流式细胞仪使用方法
最详细的流式细胞仪实验方法
流式细胞仪实验方法一、实验准备1．标本制备：2．最小化非特异性结合：二、凋亡1．凋亡的检测方法：网站和其它2．PI染色法3．Annexin V 法4．TUNNEL法三、细胞因子1．激活的细胞因子2．CBA四、血小板1．活化2．活化检测3．网织血小板五、红细胞1．网织红细胞2．PNH3．胎儿红细胞六、肿瘤学1．DNA 细胞周期2．蛋白3．多药耐药4．微小残留白血病第一部分标本处理一、流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。
孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。
本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。
虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。
(二)间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。
本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。
但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。
所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。
另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。
二、最小化非特异性结合的方法1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。
2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。
流式细胞术操作规程
流式细胞术操作规程
《流式细胞术操作规程》
流式细胞术是一种用于研究细胞表型和功能的重要技术。
在进行流式细胞术时，操作规程的严谨性和标准化是非常重要的。
以下是流式细胞术操作规程的一般步骤：
1. 样品准备：首先，需要准备好待测的细胞样品。
这包括细胞的培养和收集，以及必要的处理和染色。
2. 仪器准备：在进行流式细胞术之前，需要确保流式细胞术仪器的正常运行。
这包括检查流式细胞仪和细胞分选仪的通电和冷却系统，以及其它相关设备的准备。
3. 校准仪器：在进行流式细胞术之前，需要对流式细胞仪进行校准，以确保其准确测量样品中细胞的特定参数。
4. 样品测量：将准备好的细胞样品加入流式细胞仪，并进行测量。
测量完毕后，需要对数据进行分析和记录。
5. 数据分析：对测量得到的数据进行分析，包括确定细胞的表型和功能，以及对其它相关参数进行分析和比较。
6. 结果解释：根据数据分析的结果，进行结果的解释和报道，并对相关实验现象进行讨论和总结。
在进行流式细胞术时，需要严格遵守操作规程，以确保实验结果的准确性和可靠性。
此外，对于一些特殊的实验操作，可能
还需要根据具体情况进行相应的调整和改进。
流式细胞术的操作规程是一个很重要的研究工具，它可以帮助研究人员进行高效、准确的实验，从而为科学研究和医学诊断提供更为可靠的数据和方法。
facs技术操作规程
facs技术操作规程
《FACS技术操作规程》
流式细胞仪（FACS）是一种用于细胞分析和分选的高级仪器。
它可以分析、计数和分选细胞，对于细胞学和免疫学研究非常重要。
在使用FACS技术时，操作规程非常重要，可以确保实验的准确性和可重复性。
首先，操作人员需要准备好实验所需的样本和试剂。
样本可以是细胞悬液或者组织细胞悬液，而试剂包括细胞染色剂、抗体等。
在进行实验前，要确保所有试剂和仪器都是干净的，并且符合实验要求。
其次，需要根据实验设计设置FACS仪器。
这包括设置激光器的参数、选择合适的滤光片和检测通道，以及校准仪器。
合理的仪器设置可以确保后续实验的准确性。
接下来，操作人员需要将样本加入到流式细胞仪中进行分析。
在分析过程中，要确保样本被均匀地分散，并且避免气泡的产生。
此外，要根据实验目的选择合适的参数进行数据采集。
最后，如果需要进行细胞的分选，操作人员需要进行细胞的标记和排序。
细胞标记可以使用荧光染料或者特定的抗体，而排序可以根据细胞的特定荧光信号进行。
在进行分选时，要确保细胞的纯度和活性。
总之，FACS技术操作规程对于实验的成功至关重要。
遵循规
程可以确保实验结果的准确性和可重复性，同时也可以降低实验中的操作失误。
