流式细胞仪入门
流式细胞仪(Flow_Cytometer)基础简介
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FCM的定义
流式细胞仪是指，使细胞（或其 他粒子）以单个方式依次高速通过激 发光束，采集细胞被光照时产生的各 种信号，对信号进行处理，幵对各参 数进行关联分析的一种仪器。
对比
流式细胞仪是一种特殊的显微镜
流式细胞仪
流动的细胞
数量大 高速分选
显微镜
静止的细胞样本
数量少 样本难以再利用
细胞群体特征量分布
流式细胞仪（Flow Cytometer) 基础简介
中科院生物物理研究所 中国科学院蛋白质科学研究平台 2005年3月 刘春春
Hale Waihona Puke 主要内容
流式细胞仪概要 流式细胞仪的工作原理 流式细胞仪测量的对象
什么是流式细胞仪
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流式细胞仪实物
BD-Calibur
BD FACSVantage
流式细胞仪基本结构
非荧光信号
颗粒度
细胞大小
散射光信号区分裂解后的外周血细胞群
荧光信号
荧光染料被激发而发射的光信号。 定量染色 荧光信号大小 被标记组分含量的定量
多荧光标记胞内多种组分，实现多参数测量
PI＋Annexin－V细胞凋亡检测
DNA 含 量 -PI Annexin-V
PE＋FITC荧光标记检测外周 血裂解后细胞群
光信号收集
光信号分离，导向，各探测通道PMT 接收幵转化为电信号。
激光束
侧向散射 光，荧光
1
二色镜 2
3
细胞
前向 散射 光
收集透镜
带通滤波片 光电倍增管
数据处理
光信号
FSC SSC FL1 FL2 FL3
电信号
对数 线性 线性 线性 对数
流式细胞仪
（免疫分型建议SSC用对数，观察粒细胞颗粒性时 除外）
比较对数倍增与线性倍增
蓝色：白细胞；紫色：红细胞；红色：血小板
什么时候用log,什么时候用lin
• 观察粒细胞的颗粒性用线性或者对数，观 察细胞群之间的颗粒性关系，建议用对数。
1 2 34 6 7
道数值
150 160 170 .. 190
FITC PMT检测的荧光值
PE单阳性细 胞群
PE FL
二维点图
双阳性细胞群
双阴性细胞 群
FITC FL
FITC单阳性细 胞群
补偿，COMPENSATION
FITC
F FITC
L
1 detector
FL2-%FL1
F L
PEΒιβλιοθήκη 2 detector当天 标本
(2) SSC – 颗粒性、结构复杂性
侧向角光散射
成熟粒细胞>单核细胞>原幼细胞 >淋巴细胞>红细胞
CD8 PE CD3 FITC
(3) 荧光标记
激光
CD19-PerCP
T cell
分光镜
带通 滤片 荧光探测器
FL-1 (绿色)
FL-2 (红色)
FL-3 (远红)
CD3+ CD8+
激光光源-激--发-荧光素-发--射-荧光发射峰
• 光路： 1、激光光源及光束成形系统： 空气冷却激光： 氩离子(488nm)、 红色氦氖激光(633nm)、 紫色激光（405nm） 水冷激光 2、光学系统：透镜、滤光片、小孔
流式细胞仪操作流程
流式细胞仪操作流程流式细胞仪（Flow Cytometer）是一种广泛应用于生物医学研究领域的仪器，它能够对单个细胞进行快速、准确的细胞分析和分类。
本文将详细介绍使用流式细胞仪的操作流程。
一、实验准备在进行流式细胞仪实验之前，需要做好以下准备工作：1. 准备样品：收集和准备待分析的细胞样品，确保样品质量符合要求。
处理样品时要注意细胞的保存和处理条件，以避免样品的污染或破坏。
2. 准备反应体系：根据实验的需要，按照标准操作规程制备所需的反应液和缓冲溶液。
