流式细胞仪
流式细胞仪分选细胞的原理
流式细胞仪分选细胞的原理一、仪器原理流式细胞仪是一种利用流体动力学原理，结合光学和电子仪器技术，对细胞进行快速检测、分类和分选的仪器。
其主要原理是通过细胞在液体中的流动来实现对细胞的分选和分类。
二、流式细胞仪的组成流式细胞仪主要由液体系统、光学系统和电子系统三部分组成。
1.液体系统：液体系统包括进样系统、流动系统和废液系统。
进样系统负责将待检样品引入流动系统；流动系统则通过液体的流动将细胞送到光学系统进行检测；废液系统则负责将已经检测过的样品排出。
2.光学系统：光学系统由激光器、光学镜头、滤光片和光电倍增管等组成。
激光器产生的激光经过光学镜头聚焦后，照射到流动的细胞上，细胞反射、散射或荧光发射的光信号被光学镜头收集并通过滤光片进行过滤，最后由光电倍增管转化为电信号。
3.电子系统：电子系统主要由数据采集卡、计算机和控制软件组成。
数据采集卡负责将光电倍增管转换的电信号进行放大和数字化处理，然后传输给计算机；计算机通过控制软件对数据进行处理、分析和展示。
三、细胞的分选原理流式细胞仪的分选功能是通过细胞的特征参数来进行判断和分选的。
1.散射光信号分选：散射光信号是细胞受到激光照射后，由于细胞的大小、形状和内部结构的不同，产生的光信号。
通过检测散射光信号的强度和角度，可以判断细胞的大小和形态，从而实现对细胞的初步分选。
2.荧光信号分选：荧光信号是细胞在受到特定荧光染料激发后发射的光信号。
通过检测细胞的荧光强度和荧光颜色，可以判断细胞内特定荧光标记物的存在与否，从而实现对特定细胞类型的分选。
3.双参数联合分选：双参数联合分选是指根据细胞的两个或多个特征参数进行综合分析和判断。
比如可以根据细胞的大小和形状、荧光强度和颜色等参数进行综合判断，实现对多种细胞类型的准确分选。
四、应用领域流式细胞仪广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物研发等领域。
1.生物医学研究：流式细胞仪可以对细胞的免疫表型、细胞周期、细胞凋亡等进行快速检测和分析，帮助科研人员深入了解细胞的生理和病理过程。
流式细胞仪
三）淋巴细胞分类
CD3(T细胞，CD4、CD8))、CD19 （B细胞）、CD16、CD56（NK细胞）， 原发性或继发性免疫缺陷病、自身免疫 性疾病、淋巴细胞增殖病、肿瘤疗效观 察与预后判断、移植免疫检测等。
R1 M1 M1
流式细胞术检测细胞表型
四）白血病的免疫分型
流式细胞术白血病免疫分型是利用荧光素 标记的单克隆抗体作分子探针，多参数 分析白血病细胞的免疫表型，了解被测 白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。
流式细胞仪数据分析
点图分析
流式细胞仪数据分析
直方图分析
图中100～101（M1）为阴性细胞，101以上的（M2）为阳性细胞
五、 流式细胞术的应用
细胞结构 细胞大小 细胞颗粒度 细胞表面积 核浆比例 DNA含量与细胞
周期 RNA含量 蛋白质含量
……
细胞功能
UL
254
2.40 37.47 461.36
UR 1067 10.08 816.86 468.89
LL 5291 49.98 19.57 4.41
LR 3975 37.55 418.80 9.87
图 Annexin V/PI双标记分析细胞凋亡和坏死
Date acquired: 14-Jan-03 File: 7Gy 4hr.001 Source: dongbo DIPLOID: 100.00 % Dip G0-G1: 73.12 % at 48.16 Dip G2-M: 9.59 % at 96.33 Dip S: 17.29 % G2/G1: 2.00 Dip %CV: 6.04
FCM分析白血病免疫表型, 快速、特异、 准确，重复性好，能区分细胞起源、划 分其分化发育阶段等，对白血病的诊断 与分型、治疗方案选择与预后判断、发 病机理研究等有重要价值。
流式细胞仪(Flow Cytometer)基本原理
FL-2(-)
FITC 单标
FL2 - %FL1
Before Compensation
FL-1(FITC)
FL-1(FITC)
PE 单标
FL-2(PE)
FL1 - %FL2
FL-2(PE)
After Compensation
FL-1(FITC)
FL-1(-)
什么样的补偿最合适？
单染管的阴性群体和阳性群体在所需调节通道的荧光Median 值相等时为最合适的补偿。
非特异性染色
抗体的Fc段可以与细胞表面的Fc受体非特异性结合； 抗体进入胞内，不容易洗脱，造成非特异性染色。