因此，操作人员在使用FACS技术时应该严格遵守相关规程，并按照标准操作步骤进行操作。
流式细胞仪常用的几种检测方法
流式细胞仪常用的几种检测方法1.细胞计数和生存率检测：流式细胞仪可以通过测定细胞的大小、形状和胞内染色物来实现细胞计数和生存率的检测。
通过自动聚焦和自动获取图像的功能，可以对大量的细胞进行计数和分析，并得出生存率数据。
2.表面标记检测：流式细胞仪可以利用荧光染料或荧光标记抗体对细胞表面的蛋白质、糖类或其他生物分子进行检测。
这种检测方法主要用于检测细胞表面标记的数量和分布情况，例如测定细胞表面特定抗原的表达水平。
3.细胞周期分析：流式细胞仪可以通过染色剂或荧光标记抗体对细胞进行染色，然后分析细胞在不同细胞周期阶段的比例。
这种检测方法可以用于研究细胞的增殖能力、细胞周期调控机制以及细胞周期与疾病发展的关系。
4.细胞凋亡检测：流式细胞仪可以利用染色剂或荧光标记抗体对细胞凋亡的标志物进行检测。
凋亡是细胞死亡的一种形式，通过测定凋亡细胞的数量和凋亡标志物的表达水平，可以研究细胞凋亡的调控机制以及细胞凋亡与疾病的关系。
5.细胞功能检测：流式细胞仪可以通过检测细胞内Ca2+浓度、ROS （活性氧物种）水平、蛋白质磷酸化等细胞功能指标来研究细胞的信号转导和功能活性。
例如，利用荧光染料可以测定细胞内钙离子的浓度变化，以研究细胞响应外界刺激的机制。
此外，流式细胞仪还可以进行细胞分选、多色细胞分析和细胞细胞间相互作用的研究。
细胞分选功能可以根据细胞标记物的表达水平将细胞分离出来，用于研究特定功能细胞的特性。
多色细胞分析可以用于同时检测多种标记物的表达水平，以揭示不同细胞类型的分子特征。
细胞间相互作用的研究可以通过检测细胞间的共聚或共表达标记物来研究细胞间的相互作用和相互影响。
总的来说，流式细胞仪是一种功能强大的实验室设备，常用于细胞生物学和疾病研究。
通过不同的检测方法，可以在细胞水平上研究细胞的数量、表面标记、周期、凋亡、功能以及细胞间相互作用等方面的特征。
流式细胞仪检测细胞凋亡方法（AnnexinV法）
流式细胞仪检测细胞凋亡方法（AnnexinV法）实验概要Annexin V是一种检测细胞凋亡的试剂，本实验介绍了一个用流式细胞仪检测细胞凋亡的方法(Annexin V 法)。
实验原理Annexin V是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。
它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。
在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS)由质膜内侧翻向外侧。
Annexin V与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。
由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA碎片检测比较，使用Annexin V可以更早地检测到凋亡细胞。
因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V /核酸染料-)与死亡细胞(Annexin V /核酸染料 )。
主要试剂1. PBS缓冲液：含0.1%NaN3，过滤后2-8°C保存。
2. Annexin V Binding Buffer缓冲液(Cat. No. 66121E)：浓度为10×，使用时，用稀释为1×浓度的应用液。
3. Annexin V试剂与核酸染料：Annexin V 核酸染料Annexin V-Biotin(Cat. No. 65872X) PI(Cat. No. 66211E)或Streptavidin-FITC(Cat. No. 13024D) 7-AAD(Cat. No. 34321X)Annexin V-FITC(Cat. No. 65874X) PI(Cat. No. 66211E) Annexin V-PE(Cat. No. 65875X) 7-AAD(Cat. No. 34321X)1. 一次性12×75mm Falcon试管。
细胞计数方法
细胞计数方法细胞计数是生物学和医学领域中非常重要的实验技术之一。
它用于确定细胞数量，评估细胞增殖率，研究细胞生长和细胞死亡等。
在科研实验室、临床诊断和药物研发中，细胞计数方法被广泛应用。
本文将介绍几种常用的细胞计数方法，包括显微镜计数法、血细胞计数仪法和流式细胞仪法。
显微镜计数法是最传统的细胞计数方法之一。
它通过在显微镜下直接观察和计数细胞来确定细胞数量。
首先，将待计数的细胞悬浮液均匀涂布在载玻片上，然后在显微镜下使用细胞计数室或九宫格计数。
