《细胞实验》13 流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程
流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程 - 线粒体膜电位变化检测细胞凋亡
线粒体膜电位变化检测细胞凋亡实验原理JC-1（5,5′,6,6′-Tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide）是一种广泛用于检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential)△Ψm的理想荧光探针。
可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。
在线粒体膜电位较高时，JC-1 聚集在线粒体的基质(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以产生红色荧光（FL-2 通道）；在线粒体膜电位较低时，JC-1 不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1 为单体(monomer)，可以产生绿色荧光（FL-1 通道）。
这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。
常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。
线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。
通过JC-1 从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到细胞膜电位的下降，同时也可以用JC-1 从红色荧光到绿色荧光的转变作为细胞凋亡早期的一个检测指标。
JC-1 单体的最大激发波长为514nm，最大发射波长为527nm；JC-1 聚合物(J-aggregates)的最大激发波长为585nm，最大发射波长为590nm。
实验用品1.12⨯75mm 的Falcon 管和15ml 聚苯乙烯离心管2.微量加样器和加样头3.线粒体检测试剂盒（货号551302，100tests），包括JC-1和10 ⨯ Assay Buffer, 注：每个KIT 包括 4 小瓶JC-1 试剂，每小瓶试剂足够检测25 个样本4.离心机5.CO2 培养箱6.流式细胞仪样本制备图1：试剂准备和JC-1 染色步骤总揽1.在JC-1粉末中加入125ulDMSO使其充分溶解，配成JC-1 Stock Solution，需根据实验的量分装-20度保存。
2.根据样本量配制JC-1 Working Solution，每个样品500ul 1×Assay Buffer + 5ulJC-1 Stock Solution。
细胞凋亡实验步骤及注意事项
细胞凋亡实验步骤及注意事项Last revised by LE LE in 2021细胞凋亡实验步骤及注意事项一、实验目的1、掌屋凋亡细胞的形态特征2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的方法二、实验原理细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。
凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。
它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。
细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。
在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园，细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体，凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。
在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外，不会影响其它细胞，因而不引起炎症反应。
在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。
核DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。
如果对核DNA进行琼脂糖电泳，可显示以180-200bp为基数的DNAladder（梯状带纹）的特征。
相比之下，坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。
细胞在坏死早期即丧失质膜完整性，各种细胞器膨胀，进而质膜崩解释放出其中的内容物，引起炎症反应，坏死过程中细胞核DNA虽也降解，但由于存在各种长度不等的DNA片断，不能形成梯状带纹，而呈弥散状。
一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这些因素在诱导凋亡的同时，也可产生细胞坏死，这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏感程度。
三尖杉酯碱（HT）是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病，急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。
研究表明HT在0.02~5μg/ml范围内作用2小时，即可诱导HL-60细胞凋亡，并表现出典型的凋亡特征。