同型对照是指使用与实验抗体相同种属来源、相同剂量及同 种免疫球蛋白的相同亚型的抗体作为对照，用于消除抗体非 特异性结合到细胞上而产生的背景荧光。
实验抗体：FITC-CD3单克隆抗体为鼠IgG1亚型抗体; 同型对照：未免疫小鼠血清纯化的IgG1，并标记FITC，相同剂量。
侧向散射光SSC
SSC方向与激光束和液流形成的平面相垂直，亦称90度散射 光，其信号强度反映细胞内部颗粒度和精细结构的变化。
散射光的作用
实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
粒细胞
单核细胞
淋巴细胞
红细胞、死细胞和碎片
通过FSC/SSC散点图，gate出目标细胞进行分析。
1、流式细胞术简介
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式细胞仪为检 测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒)的 理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。
流式细胞仪（Flow Cytometer ）是集细胞与分子生物学、 流体力学、激光技术、光电子技术、计算机技术、细胞荧光 化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种高科技仪器。
流式细胞仪及流式细胞术
流式细胞仪及流式细胞术流式细胞仪技术流式细胞仪技术，主要是测量群体中单个细胞经适当染色后其成分所发出的散射光和荧光，经染色的细胞在悬液中以单行流过高强度光源的焦点，当每个细胞经过焦点时，发出一束散射光/或荧光。
它们经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器(光电倍增管或一个固态装置)，光检测器把散射光定量转化成电信号，经数字转换器进行数字化后而成整数，然后进行电子存储，以后数据可以调出显示和进行分析。
其优点如下：1、具有操作简便，只要将染色的单个细胞推入仪器中，就会得出数据。
2、具有较高的灵敏度及测定速度，而且每次可测出许多数据，一般情况下，每秒可测5000个细胞，能迅速分析和记数大量细胞，并能准确统计群体中荧光标记细胞的比例。
3、应用广泛，即可用于测定细胞活力、繁殖周期和细胞定型分析，也可区别死亡细胞、分裂细胞和静止细胞群，既可测定DNA和RNA、测凋亡峰，又可测蛋白含量，特别是胞浆蛋白。
基本流程原理：1、将待测细胞染色后制成单细胞悬液，用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定的角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。
2、流式细胞仪通常以激光作为发光源。
经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。
这两种信号同时被前向光电二极管和90度方向的光电倍增管接收。
散射光不依赖任何细胞样品的制备技术，被称为细胞的物理参数或固有参数，散射光有包括前向角散射和侧向叫散射，前向角散射与被测细胞直径的平方密切相关，侧向角散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信号。
荧光信号也有两种，一种是细胞自身在激光照射下发出的微弱荧光信号，另一种是经过特异荧光素标记后的细胞受激发照射后得到的荧光信号。
流式细胞仪工作原理
流式细胞仪工作原理流式细胞仪是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的仪器，它能够对细胞进行高速、高效、高灵敏度的检测和分析。
流式细胞仪通过激光照射和细胞的光散射、荧光发射等特性，实现对细胞的分类、计数、分离和分析。
工作原理如下：1. 激光照射：流式细胞仪使用一束激光束照射样品中的细胞。
激光可以是单色激光，也可以是多色激光。
激光的波长和功率可以根据实验需要进行选择和调节。
2. 细胞光散射：当激光照射到细胞上时，光会与细胞中的物质发生相互作用，产生散射。
流式细胞仪通过检测细胞的光散射特性，可以获得细胞的大小、形状和复杂度等信息。
3. 荧光检测：在流式细胞仪中，可以通过给细胞标记荧光染料来检测细胞中的特定分子或标记物。
这些染料可以与细胞的蛋白质、核酸或其他分子结合，并发出特定的荧光信号。
流式细胞仪通过检测荧光信号的强度和波长，可以对细胞中的不同分子进行定量和定位分析。
