：与新鲜实体组织基本相同，要求镜检 取材标本至少取3块以上。
⑥ 石蜡包埋组织单细胞悬液制备
常用方法：二甲苯脱蜡法、组织清洁剂脱蜡 法、甲氧-双氧水处理法。 扩大了流式的应用范围，有利于进行临床回 顾性研究。
评判单细胞悬液制备的标准
1. 2. 3. 4. 细胞团块、碎片尽可能少，不能出现肉眼可见的团 块，上机前细胞必须过300目滤膜。 细胞呈单个分散状态。 细胞浓度：5×105~1×106 分散过程中细胞的活性不受到明显的损害，以保证
在细胞生长状态良好时测试、避 免反复吹打 彻底消化、在用酒精固定细胞时 加入终浓度为1.5-3％的小牛血清 改用生物素-亲和素、增加抗体 用量、延长反应时间 改用原位末端标记或Annexin-V 和PI双标记法
二、标记荧光抗体
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•
直接免疫荧光染色：细胞与抗体反应，多用于细胞 表面标志的染色分析。
BD FACSAria
• 中心实验室的流式能做什么？ • 流式实验需要做哪些准备和工作？
流式细胞仪检测范围
细胞结构
细胞大小 细胞粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA 含量 蛋白质含量 染色体分析
细胞功能
特异性抗原（细胞表面/胞浆/核） 细胞活性 细胞因子 酶活性 激素结合位点 细胞受体 凋亡
影响荧光染色效果的因素
• 温度：高温时荧光淬灭的可能性增大。 • pH值：其改变会导致荧光光谱改变，影响荧光强度。 • 固定剂：与细胞的某些物质结合后，干扰荧光染料与 细胞成分的结合，造成荧光强度改变。 • 其他：孵育时间、溶剂的性质、细胞浓度等。
三、上机检测（老师）
• 设门 • 画图
• 电压调节