流式细胞仪操作流程(单标)
流式细胞仪操作流程(单标)一、开机(务必按照此顺序开机)1、打开下面的小门，推上电源2、打开插线板电源开关3、开电脑4、打开流式细胞仪开关二、软件准备1、打开软件2、点击菜单栏的Cytometer，待流式细胞仪与电脑自动连接后会自动出现startup 和shutdown选项，点击startup，系统提示按确定。
（等待5～6min startup 完成后再继续）2、在出现的Browser栏中依次选择new folder——new experiment——new specimen——new tubes，按照实验组数给new specimen编号，按照每一组实验试管数给new tubes 编号。
3、在右边显示屏中拽出Global sheet，点击Dot Plot绘制散点图，点击Histogram绘制直方图。
以FITC单标抗体为例，首先绘制FSC-A为横坐标、SSC-A为纵坐标的散点图（图1），然后绘制以FITC-A为横坐标、SSC-A为纵坐标的散点图（图2），最后绘制以FITC-A为横坐标、count为纵坐标的直方图（图3）。
4、点击菜单栏中的populations，选择create statistics view。
三、上机操作1、将试管放置在流式细胞仪上，在左侧显示屏的Acquisition Dashboard中点击acquire data，此时流式细胞仪开始工作。
2、根据图1中细胞的位置，在Cytometer FACScanto 栏中的parameters标签中调节FSC和SSC的电压大小，使主群细胞在图1上处于居中的位置。
3、点击右侧显示屏的Polygon Gate按钮，在图1中选择要求测量的主群细胞，可见图1中出现P1，并且其中的细胞变成红色。
4、选择图2、图3，分别在左侧显示屏的Inspector-Dot Plot栏中点击P1的复选框，可见图2、3中的图象均变成红色，即要求细胞仪检测选定的细胞P1。
流式细胞仪原理及操作步骤
流式细胞仪原理及操作步骤流式细胞仪（FCM）是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。
其中检测人白细胞表面标志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断，对淋巴细胞群和亚群进行精确分类，还能分离纯化某一群或亚群细胞。
活细胞免疫荧光技术是用于FCM检测的标本准备，染色后也能在荧光显微镜下进行观察，在某些实验条件下，活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的结果。
（一）原理活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。
（二）操作步骤制备活性高的细胞悬液（培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法）↓用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为5×10６～１×10７／ml↓取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb（5～50μl）的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1 ∶20（用DPBS稀释）灭活正常兔血清（或兔抗鼠）荧光标记物，充分振摇↓ 4 ℃30min 用洗涤液洗涤2 次，每次加液2ml 左右1000rpm×5min↓加适量固定液（如为FCM制备标本，一般加入1ml 固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100～500μl 固定液）↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察（标本在试管中可保存5～7 天）（三）试剂和器材1. 各种特异性单克隆抗体。
2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。
3. 10％FCS RPMI1640, DPBS 、洗涤液、固定液（见附录）。
4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
（四）注意事项1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10 倍的NaN３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
流式细胞仪操作规程
流式细胞仪的使用程序分子病毒实验室一．开机程序1．检查稳压器电源，打开电源，稳定 5 分钟。
2.打开储液箱，倒掉废液，并在废液桶中加入400ml漂白水原液。
打开压力阀，取出鞘液桶，将鞘液桶加至 4/5 满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFIow），合上压力阀。
确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。
3.将 FACSCalibur 开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是 STANDBY，预热5-10分钟。
排出过滤器内的气泡。
4.如果需要打印，打开打印机电源。
5.打开电脑 , 等待屏幕显示出标准的苹果标志。
6.执行仪器 PRIME 功能一次，以排除 Flow cell 中的气泡。
7.分析样品时，先用 FACAFIow或PBS进行HIGH RUN约2分钟。
做过分选后，每次开机后需冲洗管道：向分选装置上装上两个 50ml 离心管，不接通浓缩系统，摁下右下角白色按钮开始冲洗。