通过计算细胞在特定面积内的数量，再乘以稀释倍数，即可得到总细胞数。
这种方法简单直观，但需要较长的操作时间，并且受到操作者主观因素的影响。
血细胞计数仪法是一种自动化的细胞计数方法，主要用于血液细胞计数。
它利用血细胞计数仪对待测样品进行自动计数和分类，可以快速准确地得到各类血细胞的数量。
这种方法操作简便，结果准确可靠，适用于大批量的细胞计数工作。
但是，血细胞计数仪的价格较高，使用和维护成本也较高，因此在一般实验室中并不常见。
流式细胞仪法是一种高通量、高灵敏度的细胞计数和分析方法。
它利用流式细胞仪对细胞进行快速连续检测和计数，可以同时获取细胞数量、大小、形状、表面标记物等多种信息。
流式细胞仪广泛应用于细胞免疫学、细胞生物学、肿瘤学等领域，可以帮助研究人员深入了解细胞的特性和功能。
但是，流式细胞仪的价格昂贵，操作复杂，需要专业的技术人员进行操作和数据分析。
总的来说，不同的细胞计数方法各有优缺点，适用于不同的实验需求和场景。
在选择细胞计数方法时，需要根据实验目的、样品特性、实验条件等因素综合考虑，选取最适合的方法进行细胞计数。
随着科技的不断进步和发展，相信会有更多更高效的细胞计数方法出现，为科研工作者和临床医生提供更多选择。
流式细胞仪使用方法
流式细胞仪的使用方法及相关资料仪器名称：流式细胞仪生产厂家：美国贝克曼库尔特有限公司使用方法：一．开机程序1．检查稳压器电源，打开电源，稳定5分钟。
2．打开储液箱，倒掉废液, 并在废液桶中加入400ml漂白水原液。
打开压力阀，取出鞘液桶，将鞘液桶加至4/5满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFlow），合上压力阀。
确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。
3．将FACSCalibur开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY，预热5－10分钟。
排出过滤器内的气泡。
4．如果需要打印，打开打印机电源。
5．打开电脑,等待屏幕显示出标准的苹果标志。
6．执行仪器PRIME功能一次，以排除Flow cell中的气泡。
7．分析样品时，先用FACAFlow 或PBS进行HIGH RUN约2分钟。
做过分选后，每次开机后需冲洗管道：向分选装置上装上两个50ml离心管，不接通浓缩系统，摁下右下角白色按钮开始冲洗。
待自动停止后接通浓缩装置，同上法冲洗一次。
二．预设获取模式文件(Acquisition Template Files)1．从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗，可利用此视窗编辑一个获取模式文件。
2．选取屏幕左列绘图工具中的Dot plot，绘出一个或多个Dot Plots（点图）。
从Dot Plot对话框中选取Acquisition作为图形资料来源，并确定适当的x轴和y轴参数。
3．选取屏幕左列绘图工具中的Histogram，同上法可绘出Histogram（直方图）。
4．将此视窗命名后储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest Folder \EXP文件夹中，下次进行相同实验时可直接调用。
本计算机中已设定两个模式文件：ACQ和EXP，储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest \EXP文件夹中，ACQ用于细胞DNA检测，EXP用于细胞表面标志分析。
流式细胞术实验方法及应用
2. 细胞浆或核内抗原标记法 收集单细胞悬(1×106)+固定剂A 去固定液 破膜剂B及抗体
任意门、矩形门
线性门
四象门
多重逻辑门：当一种细胞有两种以上的参数需要被 分析时，常需要设多个门，各门之间由此出现逻 辑关系，此种设门技术称为多重逻辑门或联合门。
淋巴细胞
T淋巴细胞（CD3+）
CD3+CD8（CD4+）
IFN-r
IL-4
数据显示采用的图:散点图、直方图、密度图 和二维等高图等。最常用的为单参数直方图 和双参数散点图。
室温，15 min 室温，15 min
洗涤
PBS洗涤1次
上机分析（1% 多聚甲醛固定）。 3. 细胞表面和细胞内抗原同时标记 在流式分析中通常需要细胞膜表面和细胞 内同时标记，首先标记表面抗原，然后再对细胞 膜和核膜进行固定破膜后再标记胞内或核内抗原。 常见细胞破膜剂：
0.05%皂角素、0.1%曲拉通 (Triton X-100)、70%乙醇、 商品化固定破膜剂（A、B）。