4. 光学系统：流式细胞仪包含一个复杂的光学系统，用于收集和分析细胞发出的光信号。
该系统由多个透镜、滤光片和光电倍增管组成，能够收集和分离不同波长的光信号。
5. 数据分析：流式细胞仪通过计算机系统将收集到的光信号转化为数字信号，并进行数据分析和图形显示。
计算机软件可以对细胞进行分类、计数、分离和分析，生成直方图、散点图和柱状图等结果。
流式细胞仪的工作原理基于光学原理和细胞的光散射、荧光特性。
它能够快速、准确地获得细胞的多个参数，并对细胞进行定量和定位分析。
流式细胞仪在生物医学研究和临床诊断中有着广泛的应用，可以用于细胞免疫学、细胞生物学、肿瘤学等领域的研究和诊断。
血液科医生常说的“流式”,你知道是什么吗？
血液科医生常说的“流式”，你知道是什么吗？在血液科的诊断和治疗中，流式细胞仪是一种常见的检测工具。
在医生和患者的日常交流中，常会听到血液科医生提到“流式”，那么，究竟流式是什么，它在临床中有怎样的作用呢？接下来，让我们详细了解一下。
什么是流式细胞仪？流式细胞仪（Flow Cytometer）是一种用于分析细胞数量、表面标记、细胞大小和形状等信息的仪器。
它利用细胞标记荧光染料与细胞中的不同成分结合，通过检测这些荧光标记或物理性质的差异来对不同类型的细胞进行鉴定和分类。
流式细胞仪的原理流式细胞仪的基本原理是使用激光器产生的激光束照射通过悬液中的细胞，激光光束照射到细胞上后，细胞中的荧光标记物会发出荧光信号，这些信号会被探测器捕获并转换为电信号。
根据细胞荧光信号的强度、颜色和形状，流式细胞仪可以对细胞进行定量和定性的分析。
流式细胞仪在临床中的应用流式细胞仪在临床诊断中有着广泛的应用，特别是在血液科领域。
以下是一些流式细胞仪在临床中的主要应用场景：1.白血病鉴定与分类：流式细胞仪可以通过检测白血病细胞表面的不同分子标记来帮助医生对白血病进行鉴定和分类，从而指导治疗方案的制定。
2.免疫功能评估：流式细胞仪可以帮助医生评估患者的免疫功能，检测免疫细胞的种类和数量，从而指导治疗和预后的评估。
3.感染性疾病诊断：流式细胞仪可以通过检测免疫细胞中的感染标记物来帮助诊断感染性疾病，如艾滋病、肝炎等。
4.骨髓移植前后监测：流式细胞仪可以在骨髓移植前后对患者的免疫系统进行监测，评估移植效果和患者的免疫排斥反应。
5.自身免疫性疾病诊断：流式细胞仪可以帮助诊断和监测自身免疫疾病，如风湿性关节炎、红斑狼疮等。
流式细胞仪的优势与传统的显微镜观察细胞相比，流式细胞仪具有以下一些明显的优势：•高通量性：流式细胞仪可以快速分析大批样本，提高检测效率。
•多参数性：流式细胞仪可以同时检测多个参数，如细胞大小、形状、表面标记等，提供更全面的信息。
流式细胞仪使用规范
流式细胞仪使用规范流式细胞仪（Flow Cytometer）是一种常用的细胞分析仪器，广泛应用于细胞学、免疫学、生物学、医学等领域。
流式细胞仪可以对细胞进行快速、准确的多参数分析，能够检测和分离不同细胞类型、测定细胞数量、评估细胞活性以及研究细胞表面标记物等。
为了保证流式细胞仪的正常使用，以下是一些流式细胞仪的使用规范和注意事项。
1.准备工作：a.检查仪器：确认仪器的状态，包括是否通电、通气、光源是否正常工作等。
b.清洁样品室：使用无菌纯水或适当的清洁剂擦拭样品室，确保没有杂物或污染物。
c.校准仪器：根据仪器规定进行标定和校准，确保仪器的准确性和稳定性。
2.样品准备：a.细胞处理：合理处理样品，保证单细胞悬浮状态。
可以通过胰酶消化、筛选等方法获取单细胞悬浮液。
b.细胞计数：使用合适的细胞计数仪进行细胞计数，计算出所需的细胞悬浮液浓度。
c.细胞染色：根据实验需求对样品进行适当的荧光染色或抗体标记，以便在流式细胞仪中检测和分析。
3.流式细胞仪操作：a.设置参数：根据实验设计和研究目的，设置合适的仪器参数，包括激光器选择、激发波长、检测波长、门控设置等。
b.样品加载：将样品注入流式细胞仪样品室，避免气泡的产生，并确保样品完整进入样品室。
c.数据采集：开始数据采集前，进行流式细胞仪的标定、峰位校正和峰间校正，以保证数据的准确性和可靠性。
d.数据分析：对采集到的数据进行分析和解读，根据实验要求选取合适的分析策略和软件进行数据处理。
4.清洁和保养：a.实验后清洁：实验结束后，及时清洁仪器，避免样品残留和交叉污染。
b.仪器维护：定期检查仪器的部件和附件，保证其正常工作。
如需要更换部件或常规维护，请按照厂家指南进行操作。
c.长时间停用：如果流式细胞仪长时间不使用，应按照厂家指南进行仪器的合理关闭和长期存储。
5.安全注意事项：a.避免直接接触激光线：在进行样品加载和设置参数时，避免接触激光线以避免损伤眼睛。