待自动停止后接通浓缩装置，同上法冲洗一次。
预设获取模式文件(Acquisition Template Files)从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗，可利用此视窗编辑一个1.获取模式文件。
2.选取屏幕左列绘图工具中的Dot plot，绘出一个或多个Dot Plots（点图）。
从Dot Plot对话框中选取Acquisition作为图形资料来源，并确定适当的 x 轴和y 轴参数。
3.选取屏幕左列绘图工具中的 Histogram，同上法可绘出 Histogram （直方图）。
4.将此视窗命名后储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuestFolder \EXP文件夹中，下次进行相同实验时可直接调用。
. 本计算机中已设定两个模式文件：ACQ和EXP，储存于FACStationG3\BD Applications \CELLQuest \EXP 文件夹中，ACQ 用于细胞 DNA 检测， EXP用于细胞表面标志分析。
流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程 - 凋亡细胞的 DNA 断裂片段分析
凋亡细胞的D N A断裂片段分析
实验原理
在细胞发生凋亡后，最早出现胞膜外翻等现象，之后发生的程序性改变之一，就是细胞核酸内切酶激活，出现DNA 断裂片段。
核酸酶将染色质的高级结构断裂为50-300kb 的片段，最终断裂为200bp 大小的DNA 碎片。
DNA 碎片检测的方法是外源性TdT 酶催化反应，常指“end-labeling”或“TUNEL” (terminal deoxynucleotidyltransferase dUTP nick end labeling)。
现在可以使用APO-DIRECT Kit，用流式细胞术来检测凋亡细胞由于DNA 断裂，造成DNA 链3’-OH 增多的情况。
在APO- DIRECT 分析中，TdT 酶催化DNA 单链和双链3’-OH 末端非模板依赖性的dUTP FITC 掺入反应。
由于采用了直接荧光标记的FITC-dUTP，所以一步反应后，就可以在流式细胞仪上检测DNA 碎片。
APO-DIRECT Kit（Cat. No. 6536KK）试剂盒：
实验用品
1.一次性12⨯75mm Falcon 试管
2.蒸馏水
3.PBS 缓冲液：含0.1%NaN3，过滤后2-8︒C 保存
4.固定液：含1%多聚甲醛的PBS 缓冲液
5. 70%乙醇
6.冰浴箱
7.微量加样器和加样头
8.APO-DIRECT Kit 试剂盒
9.流式上机检测。
流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程 - BrdU Flow Kits 检测细胞增殖
B r d U F l o w K i t s检测细胞增殖实验原理BrdU中文全名5-溴脱氧尿嘧啶核苷，为胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活体注射或细胞培养加入，而后利用抗Brdu 单克隆抗体，荧光染色，显示增殖细胞。
同时结合其它细胞标记物，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义。
BrdU Flow Kits是用BrdU 染色和流式分析结合高效的试剂盒，包括在BrdU 存在下培养细胞，以适宜浓度的DNA 酶使胞内DNA 变性，加强掺入BrdU 与抗体的亲和力，同时保留胞内蛋白结构和荧光素荧光强度，从而避免了DNA 变性条件与胞内及表面标志同时检测条件的冲突，运用荧光标记的抗细胞表面抗原单抗及抗细胞因子单抗,结合固定、破膜、通透等处理技术使同时检测细胞活化、增殖、DNA 合成及胞内细胞因子的分泌成为可能。
7-AAD染色总DNA，通过BrdU和7-AAD双色染色就能刻画中细胞在整个细胞周期中增殖时期的特点。
BrdU Flow Kits 试剂盒FITC BrdU Flow KitCat. No. 559619 (50 tests) Cat. No. 557891 (4×50 tests)APC BrdU Flow KitCat. No. 552598 (50 tests) Cat. No. 557892 (4×50 tests)1.抗BrdU荧光抗体每管50μl 染色50 样本(106 cells/样本). FITC BrdU Flow Kit(Cat. No. 559619) 包含50μl FITC anti-BrdU抗体。
APC BrdU Flow Kit (Cat. No.552598), 包含50 μl APC anti-BrdU抗体。
抗体使用前用BD Perm/Wash Buffer按照1:50稀释。
每个样本加入50 μl 稀释抗体。
流式细胞仪操作步骤（FACSCalibur）
流式细胞仪操作步骤（FACSCalibur）⼀、开机程序：1.检查鞘液桶和废液桶。
确认鞘液充满状态（鞘液为鞘液桶体积的3/4位置，可以连续⼯作3个⼩时左右）、盖紧⿊盖、管道畅通、废液桶有⾜够空间容纳本批标本排弃的废液。
如果要添加鞘液，要先释放鞘液桶中⽓压。
2.依次打开流式细胞仪FACSCalibur稳压器、主机开关、电脑开关，打印机。
3.⽓压阀置于加压位置，待流式细胞仪处于STANDBY状态，做Prime，以排除管路中⽓泡。
⼆、运⾏FACSComp软件、检查仪器状况1.制备三⾊标准微球样本。
⼀般情况向1ml鞘液（或过滤PBS）中加⼊1滴质控⼩微球，也可以根据实际情况调节浓度。
2.机器预热5 min，打开FACSComp软件，选择保持路径。
选择所需校正内容，如果使⽤的微球是新⼀批产品要输⼊微球的批号。
