流式细胞仪的简要介绍与注意事项
流式细胞仪校准安全操作及保养规程
流式细胞仪校准安全操作及保养规程1. 背景流式细胞仪是一种现代化的实验仪器，广泛应用于生命科学、医学研究、诊断和治疗等领域。
流式细胞仪可以对单个细胞进行快速测量和分析，具有高灵敏度、高通量和高精度的优点。
在使用流式细胞仪时，正确的校准和安全操作，以及定期的保养是非常重要的。
2. 流式细胞仪的校准方法流式细胞仪的校准是保证实验结果准确的前提。
在进行校准之前，需要先准备好以下工具：•流式细胞仪校准珠•DI水•漂白液•消毒剂•塑料管•紫外线消毒灯2.1 流速校准1.将流式细胞仪开机，并将流式细胞仪校准珠装载到样品池中。
2.打开软件界面，进入流速校准模式。
3.将DI水装入塑料管，并连接到样品流路上。
4.开始采集数据，记录每个管道中的时间和事件数。
5.根据样品流速，计算出要达到特定事件数所需的时间，这就是实际流速。
6.通过调整样品流量控制器，将实际流速调整至设定值。
2.2 光学参数校准在进行光学参数校准之前，需要将流式细胞仪校准珠置于样品池中。
2.2.1 激发光的校准1.进入激发光校准模式，打开紫外线消毒灯。
2.将DI水装入塑料管中，并连接到样品流路上。
3.开始采集数据，记录激发光强度和事件数。
4.根据实际激发光强度，调整光源强度，使其达到设定值。
2.2.2 探测光的校准1.进入探测光校准模式，放置漂白液样品。
2.打开灯箱，选择合适的滤片和灵敏度，开始采集数据。
3.根据采集到的数据，调整探测器增益，使其达到合适的灵敏度。
2.3 粒子大小校准1.将流式细胞仪校准珠装载到样品池中。
2.进入粒子大小校准模式，开始采集数据。
3.根据采集到的数据，调整光学系统，将校准珠作为参考，确定粒子的大小。
3. 流式细胞仪的安全操作在操作流式细胞仪时，需要做好以下几点：1.先关掉紫外线消毒灯，并断开电源，然后进行操作。
2.对样品进行处理前，先进行消毒。
3.在进行样品注入时，应该进行过滤，并先进行细胞计数，控制加入的细胞数量。
4.遵守严格的操作规程，在操作流式细胞仪时，不要将手伸入仪器。
流式细胞仪简介
流式细胞仪一、结构技术特点（4个方面）：（1）流动室和液流系统（2）激光源和光路系统（3）光电管和信号测量及计算机分析系统（4）细胞分选系统流式细胞计是对细胞进行自动分析和分选的装置。
它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。
多数流式细胞计是一种零分辨率的仪器，它只能测量一个细胞的诸如总核酸量，总蛋白量等指标，而不能鉴别和测出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。
也就是说，它的细节分辨率为零。
流式细胞计的基本结构二、原理：1、将待测细胞染色后制成单细胞悬液。
2、用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。
3、流式细胞仪通常以激光作为发光源。
经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。
4、这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。
5、光散射信号在前向小角度进行检测，光散射信号基本上反映了细胞体积的大小；6、荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。
这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，7、经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。
8、计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，液可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。
9、检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。
单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。
一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。
流式细胞仪操作规程
流式细胞仪操作规程流式细胞仪是一种用于单个细胞分析的高通量仪器，广泛应用于生物医学研究、药物开发和临床诊断等领域。
为了确保流式细胞仪的正常运行和准确结果的获取，需要制定一套规范的操作规程。