b.使用无菌操作：在样品加载和处理过程中，使用无菌操作和材料，避免细菌污染和交叉感染。
流式细胞仪在生物学研究中的应用
流式细胞仪在生物学研究中的应用流式细胞仪（Flow cytometer）是一种广泛应用于生物学研究的仪器，通过对细胞的特性进行快速、准确地分析和分选，为科学家提供了重要的数据和信息。
本文将探讨流式细胞仪在生物学研究中的应用，并展示其在不同领域的重要性。
一、流式细胞仪的原理和技术流式细胞仪的工作原理基于细胞在液体流动状态下被传感、检测和反应的过程。
它通过将细胞悬浮液经过细胞仪仪器内的细长管道，并在细胞通过过程中激发和测量其特定性质，从而实现对细胞的多参数分析和评估。
流式细胞仪的技术包括激光激发、细胞传感和荧光信号检测等。
激光激发利用高能激光束对细胞进行激活并激发其内部或表面荧光标记物的发射。
细胞传感通过聚焦和引导细胞通过检测区域，确保单个细胞按顺序经过检测装置。
荧光信号检测则通过光学检测系统捕捉和记录细胞放射出的特定波长的荧光信号。
二、流式细胞仪在免疫学研究中的应用1. 免疫表型分析：流式细胞仪可以用于识别和分析多种免疫细胞，如T细胞、B细胞、巨噬细胞等，并评估它们的表型特征，如表面标记物的表达情况、活化状态等。
2. 免疫细胞功能研究：通过对细胞的功能进行评估，如蛋白质分泌、细胞增殖、细胞凋亡等，可以了解它们在免疫反应中的作用和调控机制。
3. 免疫细胞亚群分析：流式细胞仪可以将免疫细胞按照特定标志物进行分拣和分选，从而获得纯度较高的特定亚群细胞，以便进行进一步的研究。
三、流式细胞仪在细胞生物学研究中的应用1. 细胞周期分析：通过流式细胞仪的荧光探测系统，可以对细胞进行DNA含量的测定，从而确定其所处的细胞周期阶段和细胞增殖状态。
2. 細胞凋亡檢測：流式细胞仪可以通过检测特定标志物如磷脂翻转等，对凋亡细胞进行分析和鉴定，以了解细胞凋亡的机制和调控网络。
3. 细胞增殖和细胞死亡研究：通过荧光染料等方法，流式细胞仪可以评估细胞增殖和死亡相关的指标，如活细胞数量、细胞周期分布、凋亡率等。
四、流式细胞仪在癌症研究中的应用流式细胞仪在癌症研究中具有重要意义，可以用于：1. 癌细胞鉴定和分离：通过特定标志物的荧光检测，流式细胞仪可以将癌细胞与正常细胞进行区分，从而进行纯化和特异性分析。
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1、流式细胞术(英文flow cytometry)是一种生物学技术，用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。
这种技术可以用来对流过光学或电子检测器的一个个细胞进行连续的多种参数分析。
目录* 1 原理* 2 流式细胞仪(flow cytometer)* 3 应用* 4 参见原理一束单色光（通常是激光）照到流体力学聚焦的一股流体上。
若干个检测器瞄向流束和激光相交的这个点，其中一个和激光在同一直在线（称作前散射(FSC)），其它几个和激光垂直（旁散射(SSC)和一个或几个荧光监测器）。
当每个悬浮颗粒通过光束时会按某种方式把光散射，同时所带有的荧光化合物被激发并发射出频率低于激发光的荧光。
这些散射光和荧光的组合数据被检测器记录，根据各检测器亮度的波动（每个细胞会显出一个散射或荧光的峰）就能够推算出每个颗粒的物理和化学性质。
前散射与细胞体积相关，而旁散射取决于颗粒的内部复杂程度（比如核的形状、胞质内颗粒的种类或者末的粗糙程度）。
可以检测的参数有：细胞的体积和形态复杂程度、细胞中的色素、DNA（细胞周期分析、细胞动力学、细胞增殖等）、RNA 染色体分析和分选（文库构建、染色体涂染）、蛋白质、细胞表面抗原（CD标记）、胞内抗原（各种细胞因子(cytokine)、次级媒介等）、核抗原、酶活性、pH，胞内离子化的钙、镁，膜电势、膜流动性细胞凋亡(apoptosis)（定量检测DNA降解、线粒体膜电位、通透性变化）、细胞存活能力、监测细胞电通透性、氧爆作用(oxidative burst) 、研究癌细胞中的多重耐药性(multi-drug resistance, MDR) 、谷胱甘肽、各种组合（DNA/表面抗原等等）流式细胞仪(flow cytometer)流式细胞仪又称荧光激活细胞分选器、荧光活化细胞分类计（FACS，Fluorescence Activated Cell Sorter）。
现代的流式细胞仪每秒可以实时检测几千个颗粒，并且可以主动分离具有不同特性的颗粒。
流式细胞仪和显微镜比较像，但能够对大量的单个细胞利用一组参数进行高通量的自动量化。
固体组织需要在检测前制备成单细胞的悬浮液。
