流式细胞仪操作步骤(FACSCalibur)
BDFACSCalibur流式细胞仪简明操作规程
BD FACSCalibur流式细胞仪简明操作规程一．开机程序1.把稳压器电源开关设到ON。
2.打开储液箱，把黑色开关开到TANK CHANGE位置，鞘液桶加满鞘液，倒空废液桶，把黑色开关开到Pressurize位置。
3.将FACSCalibur右侧下面的绿色按钮按开。
4.打开电脑。
二．仪器条件设定1.点击“苹果”菜单项下的CELLQuest，建立一个新视窗。
2.点击“Acquire”菜单下的“Parameter description”建立自己的文件夹，保留在屏幕上。
3.点击“Acquire”菜单下的“Connect to Cytometer”联机，这时出现“Acquisiton Control”对话框，保留在屏幕上。
4.点击“Cytometer”菜单下的“Detectors/Amps”、“Threshold”、“Compensation”三个对话框，保留在屏幕上。
5.点击“Cytometer”菜单下的“Instrument settings”，出现对话框，点击对话框中“open”，选择自己的实验条件后，点击“set”，然后点击“Done”6.加上对照样本，样品支撑架置于中位，用LO 流速RUN，点击AcqusiotionControl 对话框的Acquire，观察样品的散射光和荧光参数是否合适，调节“Detectors/Amps”对话框的相关参数，直到各个参数都合适为止。
7.点击”Acqusiotion Control”对话框的“Setup”，开始测试样品。
当所有样品分析完毕，即换上双蒸水，并将流式细胞仪置于“STANDBY”状态，以保护激光管。
三．关机程序1.测试完毕样品后，从File中选择Quit, 退出软件，点击“Special”菜单项下的“Shutdown”关机。
2.试管中加入3 ml Clean液，将样品支撑架置于旁位清洗外管，以外管吸入1ml Clean液，将样品支撑架置于中位，用HI流速RUN5分钟清洗内管，。
BD-FACSCalibur流式细胞仪操作手册
BD FACSCalibur流式细胞仪FACS101 Handbook本课程介绍「表面抗原流式分析」有关之基础工作原理。
如希望进一步了解流式细胞技术应用，请至本公司网站订阅FACSinformation电子报www.bdtwn。
com.tw/bdb/index.html。
如需要本课程手册，欢迎至本公司网站下载。
tw/bdb/10-5—3-1。
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一、BD FACSCalibur基本结构1.1仪器本体：1. 电源开关:在BD FACSCalibur仪器右侧下方，先启动仪器本体,再打开计算机。
2。
光学系统:BD FACSCalibur 基本配有一支波长488 nm 的氩离子雷射以BD FACSCalibur 基本型为例➢FSC Diode 只收488 nm波长散射光➢SSC PMT 只收488 nm波长散射光➢FL1 PMT 荧光光谱峰值落在绿色范围（波长515-545 nm）➢FL2 PMT 荧光光谱峰值落在橙红色范围（波长564—606 nm）➢FL3 PMT 荧光光谱峰值落在深红色范围（波长 >650 nm)3。
仪器面板：仪器前方面板的右下方有三个流速控制键、及三个功能控制键。
流速控制：LO：样品流速：12 μl /minMED：样品流速：35 μl /minHI: 样品流速：60 μl /min功能控制：•RUN：此时上样管加压,使细胞悬液从进样针进入流动室.（正常显示绿色;黄色时表示仪器不正常，请检查是否失压。
）•STANDBY：无样品或暖机时之正常位置,此时鞘液停止流动，雷射功率自动降低。
•PRIME：去除流动室中的气泡,流动室施以反向压力，将液流从流动室冲入样品管，持续一定时间后,以鞘液回注满流动室。
PRIME 结束，仪器恢复STANDBY状态.4. 储液箱抽屉：在主机左下方之储液箱抽屉。
BD-FACSCalibur 流式细胞仪-细胞周期-操作步骤
BD/FACSCalibur流式细胞仪检测细胞周期操作步骤1、先给鞘液桶接超纯水。
2、把鞘液桶装上，拧紧。
3、开左边开关，从右向左依次打开，即总电源插头-交流稳定电压-插板-稳定输出电源。
（关机时从左向右关）。
4、按流式细胞仪开关。
换上新的已装超纯水的流式管。
5、将减压阀调至“run”（水缸旁边的黑色按钮）。
6、排气：将白色的手动排气阀从小头向大头移动，排气，2-3次，至无气泡。
最后停至小头。
自动排气：开始时是“低速”“standby”，调至“低速”“prime”，待排气完成会自动跳到“standby”，如此循环，到流式管内无气泡为止。
7、插电脑白色插头，打开电脑。
8、到无气泡时候调到“hign”“run”。
9、输入开机密码，打开电脑桌面上的“CELLQuest”（第四个图标）启动软件。