3. 检查和校准仪器：在使用流式细胞仪前，需要对仪器进行检查和校准，确保仪器状态良好，获得准确的实验结果。
二、仪器开机和设置1. 打开流式细胞仪电源，并等待仪器启动完成。
2. 进行仪器的初始化设置，包括选择所需的参数和实验模式等。
3. 设置流式细胞仪的激发和检测通道，根据实验需要选择适当的滤光片和荧光探针。
调整激光功率和检测灵敏度，确保后续实验过程中的信号质量。
三、样品加载和检测1. 将样品转移到适当的离心管中，并进行样品标记。
根据实验需要可以使用荧光标记物、抗体等对细胞进行特异标记。
2. 打开流式细胞仪的样品载架，将样品离心管安置在载架上，并将载架插入流式细胞仪的样品槽中。
3. 启动数据采集软件，设置样品参数和实验条件。
选择合适的采集速度和事件数目，确保获得足够的数据。
4. 开始数据采集，点击软件上的“实时运行”按钮，流式细胞仪将开始读取样品中的细胞信息，并将其转化为电子信号。
5. 采集完成后，保存数据并关闭数据采集软件。
四、数据分析1. 导出数据文件：根据实验需要，将采集到的数据文件导出到数据分析软件中进行进一步处理。
2. 进行数据筛选和清洗，去除噪音污染和非特异信号。
3. 根据实验的目的和问题，选择合适的数据分析方法，对细胞数据进行统计学和生物学分析。
4. 生成结果图表：根据数据分析结果，生成合适的图表或图像，用于展示实验结果和研究发现。
5. 结论和讨论：根据数据分析结果，撰写实验结论和讨论，解释实验结果并提出相应的科学推论。
流式细胞仪的使用流程
流式细胞仪的使用流程1. 简介流式细胞仪 (Flow Cytometer) 是一种先进的生物学实验设备，用于检测和分析细胞的形貌、大小、形态、功能和数量等特征。
它可通过流式技术将单个细胞排列成单个的流束，然后通过激光器进行激发和检测，实现对细胞的高通量分析。
本文将介绍使用流式细胞仪的具体使用流程，帮助用户能够正确、高效地操作该设备。
2. 准备工作在正式操作流式细胞仪之前，需要做一些准备工作：2.1 样本准备•从培养皿中取出待分析的细胞，并进行适当的处理，如洗涤、离心等。
•将细胞悬浮液转移至离心管中，并进行适当的离心操作，以获得较为纯净的细胞样本。
2.2 仪器准备•打开流式细胞仪的电源开关，并等待设备启动完成。
•根据实验需要，调整仪器的相关参数，如流速、激发光源、检测通道等。
•准备合适的背景溶液，用于样本的稀释和冲洗。
3. 操作步骤了解了准备工作后，下面将介绍流式细胞仪的具体操作步骤：3.1 样本准备与装载•使用移液器将经过处理的细胞悬浮液取出一定量至样本管中。
•观察样本管中的细胞悬浮液是否均匀分散，如果存在沉淀则轻轻摇晃样本管使之均匀。
3.2 仪器设置•在流式细胞仪的操作界面上设置相应的参数，如流速、激发光源、检测通道等。
•检查仪器的液路系统是否正常工作，如检查液体的流速、流量传感器是否正常等。
3.3 校准仪器•使用已知样本进行仪器的校准。
通常使用亮度微珠进行仪器的调整和刻度。
•在仪器设置界面选择亮度微珠的通道，并进一步设定检测参数以达到最佳校准效果。
3.4 样本测试•将样本管装载至流式细胞仪中的样本架上，确保样本与仪器的光学系统的光路对准。
•启动流式细胞仪，开始测试。
•根据实验需要，选择合适的激发光源和检测通道，进行样本的快速测试。
•在测试过程中，可根据实验需要采集样本的荧光和散射信号，以及其他额外的参数。
3.5 数据分析•测量完成后，通过流式细胞仪软件导出所测细胞的数据文件。
•使用相应的数据分析软件对所测细胞的数据进行分析和解读。
流式细胞仪入门知识