一个流式细胞仪包括五个组成部分：* 细胞流动系统：液流（鞘液(sheath fluid)）携带细胞，使颗粒以串流形式通过光束。
* 光源：有通常的灯（汞或氙）、高功率水冷的激光源（氩、氪、染料激光）、低功率气冷激光（氩(488nm)，红氦氖(633nm)，绿氦氖，氦镉(紫外)）、偶极激光（蓝、绿、红、紫）。
* 检测和模数转换(analogue-to-digital conversion, ADC)系统：产生前散射、旁散射光和荧光的信号。
* 放大系统，线性或对数放大。
* 计算机，用于分析信号。
早期的流式细胞仪主要是实验设备，但目前仪器和相关的试剂有了很广的市场。
不同厂商的仪器特性也不同，主要的厂商和品牌如下：* Beckman-Coulter (ex-Coulter): Epics XL/XL-MCL; Epics Altra (Hypersort) (IBM-PC compatible platforms)* Becton, Dickinson: (FACS's): FACSCAlibur, FACScan, FACSort, FASCSVantage (Mac OS platform) FACS Canto, LSRII, Aria, DiVa (PC PLatform)* Cytomation: MoFlo, Cyan (IBM-PC platform)* Partec/Dako: Galaxy; PAS; CCA; PA (IBM-PC compatible platforms)应用流式细胞术在很多领域中都有应用，包括分子生物学、病理学、免疫学和海洋生物学等。
在分子生物学中，它主要用于荧光标记的抗体。
特异性的抗体与靶细胞上的抗原结合，能够通过流式细胞仪研究这些细胞的特别信息。
这在医学（尤其是器官移植、血液学、肿瘤免疫学和化疗、遗传学）中具有很广泛的应用。
现代的流式细胞仪具有多个激光和荧光检测器（目前商业用仪器的记录是4个激光和14个检测器），可以用于多个抗体标记，以便在表现型中更准确地区别某个靶群体。
流式细胞仪也是很有用的分选仪器。
当细胞/颗粒通过时，可以被选择性地加上某种电荷，并在通过电磁场后偏转，从不同出口流出。
这样就可以从一个混合物中高速（理论上可达到每秒大约9万个细胞）准确地分离开四类细胞。
由流式细胞仪得到的数据可以画成一维的柱状图或者二位或者三维的散点图。
The data coming from flow-cytometers can be plotted in 1-D to produce histograms or seen in 2D as dot plots or in 3D with newer software. The regions on these plots can be sequentially separated by a series of subset extractions which are termed gates. Specific gating protocols exist for diagnostic and clinical purposes especially in relation to haematology. The plots are often made on logarithmic scales. Because of overlaping fluorescent dyes, emission spectrum generated interfering signals by detectors signals have to be compensated electronically.海洋中主要的光合生物之一——占海洋浮游生物总细胞数将近1/3的原绿球藻(Prochlorococcus)就是通过流式细胞术发现的。
因为其细胞小，叶绿素含量少，在通常的荧光观察中被迅速漂白(bleach)，但由于在流式细胞术中细胞通过光束的时间极短，胞内叶绿素的荧光可被观察到。
[编辑]参见* 荧光显微镜* 荧光活化细胞分选2、流式细胞技术-细胞内细胞因子的检测(摘自免疫学论坛)流式细胞技术-细胞内细胞因子的检测激活的淋巴细胞内细胞因子的检测简介细胞因子是可溶性蛋白，在淋巴细胞应答中有重要的免疫调节作用。
细胞因子可以调节细胞生长、分化以及一系列功能，并且介导正常与病理性免疫应答。
细胞因子是具有效应及调节双重作用的独特蛋白。
近来研究显示，细胞因子可以具有多重功能，作用于多个细胞亚群并可在不同亚群细胞表达。
早期细胞因子表达与T细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。