100目钢筛网过滤 1000r/min，5min PBS 洗2次
300目尼龙网 单细胞悬
5. 脱落细胞单细胞悬液的制备
包括：
尿液脱落细胞
胸水、腹水脱落细胞 冲洗液脱落细胞
收集胸水、腹水、尿液、冲洗液 沉淀 取底部10-20ml 300目尼龙滤网过滤 收集方法、沉淀时间
臵 4℃ 冰箱中 PBS洗 3 次
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
流式细胞仪的使用方法及相关资料
仪器名称：流式细胞仪
生产厂家：美国贝克曼库尔特有限公司
使用方法：
一．开机程序
1．检查稳压器电源，打开电源，稳定5分钟。
2．打开储液箱，倒掉废液, 并在废液桶中加入400ml漂白水原液。
打开压力阀，取出鞘液桶，将鞘液桶加至4/5满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFlow），合上压力阀。
确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。
3．将FACSCalibur开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY，预热5－10分钟。
排出过滤器内的气泡。
4．如果需要打印，打开打印机电源。
5．打开电脑,等待屏幕显示出标准的苹果标志。
6．执行仪器PRIME功能一次，以排除Flow cell中的气泡。
7．分析样品时，先用FACAFlow 或PBS进行HIGH RUN约2分钟。
做过分选后，每次开机后需冲洗管道：向分选装置上装上两个50ml离心管，不接通浓缩系统，摁下右下角白色按钮开始冲洗。
待自动停止后接通浓缩装置，同上法冲洗一次。
二．预设获取模式文件(Acquisition Template Files)
1．从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗，可利用此视窗编辑一个获取模式文件。
2．选取屏幕左列绘图工具中的Dot plot，绘出一个或多个Dot Plots（点图）。
从Dot Plot对话框中选取Acquisition作为图形资料来源，并确定适当的x轴和y轴参数。
3．选取屏幕左列绘图工具中的Histogram，同上法可绘出Histogram（直方图）。
4．将此视窗命名后储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest Folder \EXP文件夹中，下次进行相同实验时可直接调用。
本计算机中已设定两个模式文件：ACQ和EXP，储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest \EXP文件夹中，ACQ用于细胞DNA检测，EXP用于细胞表面标志分析。
三．用CELLQuest进行仪器的设定和调整
1．从苹果画面中选取CELLQuest，进入CELLQuest后在File指令栏中打开合适的获取模式文件。
2．从屏幕上方Acquire指令栏中，选取Connect to Cytometer（快捷键：＋B）进行电脑和仪器的连机。
将出现的Acquisiton Control对话框移至合适位置。
3．从Cytometer指令栏中，开启Detectors/Amps、Threshold、Compensation、Status 等四个对话框，并将它们移至屏幕右方，以便获取数据时随时调整获取条件。
也可以用+1，2，3，4获得此四个对话框。
4．在Detectors/Amps对话框中，先为每个参数选择适当的倍增模式(amplifier mode)：线性模式Lin或对数模式Log。
一般进行细胞表面抗原分析如分析外周
血的淋巴细胞亚群时，FSC和SSC多以线性模式Lin测量，且DDM Param选择FL2，而FL1, FL2与FL3则以对数模式Log测量；分析细胞DNA含量时，FSC，SSC，FL1，FL2，FL3皆以Lin进行测量，且DDM Param选择FL2；分析血小板表型时，FSC，SSC，FL1，FL2，FL3等均以Log进行测量。
5．放上待检测的样品，将流式细胞仪设定于RUN，流速可在HIGH 或LOW上。
6．在Acquisiton ”。
3Control对话框中，选取Acquire，开始获取细胞。
在以下的仪器调整过程中随时选取Pause，Restart以观察调整效果。
未完全调整好之前不要去掉SETUP前的“