流式细胞仪入门-----导航篇二OOO年四月目录前言第1章综述第2章液流系统第3章散射光信号及荧光信号3.1 散射光信号3.2 荧光信号第4章光电系统4.1 光平台4.2 光学滤片4.3 信号探测器4.4 阀值第5章数据分析5.1 数据采集及显示5.2 设门5.3 细胞亚群的数据分析5.4 流式细胞仪其它应用的数据分析第6章分选6.1 分选第7章激光器及光路校正7.1 激光器的工作原理7.2 光路校正第8章答案序论学习仪器的最好方法是操作仪器，然而在理解原理的基础上进行仪器操作无疑会起到事半功倍的作用。
本书介绍了流式细胞仪的基本知识，并从不同角度详尽阐述了各种台式机（FACScan TM，FACSort TM，FACSCalibur TM，和BD LSR）与大型机（FACS Vantage TM，FACSVantage TM SE，和FACStar PLUSTM）之间的不同。
阅读本书有助于增强读者操作仪器的动手能力和经验。
第一章综述流式细胞术是一项快速检测分析单个粒子多物理特性的高技术，通常指细胞通过激光束时在液流中的特性，即粒子的大小，密度或是内部结构，以及相对的荧光强度。
通过光电系统记录细胞的散射光信号和荧光信号可得知细胞特性。
流式细胞仪主要由三部分组成：流动室和液流系统；光路系统以及电系统。
其作用如下：液流系统：依次传送待测样本中的细胞到激光照射区。
光路系统：细胞由激光激发，通过光学滤片产生光信号，并传送到相应的探测器。
电系统：把光信号转换为电信号。
对于有分选装置的仪器，电系统可初始化分选条件。
在流式细胞仪中，细胞被传送到液流中的激光照射区。
任何存在于悬液中的直径为0.2-150微米的粒子或细胞都适用于流式分析。
在实际工作中，用实体组织进行流式细胞分析往往是不可能的，分析之前必须对其进行分解。
被液滴包绕的粒子称为细胞液柱，当粒子经过激光照射区时，通过激光激发产生散射光。
含有荧光的粒子就会表现出其荧光特性。
流式细胞仪操作步骤（FACSCalibur）
流式细胞仪操作步骤（FACSCalibur）⼀、开机程序：1.检查鞘液桶和废液桶。
确认鞘液充满状态（鞘液为鞘液桶体积的3/4位置，可以连续⼯作3个⼩时左右）、盖紧⿊盖、管道畅通、废液桶有⾜够空间容纳本批标本排弃的废液。
如果要添加鞘液，要先释放鞘液桶中⽓压。
2.依次打开流式细胞仪FACSCalibur稳压器、主机开关、电脑开关，打印机。
3.⽓压阀置于加压位置，待流式细胞仪处于STANDBY状态，做Prime，以排除管路中⽓泡。
⼆、运⾏FACSComp软件、检查仪器状况1.制备三⾊标准微球样本。
⼀般情况向1ml鞘液（或过滤PBS）中加⼊1滴质控⼩微球，也可以根据实际情况调节浓度。
2.机器预热5 min，打开FACSComp软件，选择保持路径。
选择所需校正内容，如果使⽤的微球是新⼀批产品要输⼊微球的批号。
3.在软件界⾯左侧Assay Selection选项中选择质控类型，即实验过程中是否需要清洗样品。
4.上样品，微球溶液上样之前要充分混匀。
功能键设置在“RUN”。
5.仪器⾃动检查，并做电压、补偿等设置。
6.FACSComp软件运⾏完毕，显⽰结果通过测试。
7.做Set up。
8.打印校正结果，退出FACSComp程序。
备注：在质控过程中，如果提⽰收集细胞速度慢可以提⾼细胞收集速度，但是在调节灵敏度（Sens）时，⼀定要⽤“Low”的状态上样，保证仪器灵敏度的准确。
在使⽤仪器过程中要养成好的习惯，在上样品过程中，仪器保持在“Low”“Standby”状态。
三、样品分析软件：CellQuest Pro软件，选择“联机”。
1.（2）对实验样本进⾏命名；（3）对实验通道进⾏预设（FSC,SSC,FL1-FL4）。
备注：如果界⾯被关闭，重新调出步骤：2.调出质控模板。