3.在软件界⾯左侧Assay Selection选项中选择质控类型，即实验过程中是否需要清洗样品。
4.上样品，微球溶液上样之前要充分混匀。
功能键设置在“RUN”。
5.仪器⾃动检查，并做电压、补偿等设置。
6.FACSComp软件运⾏完毕，显⽰结果通过测试。
7.做Set up。
8.打印校正结果，退出FACSComp程序。
备注：在质控过程中，如果提⽰收集细胞速度慢可以提⾼细胞收集速度，但是在调节灵敏度（Sens）时，⼀定要⽤“Low”的状态上样，保证仪器灵敏度的准确。
在使⽤仪器过程中要养成好的习惯，在上样品过程中，仪器保持在“Low”“Standby”状态。
三、样品分析软件：CellQuest Pro软件，选择“联机”。
1.（2）对实验样本进⾏命名；（3）对实验通道进⾏预设（FSC,SSC,FL1-FL4）。
备注：如果界⾯被关闭，重新调出步骤：2.调出质控模板。
3.画图选择画图⼯具（⼀般选择散点图），Inspect界⾯会⾃动弹出，对⼏个常⽤选项进⾏设定：将散点图选中（⽤⿏标点击散点图边框才能够选中图形），将更改横纵坐备注：第⼀个散点图横坐标为FSC，纵坐标为SSC。
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流式检测细胞凋亡Annexin V 检测细胞凋亡 (2)实验原理 (2)实验用品 (2)操作步骤 (3)Annexin V Blocking (5)凋亡细胞的DNA 断裂片段分析 (7)实验原理 (7)实验用品 (8)操作步骤 (9)BrdU Flow Kits 检测细胞增殖 (12)实验原理 (12)BrdU Flow Kits 试剂盒 (12)结果分析 (17)流式仪器设置指南 (18)线粒体膜电位变化检测细胞凋亡 (22)实验原理 (22)实验用品 (22)样本制备 (23)结果分析 (24)注意事项 (24)Active Caspase-3 检测细胞凋亡 (26)实验原理 (26)实验步骤 (27)结果分析 (28)Annexin V 检测细胞凋亡实验原理Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。
它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。
在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS) 由质膜内侧翻向外侧。
Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。
由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA 碎片检测比较，使用Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。
因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI 或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-)与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。
实验用品1. 一次性12×75mm Falcon试管。
2. PBS缓冲液：含0.1%NaN ，过滤后2-8°C保存。
33. 微量加样器和加样头。
4. Annexin V Binding Buffer缓冲液（Cat. No. 66121E）：浓度为10×，使用时，用稀释为1×浓度的应用液。
5. Annexin V试剂与核酸染料：Annexin V 核酸染料Annexin V-Biotin（Cat. No. 65872X）Streptavidin-FITC（Cat. No. 13024D）Annexin V-FITC（Cat. No. 65874X）Annexin V-PE（Cat. No. 65875X）PI（Cat. No. 66211E）或7-AAD（Cat. No. 34321X）PI（Cat. No. 66211E）7-AAD（Cat. No. 34321X）6. FACS流式细胞仪：上样检测。
7. CELLQuest软件：获取和分析试验数据。
8. Annexin V检测对照管：Annexin V Biotin A-阴性对照SAv-FITCB-补偿 1 C-补偿2PI 和Annexin V-Biotin和SAv-FITC SAv-FITC7-AADPE Annexin V-PE未染色细胞未染色细胞FITC Annexin V-FITC PI 操作步骤1. 取Falcon 试管，按标本顺序编好阴性对照管和标本管号。
2. 使用冷的PBS缓冲液洗细胞两次，再用1×Binding Buffer缓冲液制成1×106细胞/ml的悬液。
3. Falcon试管中加入100 µl细胞悬液。
4. 按以下体积加入Annexin V与核酸染料：管号名称阴性对照单阳1单阳2样本荧光标记Annexin V 核酸染料：1 2 3 4- - AV-FITC--PIPI AV-FITC5. 轻轻混匀，室温（20°C ~25°C）避光处放置15分钟。
6. *使用Annexin V-Biotin试剂进行检测时：1×Binding Buffer缓冲液洗细胞一次，去上清。
1×Binding Buffer缓冲液100µl溶解SAv-FITC试剂0.5µg，加入到细胞管中。
轻轻混匀。
加入5µl PI，室温（20-25°C）避光处放置15分钟。
7. 各试验管中分别加入1×Binding Buffer缓冲液400µl。
8. 1小时内上流式细胞仪测定结果。
结果分析：以下4 个样本分别是阴性对照、Annexin V 单阳管、PI 单阳管和试验管。