以下是流式细胞仪操作规程的一些基本要点：一、实验前准备：1.确保流式细胞仪处于稳定状态，并将其连接到电源并打开电源。
2.检查仪器的液氮箱和压力容器，确保液氮和气源充足。
3.准备实验所需的标本样品和相应试剂。
4.检查流束对齐和测量准备：校准激光、确定流速、检查流束质量控制。
二、流式细胞仪样品制备：1.使用无菌技术制备样品，并严格遵循相关操作规范。
2.样品的准备应考虑到细胞的数量和稳定性，避免细胞聚集、损伤或死亡。
3.样品的制备应注意避免氧化和污染的发生，以确保结果的准确性。
三、样品装载和分析：1.使用无菌技术将样品加载到流式细胞仪中，并确保样品注射器和管道清洁和无气泡。
2.对于多个样本的分析，应注意正确的样品顺序和识别，以避免混淆。
3.设置合适的仪器参数和测量条件，例如流速、激发和发射光源、滤光片设置和增益调节等。
4.开始样品分析之前，应进行负空白检测和仪器的系统背景校正。
5.开始实验后，密切观察结果窗口，并根据需要进行相应的数据记录和保存。
四、实验后操作：1.实验结束后，关闭流式细胞仪和相关辅助设备，并进行正常关机程序。
2.将仪器和试剂的残留物清洁干净，并按照相关操作规范进行废弃物的处理。
3.维护仪器的常规保养，例如清洁仪器表面、更换滤光片、标定仪器等。
4.及时记录和整理实验数据，并进行必要的数据分析和结果解释。
五、安全注意事项：1.在操作过程中，应遵守相关的生物安全和化学安全规范，例如穿戴好实验室服装、戴手套、戴眼镜等。
2.对于辐射性或有毒性样品的操作，应采取额外的防护措施，例如使用密封容器、穿戴防护服等。
3.在使用激光和其他高能源光源时，注意防护眼睛和暴露部位，避免直接观察激光光源。
总结：流式细胞仪是一种复杂的仪器，需要严格的操作规范来确保实验结果的准确性和数据的可靠性。
流式细胞仪(FlowCytometer)基本原理
流式细胞术的特点
检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； 检测参数：多参数； 检测特点：单细胞水平分析； 检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒； 检测结果：精度高、准确性好； 可对目标细胞进行分选；
2、流式细胞术光信号检测
光信号的类型 散射光信号：与标记荧光素无关，
是细胞的固有参数。 前向散射光(forward scatter, FSC)； 侧向散射光(side scatter, SSC)。
FL1
FL2
散点图和伪彩图
等高图和密度图
等高图：类似于地图中的等高线，同一条线上的细胞数目相等，越在里 面的曲线代表细胞数目越多。
散点图(Dot Plot) 伪彩图(Pseudo-color Plot) 等高线图(Contour Plot) 密度图(Density Plot) 假三维图(Pseudo 3D Plot)
• 三维图(3D Plot)
直方图 Histogram
细胞的某一单参数数据的统计分布图，横坐标表示荧光信号 或散射光信号相对强度的值，单位是道数，纵坐标一般是细 胞数。
Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方 式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞DNA定量分 析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。
AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光，RNA呈 橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
……
每个细胞检测5个参数，那么获取10000个细胞，容量为 5×10000（字或双字）。
流式数据的显示方式
• 常用分析软件
流式细胞仪原理及操作步骤
流式细胞仪原理及操作步骤流式细胞仪（FCM）是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。
其中检测人白细胞表面标志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断，对淋巴细胞群和亚群进行精确分类，还能分离纯化某一群或亚群细胞。
活细胞免疫荧光技术是用于FCM检测的标本准备，染色后也能在荧光显微镜下进行观察，在某些实验条件下，活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的结果。
（一）原理活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。