3.画图选择画图⼯具（⼀般选择散点图），Inspect界⾯会⾃动弹出，对⼏个常⽤选项进⾏设定：将散点图选中（⽤⿏标点击散点图边框才能够选中图形），将更改横纵坐备注：第⼀个散点图横坐标为FSC，纵坐标为SSC。
流式细胞仪操作步骤
流式细胞仪操作步骤一、样品准备1. 确认样品是否符合实验要求，如细胞浓度、荧光标记等。
2. 根据实验需求，选择合适的试管和细胞样品。
3. 确认样品中是否有杂质或污染物，必要时进行离心和洗涤。
4. 尽可能缩短样品处理时间，避免细胞活性受到影响。
二、样品上机1. 打开流式细胞仪，确认仪器正常工作。
2. 将样品加入到流式细胞仪的样品管中。
3. 根据实验需求，设置合适的流速和压力。
4. 开始采集数据，观察仪器工作状态，确保数据准确可靠。
三、参数设置1. 根据实验需求，选择合适的荧光标记和检测参数。
2. 根据细胞类型和特性，设置合适的门控和阈值。
3. 确认仪器校准和定标工作已完成。
4. 根据需要，设置多色分析，以便于进行细胞分群和定量分析。
四、数据采集1. 在采集数据时，观察仪器工作状态，确保数据准确可靠。
2. 根据实验需求，确定采集的数据量，确保数据具有代表性。
3. 记录采集数据的时间和条件，以便于后续数据分析。
4. 在采集数据时，注意观察细胞活性、浓度和分布情况，及时调整实验条件。
五、数据分析1. 使用专业软件对采集的数据进行处理和分析。
2. 根据实验需求，对数据进行去噪、归一化和定量分析。
3. 进行细胞分群、细胞周期和细胞凋亡等分析。
4. 对数据进行统计学分析和可视化展示。
六、结果输出1. 根据分析结果，输出相应的图表和数据表格。
2. 对结果进行解释和注释，以便于读者理解和应用。
3. 如果需要，可将结果整理成报告形式，提供给相关人员参考和使用。
七、质量控制八、实验室清理。
1流式细胞仪基础知识介绍
1流式细胞仪基础知识介绍流式细胞仪（Flow Cytometry）是一种通过流式技术对细胞进行快速分析和计数的仪器。
它结合了光学、电子和计算机技术，可以对单个细胞进行高效的多参数分析，可广泛应用于生命科学研究、临床诊断、药物研发等领域。
流式细胞仪的基本原理是通过激光束照射样本中的细胞，并利用光学系统收集和分析由细胞散射、荧光等产生的光信号。
其主要组成部分包括激光器、光学系统、流体系统和电子计算机系统。
激光器是流式细胞仪的光源，产生高强度的单色激光束。
常用的激光器有氩离子激光器、固态激光器和半导体激光器等，不同波长的激光器可用于激发不同荧光染料。
光学系统包括一系列透镜和滤光片，用于聚焦和收集激光束，并选择感兴趣的荧光信号进行检测。
透镜系统可以调整激光束的聚焦位置和扩展角度，使样品中的细胞逐个通过激光束。
流体系统通过将样品溶液注入流式细胞仪的流体管道中，使细胞以单个细胞的形式通过激光束，避免了背景信号的干扰。
流体系统还可以调节细胞的流速，以控制细胞之间的间隔，避免细胞重叠。
电子计算机系统是流式细胞仪的核心部分，用于控制仪器的运行和获得并分析光信号。
通过相应的软件，可以对细胞进行多参数分析，如细胞大小、形态、DNA含量、荧光标记等。
在流式细胞仪中，细胞通过激光束照射后，会产生散射光和荧光光信号。
散射光主要分为正向散射光（Forward Scatter，FSC）和侧向散射光（Side Scatter，SSC）。
FSC信号反映细胞的大小和复杂度，SSC信号反映细胞内部的结构和颗粒物质。
这些散射光信号可以提供有关细胞的一些形态信息。
荧光染料是流式细胞仪中常用的标记物质，通过与细胞中的特定成分结合，可以用来标记不同的细胞类型、活性分子和细胞内的蛋白质等。
荧光染料在激发后发出特定的荧光信号，可以通过滤光片选择性地收集和检测。