7．在Detectors/Amps对话框中，调整FSC和SSC探测器中的信号倍增度：PMT voltages（粗调）与Amp Gains（细调），使样品信号出现在FSC-SSC点图内,且三群细胞合理分布。
8．在Threshold 对话框中选择适当的参数设定Threshold，并调整Threshold的高低，以减少噪音信号（细胞碎片）。
一般做细胞表型时用FSC－H而做DNA 时用FL2－H。
Threshold并不影响检测器对信号的获取，但可改善画面质量。
9．从屏幕左列绘图工具中选取Region（区域），并在靶细胞周围设定区域线，即通常所说的门。
圈定合适的细胞群可使仪器调整更为容易。
10．在Detectors/Amps对话框中，调整荧光检测器（FL1, FL2, FL3, FL4等）的倍增程度。
根据所用的荧光阴性对照样品调整细胞群，使之分布在正确的区域内。
11．在Compensation对话框中，根据所用的调补偿用标准荧光样品调整双色（或多色）荧光染色所需的荧光补偿。
比如应该为FL1+ FL2- 的细胞群却分布在FL1＋FL2＋区域内，则需调大FL2－？％FL1中的“？”，并从FL1-FL2点图中观察新的调整是否恰当
12．在Status对话框中可见：Laser Power:正常值—Run/Ready为14.7mW，Standby 为5mW；Laser current:正常值为6Amps左右。
13．调整好的仪器设定可在Instrument Settings对话框中储存，下次进行相同实验时可调出使用，届时只需微调即可。
本计算机中已有三个名叫储存于FACStation G3 \BDΞ Applications \CELLQuest Folder \IMM-InstrSettings及FACStation G3 \BD Files \Instrument Settings Files \CalibFile和Mast-Cell-Set的参数文件，前二者可用于分析人白细胞，后者用于分析小鼠肥大细胞。
四．通过预设的获取模式文件进行样品分析
1．从苹果标志中选择CELLQUEST，新视窗出现后从File指令栏中选择Open，打开预设的获取模式文件。
2．从屏幕上方Acquire指令栏中，选取Connect to Cytometer进行电脑和仪器的连机。
将出现的Acquisiton Control对话框移至合适位置。
3．从Cytometer指令栏中选取Instrument Settings，在其对话框中选择Open以调出以前存储的相同实验的仪器设定，按Set 确定。
4．在Acquire指令栏中，选择Acquisition&Storage决定储存的细胞数，参数，信号道数。
其中Resolution在做细胞表面标志时选择256，做DNA时选择1024。
Parameter Saved…则根据不同的检测对象选择不同的参数。
5．在Acquire指令栏中，选择Parameter Description，以决定文件存储位置(folder)，文件名称(file)，样品代号以及各种参数的标记(panel)，即安排tube1，2，3…的检测参数。
一般本仪器获取的数据按照检测对象的不同分别储存于FACStation
G3\BD Applications \CELLQuest \IMM 和DNA 文件夹中。
文件根据日期命名。
6．在Cytometer指令栏中，选择Counters，将此对话框移至合适位置，以便于随时观察events计数。
7．将样品试管放至检测区，在Acquire Control对话框中选取Acquire以启动样品分析测定。
8．微调仪器设定，待细胞群分布合适后选择Acquire Control对话框中Pause, Abort, ”，开始正式获取信号，存储数据。
3去除Setup前的“
9．当一定数目的细胞被测定后，获取会自动停止，并会自动存储数据。
重复步骤7，继续分析下一个样品，直到所有的样品数据分析完毕。
Ξ当所有样品分析分析完毕，即换上三蒸水，并将流式细胞仪置于“STANDBY”状态，以保护激光管。
五．关机程序：
1．从File中选择Quit, 退出软件，选择Don’t Save至苹果屏幕。
2．用4ml 1：10稀释的漂白水作样品，将样品置于旁位（vacuum is on），以外管吸去约2ml，在将样品架置于中位（vacuum is off），再HIGH RUN 5分钟（内管吸去2ml）。
3．改用三蒸水4ml作样品,同上处理。
4．按Prime三次。
5．此时仪器自动转为STANDBY状态，换2ml三蒸水。
必须在仪器处于“STANDBY”状态10分钟后再依次关掉计算机、打印机、主机、稳压电源，以延长激光管寿命，并确保应用软件的正常运行。
6．填写使用登记表。