（二）操作步骤制备活性高的细胞悬液（培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法）↓用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为5×10６～１×10７／ml↓取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb（5～50μl）的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1 ∶20（用DPBS稀释）灭活正常兔血清（或兔抗鼠）荧光标记物，充分振摇↓ 4 ℃30min 用洗涤液洗涤2 次，每次加液2ml 左右1000rpm×5min↓加适量固定液（如为FCM制备标本，一般加入1ml 固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100～500μl 固定液）↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察（标本在试管中可保存5～7 天）（三）试剂和器材1. 各种特异性单克隆抗体。
2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。
3. 10％FCS RPMI1640, DPBS 、洗涤液、固定液（见附录）。
4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
（四）注意事项1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10 倍的NaN３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
流式细胞仪的简要介绍与注意事项
流式细胞仪的简要介绍与注意事项(流式细胞仪,注意事项)来源：评论：0我要评论[流式细胞仪的简要介绍与注意事项(流式细胞仪,注意事项)] 一、流式细胞仪的检测范围1．流式细胞仪可以检测细胞结构，包括：细胞大小、细胞粒度、细胞表面面积、核浆比例、DNA含量与细胞周期、R NA 含量、蛋白质含量。
2．流式细胞仪可以检测细胞功能，包括：细胞表面/ 胞浆/ 核的特异性抗原、细胞活性、细胞内细胞因子、酶活性、激素结合位点和细胞受体。
[关键词:流式细胞仪注意事项]…••一、流式细胞仪的检测范围1．流式细胞仪可以检测细胞结构，包括：细胞大小、细胞粒度、细胞表面面积、核浆比例、DNA含量与细胞周期、R NA 含量、蛋白质含量。
2．流式细胞仪可以检测细胞功能，包括：细胞表面/ 胞浆/ 核的特异性抗原、细胞活性、细胞内细胞因子、酶活性、激素结合位点和细胞受体。
二、流式细胞仪的临床应用1．流式细胞术在肿瘤学中的应用：流式细胞术可以检测肿瘤细胞增殖周期、检测肿瘤细胞表面标记、癌基因表达产物、进行多药耐药性分析、检测凋亡；2．流式细胞术在血液学中的应用：检测白血病和淋巴瘤细胞、活化血小板、造血干细胞（CD34+）计数、白血病与淋巴瘤的免疫分型、网织红细胞计数、细胞移植的交叉配型和免疫状态监测；3．流式细胞术在免疫学中的应用：可以进行淋巴细胞及其亚群分析、淋巴细胞免疫分型、检测细胞因子。
三、流式细胞仪的科研应用主要有细胞动力学功能研究、环境微生物分析、流式细胞术与分子生物学研究。
四、流式细胞术常规检测时的样品制备(一) 直接免疫荧光标记法取一定量细胞（约1×106细胞/ml），直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应（如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入），孵育20～60分钟后，用PBS（pH7.2 ～7.4）洗1～2次，加入缓冲液重悬，上机检测。
本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。
流式细胞仪使用注意事项
流式细胞仪使用注意事项
- 使用预约：使用者应合理预约机器使用时间，保证自己的正常测试需求和仪器清洗时间。
如果出现实际使用时间低于预约时间50%的情况，平台技术人员应该根据其出现次数频率对其进行警告处理，并按预约
时间收取测试费用。
- 流式实验室安全规定：操作流式细胞仪设备时必须全程佩戴手套。
流式细胞仪平台实验室内禁止饮食。
使用仪器务必注意防火安全，发现
隐患立即通知管理员。
流式分析和分选人类样本需注意生物安全性，
测试后残余样本自行带走处理，仪器使用后须用clean液充分清洗；