通过同时使用多种荧光染料，可以对不同的生物学参数进行同时分析。
流式细胞仪的数据分析可以通过绘制细胞密度分布曲线、细胞聚类分析、细胞亚群分析等方法进行。
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流式细胞仪入门----- 秦华 译目录前言第1章综述第2章液流系统第3章散射光信号及荧光信号3.1 散射光信号3.2 荧光信号第4章光电系统4.1 光平台4.2 光学滤片4.3 信号探测器4.4 阀值第5章数据分析5.1 数据采集及显示5.2 设门5.3 细胞亚群的数据分析5.4 流式细胞仪其它应用的数据分析第6章分选6.1 分选第7章激光器及光路校正7.1 激光器的工作原理7.2 光路校正第8章习题答案序论学习仪器的最好方法是操作仪器，然而在理解原理的基础上进行仪器操作无疑会起到事半功倍的作用。
本书介绍了流式细胞仪的基本知识，并从不同角度详尽阐述了各种台式机（FACScan TM，FACSort TM，FACSCalibur TM，和BD LSR）与大型机（FACS Vantage TM，FACSVantage TM SE，和FACStar PLUSTM）之间的不同，且附习题及答案。
阅读本书有助于增强读者操作仪器的动手能力和经验。
第一章综述流式细胞术是一项快速检测分析单个粒子多物理特性的高技术，通常指细胞通过激光束时在液流中的特性，即粒子的大小，密度或是内部结构，以及相对的荧光强度。
通过光电系统记录细胞的散射光信号和荧光信号可得知细胞特性。
流式细胞仪主要由三部分组成：流动室和液流系统；光路系统以及电系统。
其作用如下：z液流系统：依次传送待测样本中的细胞到激光照射区。
z光路系统：细胞由激光激发，通过光学滤片产生光信号，并传送到相应的探测器。
z电系统：把光信号转换为电信号。
对于有分选装置的仪器，电系统可初始化分选条件。
在流式细胞仪中，细胞被传送到液流中的激光照射区。
任何存在于悬液中的直径为0.2-150微米的粒子或细胞都适用于流式分析。
在实际工作中，用实体组织进行流式细胞分析往往是不可能的，分析之前必须对其进行分解。
被液滴包绕的粒子称为细胞液柱，当粒子经过激光照射区时，通过激光激发产生散射光。
含有荧光的粒子就会表现出其荧光特性。
散射光和荧光由光路系统（相应的透镜，滤片和探测器）收集。
分光器和滤光片引导散射光和荧光至相应的探测器，把光信号转换为电信号。
单个粒子通过其表现出的光散射和荧光属性，通过列表模式（List mode）完成数据采集，并对样本中的细胞亚群进行分析。
图1-1 散射光和激发光信号转换成为计算机可处理的充电脉冲习题：综述1 流式细胞仪可测量细胞或粒子的哪些属性？2 大多数流式细胞仪使用何种光源？3 流式细胞仪的三大系统是什么？4 哪种类型的生物样本最适于做流式细胞分析？5 液流包绕细胞形成？6 带有荧光的细胞通过激光束时，会产生哪两种光信号？7 由粒子激发的光由收集。
8 所有流式细胞测量是在单个细胞上同时进行吗？（对错）9 在进行流式分析之前粒子必须是单个细胞悬液吗？（对错）第二章液流系统液流系统的作用是依次传送待测样本中的细胞到激光照射区，其理想状态是把细胞传送到激光束的中心。
而且在特定时间内，应该只有一个细胞或粒子通过激光束。
因此，必须在流动室内把细胞注入鞘液流。
流动室是液流系统的核心部件，台式机中流动室称为样品槽，大型机称之为喷嘴。
在流动室内细胞液柱聚焦于鞘液中心，细胞在此与激光相交。
流动室内充满鞘液，根据层流原理，在鞘液的约束下，细胞排成单列出流动室喷嘴口，并被鞘液包绕形成细胞液柱。
这种同轴流动的设计，使得样品流和鞘液流形成的流束始终保持着一种分层鞘流的状态，这个过程称为流体聚焦。