尽管研究应用T淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如TH1（IL－2，IFN－γ）与TH2（IL－4，IL－5，IL－10），但这些研究很难外推，因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还未被揭示。
近来，Jung与Picker采用了Brefeldin(BFA)与monensin等药物预孵检测胞内细胞因子的表达的方法。
这一方法阻断了胞内高尔基体介导的转运使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。
这一方法可检测单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。
使用特定刺激剂研究细胞因子应答是细胞因子研究中的重大进展。
在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。
且这些研究清楚地证明，只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子，静止的正常淋巴细胞（T、B、NK）不能分泌细胞因子。
胞内流式分析法基于目前BD的FastIMMUNE Cytokine System。
抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌。
此分析采用特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞的最小荧光背景。
一、仪器设备1．12×75mm有盖的Falcon管（BD Catalog No.2058）2．37℃孵箱5％CO23．混匀振荡器4．离心机5．加样枪、Tips6． FACS流式细胞仪二、细胞1、全血使用肝素钠抗凝的VACUTAINER真空采血管（BD VACUTAINER Catalog No.367673）, FastIMMUNE 不易采用肝素锂，EDTA和ACD抗凝剂，血样在8小时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5％。
如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。
2、自身血浆中外周血单个核细胞(PBMCs)使用肝素钠抗凝的BD VACUTAINER 细胞制备管（CPTs）（BD VACUTAINER Catalog No.362753）24小时内分析。
3、组织培养基中的外周血单个核细胞(PBMCs)用Ficoll分离PBMCs，调节细胞浓度2×106细胞/mL于含10％热灭活胎牛血清（FBS）的RPMI－1640。
4、细胞系与T细胞克隆调节细胞浓度2×106细胞/mL于新鲜培养基中。
5、冰冻全血与PBMCs应用1×FACS溶血素，溶血固定激活全血或PBMCs用PBS漂洗，并用含1％的BSA及10％的DMSO的PBS，冻存－70℃。
溶化后细胞置于染色管中，加上2～3mL的洗液，离心5分钟500g，然后用FACS 通透液通透与染色。
三、刺激试剂与抗体1、PMA（Sigma catalog No.P-8139）打开装有PMA的小筒，打开包装，取出1mg包装的小瓶，打开迅速加入1ml的无水乙醇或DMSO。
注意：无菌操作，PMA易挥发，有毒。
然后分装到100支1.5ml的e.p.管中,每管10μl,取出1支待用，其余99支冻存于-70℃或-20℃冰箱。
2、离子霉素Ionomycin(Sigma catalog No.I-0634)打开包装内含1mg的离子霉素，加入1ml的无水乙醇，然后分装到100支1.5ml的e.p.管中，每支10μl，取出1支待用，其余19支冻存于-70℃或-20℃冰箱，3、Golgistop或Golgiplug,（catalog No.555029或554724）详细请见说明书4、所需相应的抗体，如CD4、CD8、CD3、IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、CD69等。
最后在全血中的终浓度：PMA:20ng/ml全血5、离子霉素：1μg/ml全血6、FACS溶血素FACS溶血素（BDIS Catalog No.349202）用于PBMCs，培养细胞与全血制备，主要有3个作用：(1) 全血制备时用于溶解红细胞(2) 固定外表位(3) 辅助通透剂FACS溶血素使用前用无离子水1：10稀释，勿用PBS或其它缓冲液。