目前流式细胞仪平台禁止做人类感染性样本，不注意生物安全者，被
发现后将终身禁用平台流式设备；PI需对本课题组样本的生物安全性
负责，如有隐瞒，将禁用该课题组使用平台流式细胞仪。
- 流式设备操作规则：没有经过平台技术员培训或培训未通过的同学，禁止独立操作仪器；练习或学习阶段的同学如需操作仪器，必须有工
作人员或者有独立使用权限的同学全程在场陪同；测试过程中如需中
途离开，分析型流式需处于standby状态，分选型流式液流需处于关
闭状态。
为防止流式细胞仪管路堵塞，样本在上机前必须经过过滤处理；提前过滤好的样本在上机前需确保样本状态，不含细胞团块等易
堵塞管路的杂质。
流式测试结束，使用者必须清洗仪器，并按照指定
方法和时间进行清洗。
周末或夜间使用完毕后，如距离下一位使用者
预约时间大于2小时，当前使用者必须关机；最后一位使用者用完流式设备后必须关机，并按照关机步骤正确关闭设备。
流式细胞仪液安全操作及保养规程
流式细胞仪液安全操作及保养规程概述流式细胞仪是一种高级的生物分析仪器，最初是用于血液分析。
现在，它已被广泛应用于分析其他种类的细胞和微生物，包括花粉、细菌、酵母菌、真菌和小型水生动物等。
在使用流式细胞仪进行样品分析时，经常需要使用不同种类的化学试剂来修饰和标记待测物，包括荧光染色试剂、离子染料等。
这些化学试剂虽然对于有效的分析是必要的，但它们也具有很高的危险性，因此需要进行特别的安全操作和保养。
本规程旨在规范流式细胞仪液操作和安全管理，以便在最大程度上保护实验人员的身体健康和设备的完好性。
液体样品管理在使用流式细胞仪时，经常需要使用各种化学试剂和液体样品。
以下是管理这些液体样品的安全操作指南：1.所有试剂和液体样品应密封存放，并标明名称、浓度和储存条件。
2.所有试剂和液体样品的使用都需要严格遵循剂量的建议，并避免直接接触肌肤、口腔和眼睛。
3.液体样品在运输和转移过程中应当使用经过验证的安全容器和工具，避免因不当操作而导致溅泼和泄漏。
4.任何泄漏或飞溅应立即清洁，避免持续使用，并避免对其他设备、试剂和人员带来影响。
操作规范下面是在流式细胞仪操作时要遵循的安全操作指南：1.在进行任何操作之前确认试剂和样品的标记和浓度，确保使用正确的试剂和样品。
2.严密关闭试剂瓶和样品瓶的盖子，并严格遵循流式细胞仪的操作程序。
3.在使用荧光染色试剂时，应尽可能避免暴露于光源或阳光下，以避免染料的失效和实验误差。
4.在流式细胞仪的运转界面中，避免不必要的操作，避免误操作损害设备。
5.在样品进入流式细胞仪前，必须通过过滤器过滤并严格按照操作步骤加样。
6.操作完成后，要及时清理设备的样品盘和针头等设备，并确认设备处于关闭状态。
设备保养以下是保养流式细胞仪设备的注意事项：1.每天完成使用后，必须对设备的各个部分进行清洗，并进行消毒及干燥处理。
2.避免使用挥发性液体或喷雾进行清洁和消毒设备。
要使用适当的清洁剂和杀菌剂，并根据操作手册中规定处理设备。
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流式细胞仪的简要介绍与注意事项(流式细胞仪,注意事项)
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[流式细胞仪的简要介绍与注意事项(流式细胞仪,注意事项)] 一、流式细胞仪的检测范围1．流式细胞仪可以检测细胞结构，包括：细胞大小、细胞粒度、细胞表面面积、核浆比例、DNA含量与细胞周期、R NA 含量、蛋白质含量。
2．流式细胞仪可以检测细胞功能，包括：细胞表面/ 胞浆/ 核的特异性抗原、细胞活性、细胞内细胞因子、酶活性、激素结合位点和细胞受体。
[关键词:流式细胞仪注意事项]…
••一、流式细胞仪的检测范围
1．流式细胞仪可以检测细胞结构，包括：细胞大小、细胞粒度、细胞表面面积、核浆比例、DNA含量与细胞周期、R NA 含量、蛋白质含量。
2．流式细胞仪可以检测细胞功能，包括：细胞表面/ 胞浆/ 核的特异性抗原、细胞活性、细胞内细胞因子、酶活性、激素结合位点和细胞受体。
二、流式细胞仪的临床应用
1．流式细胞术在肿瘤学中的应用：流式细胞术可以检测肿瘤细胞增殖周期、检测肿瘤细胞表面标记、癌基因表达产物、进行多药耐药性分析、检测凋亡；
2．流式细胞术在血液学中的应用：检测白血病和淋巴瘤细胞、活化血小板、造血干细胞（CD34+）计数、白血病与淋巴瘤的免疫分型、网织红细胞计数、细胞移植的交叉配型和免疫状态监测；
3．流式细胞术在免疫学中的应用：可以进行淋巴细胞及其亚群分析、淋巴细胞免疫分型、检测细胞因子。
三、流式细胞仪的科研应用
主要有细胞动力学功能研究、环境微生物分析、流式细胞术与分子生物学研究。
四、流式细胞术常规检测时的样品制备
(一) 直接免疫荧光标记法