该原理适用于所有流动室，如图2-1和2-2所示：图2-1 细胞液柱通过样品槽产生流体聚焦图2-2 细胞液柱通过喷嘴产生流体聚焦样本压力和鞘液压力是不同的，且样本压力总是大于鞘液压力。
样本压力调节器通过改变样本压力的方法控制样本流速。
z台式机：单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出，粒子或细胞在流动室内与激光相交（图2-1）。
除BD LSR型台式机有样本压力细调旋钮外，大多数台式机都采用固定的样本压力（分低，中，高速）。
z大型机：单个细胞悬液从喷嘴喷出后，粒子或细胞在流动室外与激光相交（图2-2）。
且样本压力连续可调。
增加样本压力就是通过加宽液柱的方法增加样本流速。
换言之，在特定时间内，允许更多细胞通过液流。
当液柱变宽时，一些流经激光束的细胞会偏离中心，光斑也会偏离理想角度，这在一定程度下是允许的。
z高流速适用于定性测量，如免疫表型。
样本流变宽，细胞间距离缩短，这样在单位时间内流经激光照射区的细胞数量增加，可以快速获取数据。
z低流速促使样本流变窄，单个细胞得以依次通过，这样大多数细胞可流经激光束的中心，细胞受激光照射的能量比较均一，因而低流速适用于检测分辨率要求高的实验，如DNA分析。
为确保粒子和细胞完全通过激光束，正确调节样本压力对实验操作是至关重要的。
习题：液流系统1 流式细胞仪中液流系统的作用是什么？2 细胞流经激光束时影响激光照射细胞的两个因素是什么？3 在特定时间内，应该有多少细胞流过激光束？4 单个细胞悬液在内注入。
5 鞘液环包样品并使之居中的过程称为效应。
6 什么调节器可以控制细胞液柱的宽窄？7 对于台式机，样本的固定压力是多少。
8 增加样本压力，也就是样本流速和液柱。
9 DNA研究对检测分辨率要求较高，推荐流速为多少。
10 加大流速会降低检测分辨率。
（对错）11 定性检测时可使用高流速。
（对错）第三章散射光信号和荧光信号的检测上一章我们了解到粒子或细胞是如何依次通过液柱的，本节我们首先学习激光如何照射在单个细胞上的。
3.1 散射光信号粒子折射激光产生散射光信号。
散射光不依赖任何细胞样品的制备技术（如染色），因此被称为细胞的物理特性，即细胞的大小和内部结构。
散射光与细胞膜，核膜以及细胞结构的折射性、颗粒性密切相关，细胞形状和表面形貌也对其产生影响。
前向角散射：前向角散射（FSC）光与被测细胞的大小和面积有关，检测的是激光束照射方向与收集散射光信号的光电倍增管轴向方向的散射光信号（见图3-1）。
FSC不受细胞荧光染色的影响，常用于免疫表型分析的信号处理。
侧向角散射：侧向角散射（SSC）光与被测细胞的颗粒密度和内部结构有关，对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感（见图3-1）。
SSC收集与激光束正交90度方向的散射光信号。
图3-1 细胞的光散射特性上述两种信号都是来自于激光原光束，目前采用这两个参数组合，可区分不同种类的细胞亚群，同时可获得细胞相关的重要信息，下图（图3-2）为FSC和SSC组成的二维散点图，从图中可以很容易把全血样本中淋巴细胞、单核细胞及粒细胞区分开。
图3-2 FSC、SSC二维散点图习题：散射光信号1 什么时候会发生光散射现象。
2 光散射信号与细胞的哪些特性有关。
3 与激光束方向相同的光散射称为散射。
4 FSC与细胞的哪些特性相关？5 与激光束方向呈90度角的光散射称为散射。
6 SSC与细胞的和相关。
7 和双参数的组合可区分不同种类的细胞亚群。
3.2 荧光信号荧光物质吸收符合其波长范围的光能量，内部电子受激上升到高能级。