1.001 1.002100101102Annexin 103104100101102FL1-Height1031041.003 1.004100101102Annexin 103104100101102FL1-Height103104Annexin V Blocking待测细胞与未标记的重组 Annexin V 预孵育，然后进行实验，是 Annexin V 细胞凋亡检测的质量控制。
原理是预先阻断 Annexin V-FITC 的结合位点，这样 可以证明 Annexin V-FITC 凋亡分析的特异性。
1. 使用冷的PBS 缓冲液洗细胞两次，再用1×Binding Buffer 缓冲液制成1×106细胞/ml 的悬液。
2. 在5ml 的培养管中加入100µl 细胞悬液（约1×10 个细胞）。
3. 加入5-15µg 纯化的重组Annexin V 。
注意，不同的细胞系，以及凋亡的不同阶段，其Annexin V 位点饱和所需要的纯化的重组Annexin V 含量不同。
某些情况下，为达到最好效果，可以减少细胞数量，0.5×10 个细胞加5-15µg 纯化的重组Annexin V 。
5 54. 轻轻混匀，室温反应15分钟。
5. 加入5µl 的Annexin V-FITC 或/和PI ，轻轻混匀，室温避光处放置15分钟。
6. 各试验管中分别加入1×Binding Buffer 缓冲液400µl 。
7. 1小时内上流式细胞仪测定结果。
8. 结果分析：下图 A 、B 为 Anti-Fas 抗体诱导 3 小时后的 Jurkat T 细胞, 图 C 、D 为 未处理的细胞；图 A 、C 为 Annexin V-FITC 染色的凋亡检测结果，图 B 、D 为 Annexin V Blocking 后的检测结果。
PharMingen 推荐Annexin V 细胞凋亡检测试剂盒规格货号100tests 6693KK Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I:Part A：Annexin V-FITC(100 tests)PI (2ml)1×Binding Buffer 缓冲液(50ml)100tests 6710KK Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit II (Annexin VBlocking):Part A：Annexin V-FITC(100 tests)PI (2ml)1×Binding Buffer 缓冲液(50ml)Part B：Purified Recombinant Annexin V(100µg)凋亡细胞的DNA 断裂片段分析实验原理在细胞发生凋亡后，最早出现胞膜外翻等现象，之后发生的程序性改变之一，就是细胞核酸内切酶激活，出现DNA 断裂片段。
核酸酶将染色质的高级结构断裂为50-300kb 的片段，最终断裂为200bp 大小的DNA 碎片。
DNA 碎片检测的方法是外源性TdT 酶催化反应，常指“end-labeling”或“TUNEL” (terminal deoxynucleotidyltransferase dUTP nick end labeling)。
现在可以使用APO-DIRECTKit，用流式细胞术来检测凋亡细胞由于DNA 断裂，造成DNA 链3’-OH 增多的情况。
在APO- DIRECT 分析中，TdT 酶催化DNA 单链和双链3’-OH 末端非模板依赖性的dUTP FITC 掺入反应。
由于采用了直接荧光标记的FITC-dUTP，所以一步反应后，就可以在流式细胞仪上检测DNA 碎片。
APO-DIRECT Kit（Cat. No. 6536KK）试剂盒：Part A（4°C 保存）PI/RNase A SolutionReaction BufferRinsing BufferWash BufferPart B（-20°C 保存）FITC-dUTPTdT EnzymeNegative Control Cells：已固定细胞Positive Control Cells：已固定细胞实验用品1. 一次性12×75mm Falcon 试管2. 蒸馏水3. PBS 缓冲液：含0.1%NaN ，过滤后2-8°C 保存34. 固定液：含1%多聚甲醛的PBS 缓冲液5. 70%乙醇6. 冰浴箱7. 微量加样器和加样头8. APO-DIRECT Kit 试剂盒9. 流式上机检测操作步骤1. 细胞固定：6 （1）用PBS 洗细胞后，将细胞重悬于1%多聚甲醛中，浓度为1-2×10 /ml，冰浴30-60 分钟。
（2）300×g 离心5 分钟，弃上清。
6 （3）用5ml PBS 洗细胞两次，重悬于70%乙醇中，浓度为1-2×10 /ml，冰浴30-60分钟。
（70%乙醇细胞悬液在-20°C 放置12-18 小时后进行细胞凋亡检测，得到的效果最好。
细胞可以在-20°C 保存几个月。
）2. 配制染色液，现用现配。
DNA 标记液Reaction Buffer TdT Enzyme FITC-dUTP蒸馏水1 个测试10.00μl0.75μl6 个测试60.00μl4.50μl12 个测试120.00μl9.00μl 8.00μl 48.00μl192.00μl305.50μl96.00μl 32.00μl50.75μl384.00μl609.00μl总体积3．细胞染色：（1）取离心管和Falcon 试管，按标本顺序编号。
（2）取1×106 细胞悬液加入离心管中，300×g 离心5 分钟，弃去乙醇，留下沉积细胞。
质控细胞（Negative Control Cells、Positive Control Cells）：混匀后取1ml6 /ml 300×g 离心5 分钟，弃去乙醇，留下（细胞数约1×10 ）加入离心管中，沉积细胞。
（3）每管各加入1.0ml Wash Buffer，洗细胞两遍，弃上清。