取一定量细胞（约1×106细胞/ml），直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应（如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入），孵育20～60分钟后，用PBS（pH7.2 ～7.4）洗1～2次，加入缓冲液重悬，上机检测。
本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。
虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。
(二) 间接免疫荧光标记法
取一定量的细胞悬液（约1X106细胞/ml），先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原-抗体-抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。
本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。
但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。
所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。
另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。
五、质量控制和注意事项
流式细胞仪并非是完全自动化的仪器，准确的实验结果还需要准确的人工技术配合，所以标本制备需要规范，仪器本身亦需要质量控制。
（一）流式细胞术免疫学检测的影响因素和质量控制
流式细胞术在免疫学中有着广泛的应用，其免疫荧光染色的标本制备非常重要，常常由于标本制备过程中出现人为非特异性荧光干扰(尤其在间接免疫荧光染色中)或细胞浓度低等影
响检测结果。
解决这些影响因素的方法如下：
(1) 确保标本上机检测前的浓度为1X106/ml，细胞浓度过低直接影响检测结果。
(2) 使用蛋白封闭剂，封闭非特异结合位点，尤其在间接免疫荧光标记时必不可少。
常用的蛋白封闭剂为0.5%牛血清白蛋白和1%胎牛血清。
(3) 荧光抗体染色后充分洗涤，注意混匀和离心速度，减少重叠细胞和细胞碎片。
(4) 设置对照样品，采用与抗体来源同型匹配的无关对照和荧光抗体的本底对照。
(5)判定结果时，应注意减去本底荧光，为使免疫荧光的定量分析更精确，应用计算机程序软件，用拟合曲线方法从实验组的曲线峰值中减去对照组的曲线峰值，可以得到更准确的免疫荧光定量结果。
(6) 注意染色后避光，保证细胞免疫荧光的稳定。
（二）DNA倍体分析的质量控制仍没有统一的标准，各文献报道的实验结果差异较大，1993年10月美国癌症(cancer)研究组织制定了FCMDNA定的统一标准，我们根据这些标准并结合国内有经验的专家多年的实践，对FCM的DNA分析技术的质控和注意事项进行说明。
(1) 手术切除的新鲜标本或活检针吸标本取材时，要避免出血坏死组织。
(2) 标本采集后要及时固定或深低温保存，以免组织发生自溶，DNA降解，而造成测试结果的误差。
(3) 固定剂要采用对组织细胞穿透性强的浓度，70%的乙醇固定效果较好。
(4) 单细胞悬液制备过程中，注意将待测细胞成分分离出来，减少其他成分的干扰，并注意不要损伤该群细胞。
(5) 细胞样品的采集要保证足够的细胞浓度，即1X106/ml，杂质、碎片、团块和重叠细胞应<2%，对肿瘤细胞DNA异倍体的分析样品，至少有20%的肿瘤细胞存在。
(6) 石蜡包埋组织单细胞制备时要注意：取材时应选取无自溶、坏死的组织，对肿瘤组织标本，选取含肿瘤细胞丰富的区域；石蜡组织片的厚度要适宜，最好为40～50μm 。
过薄或过厚的切片均会影响检测结果；彻底脱蜡，以免残留的石蜡影响酶的消化活性，验证脱蜡是否完全的方法是弃去二甲苯，加入100%乙醇，如果无絮状物浮起，说明蜡已脱净；水化要充分，使组织还原到与新鲜组织相似的状态；注意消化的时间和消化酶的活性。
常规使用0.5%胃蛋白酶，pH 1.5。
（三）操作方面
(1)流式细胞仪在整个工作过程中处于最佳状态，能保证定量检测的准确性和检测精度。
使用标准样品调整仪器的变异系数在最小范围，分辨率在最好状态，能避免在测量过程中仪器条件的变化引起的检测误差。
(2)评价仪器精度的重要指标是仪器的变异系数（CV），对于校准样品，其CV值越小越好，CV值越小，说明仪器校正的精度越高。
校准样品包括非生物样品（荧光微球）和生物细胞样品（人淋巴细胞、鸡红细胞等）。
目前，非生物荧光微球已有商品试剂，CV一般<2%～3%。