然后受激电子迅速衰落回基态，释放过剩能量成为光子。
这种能量的转换称为荧光。
能够激发荧光物质的波长范围称为激发光谱。
因为更多的能量消耗在吸收转换而不是荧光转换中，所以发射光波长要高于激发光波长。
荧光物质的发射波长范围叫做发射光谱。
目前的流式细胞仪大多采用氩离子激光器，因为488nm的激光器能够激发一种以上的荧光（详见第7章）。
光源的谱线愈接近被激发物质的激发光谱的峰值，所产生的荧光信号愈强。
FITC的激发光谱如图3-3所示， 488nm非常接近FITC的激发光谱的峰值，所以FITC被激发时会表现出最强荧光信号，而当FITC被其波谱范围内的其它波长激发时，也会检测到荧光，但信号强度不会这么高。
图3-3 FITC、PE、PerCP、APC染料的激发光谱如果激发光波长都是488nm，而发射光波长又不是极其接近的话，我们可以同时检测两种以上的荧光。
如FITC和PE双染就符合这种条件。
这两种荧光素的发射光谱如图3-4所示。
虽然PE 的激发光谱的峰值不是488nm，但也足以检测到荧光。
更重要的是，FITC的发射光波长是530nm，PE的发射光波长是570nm。
他们的发射光波长足够远，可以使用不同的检测器。
被检测到的荧光信号数量与粒子中标记上的分子数量成正比。
图3-4 FITC、PE、PerCP、APC染料的发射光谱图3-5 荧光标记抗体对细胞表面抗原的特异性结合对单克隆抗体进行荧光染色，通过分析细胞表面抗原标记确认细胞类型（见图3-5）。
在细胞的混合群体中，我们使用不同的荧光染料区分细胞亚群。
每个亚群的染色模式与FSC和SSC数据相结合，用于识别样本中的细胞种类，并可以得到各细胞亚群的百分含量。
而且，还可以对感兴趣的细胞进行再分选。
习题：荧光信号1 当荧光物质吸收激光能量，并释放过剩能量时，会发射。
2 荧光物质能被激光激发出荧光的波长范围称为。
3 由荧光染料发射的波长称为。
4 在流式细胞仪中通常采用什么激光器。
5 能够激发FITC和PE的波长是多少。
6 流式细胞仪最常用的两种荧光素是和。
7 荧光素标记抗体用于检测。
第四章 光学系统光学系统由光学激发器和光学收集器组成。
光学激发器包括激光和透镜，透镜用于形成激光束，并使之聚焦。
光学收集器则由若干透镜组成，用于收集粒子发射的光束---激光束相互作用，透镜组和滤片发送激光束至相应的光学探测器。
光平台的设计可实现以上功能。
4.1 光平台流式细胞仪的光平台提供了一个固定平面，将激光源、光学激发器和收集器控制在一个固定的位置。
因而台式机的流动室和光路是固定的，能够保证光斑和样本流自始至终保持恒定。
图4-1和图4-2分别为台式机 FACS Calibur 和 BD LSR 的光平台系统。
图4-1 台式机 FACS Calibur 光平台系统图4-2 台式机 BD LSR光平台系统在大型机中，当液流流过喷嘴时，激光束通过消色差透镜组以最佳角度和位置截取液流。
由于光斑和液流位置会发生变化，所以大型机的光路没有台式机稳定，需要每日优化。
光路不正有可能导致粒子受激光照射的能量不均一，从而被激发出的荧光强度也不相同，造成测量误差。
大型机的光平台系统见图4-3。
图4-3 大型机 FACS Vantage SE 光平台系统习题：光平台1 光平台为 的激光器提供了一个固定平面。
2 保证所有细胞受到均一的光照强度的两个必要条件是什么。
3 每次使用大型机时都需要进行光路校正（对 错）。
4 在台式机中，固定的 能够保证激光截取 的位置是不变的。
4.2 光学滤片当细胞或粒子流过激光照射区时，SSC和荧光信号很弱，需要使用光电倍增管（PMTs）收集，而FSC信号很强，由光电二极管收集即可。
所有信号经由透镜组和滤片组到达相应的检测器。