File→open Document→date→先找到打开自己之前的文件（cell dw 2018LSD）→Acquire→Connect to Cytometer→Acquisition面板中点击“change”修改文件名和日期，count改成1，即从第一个开始。
10、Acquire→counters→点击下面Acquisition control面板中的Acquire，看是否正常。
11、上样。
使仪器处于low run状态，样品管支架左移，上样品管后支架回位。
确认Acquisition control 窗口中Setup前需打勾（即不收集数据，用于仪器设置），点击Acquire。
仪器设置完成后，取消Setup前的“√”，点击Acquire 正式开始收集数据。
调界面操作：Cytometer → Detectors/Amps出现 Detectors/Amps 界面后，调FSC和SSC和FL2和FL2-W。
FSC调节的是门内(R1)细胞位置的左右，FSC的“Voltage”调到“E-1”，“E-1”是指个体很大细胞；“Amo Gain”的值调节门内(R1)细胞位置的宽度。
流式细胞仪操作方法facs
流式细胞仪操作方法facs设备名称：流式细胞仪型号：FACSCalibur国别厂家：美国Becton Dicknson公司主要指标1、激发激光波长488 nm;2、三个荧光检测器FL1(535nm)、FL2(585nm)和FL3(630 nm)。
3、FL CV<2%4、分选：P>97%功能及应用范围1．可对有机微颗粒(细胞)和有机微颗粒内(细胞内)的物质、结构的物理和生物特性进行定量和定性分析。
2．本技术广泛应用于基础和临床医学研究。
流式细胞仪使用流程一、开机程序1.检查稳压器电源，打开电源，稳定5分钟。
2.打开储液箱，倒掉废液，并在废液桶中加入400ml漂白水原液。
打开压力阀，取出鞘液桶，将鞘液桶加至4/5满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSF Low），合上压力阀。
确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。
3.将FACSCalibur 开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY，预热5—10分钟。
排除过滤器内的气泡。
4.如果需要打印，打开打印机电源。
5.打开电脑，等待屏幕显示出标准的苹果标志。
6.执行仪器PRIME功能一次，以排除Flow cell 中的气泡。
7.分析样品时，先用FACSF Low或PBS进行HIGH RUN 约2分钟。
做过分选后，每次开机后需冲洗管道：向分选装置上装上两个50ml 离心管，不接通浓缩系统，摁下右下角白色按钮开始冲洗。
待自动停止后接通浓缩装置，同上法冲洗一次。
二、预设获取模式文件（Acquisition Template Files）从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗，可利用此视窗编辑一个获取模式文件。
选取屏幕左列绘图工具中的Dot plot，绘出一个或多个Dot plots （点图）。
从Dot Plot对话框中选取Acquisition作为图形资料来源，并确定适当的x轴和y轴参数。
选取屏幕左列绘图工具中的Histogram，同上法绘出一个Histogram（直方图）。
BDFACSCalibur流式细胞仪操作手册
BDFACSCalibur流式细胞仪操作⼿册B D F AC S C a l i b u r流式细胞仪FACS101Handbook本课程介绍「表⾯抗原流式分析」有关之基础⼯作原理。
如希望进⼀步了解流式细胞技术应⽤，请⾄本公司⽹站订阅FACSinformation电⼦报。
如需要本课程⼿册，欢迎⾄本公司⽹站下载。
如需要免疫荧光染⾊⽅法，请⾄本公司⽹站下载。
⼀、BDFACSCalibur基本结构1.1仪器本体：1.电源开关：在BDFACSCalibur仪器右侧下⽅，先启动仪器本体，再打开计算机。
2.光学系统：BDFACSCalibur基本配有⼀⽀波长488nm的氩离⼦雷射以BDFACSCalibur基本型为例FSCDiode只收488nm波长散射光SSCPMT只收488nm波长散射光FL1PMT荧光光谱峰值落在绿⾊范围（波长515-545nm）FL2PMT荧光光谱峰值落在橙红⾊范围（波长564-606nm）FL3PMT荧光光谱峰值落在深红⾊范围（波长>650nm）3.仪器⾯板：仪器前⽅⾯板的右下⽅有三个流速控制键、及三个功能控制键。
流速控制：LO：样品流速：12?l/minMED：样品流速：35?l/minHI:样品流速：60?l/min功能控制：RUN：此时上样管加压，使细胞悬液从进样针进⼊流动室。
（正常显⽰绿⾊；黄⾊时表⽰仪器不正常，请检查是否失压。
）STANDBY：⽆样品或暖机时之正常位置，此时鞘液停⽌流动，雷射功率⾃动降低。
PRIME：去除流动室中的⽓泡，流动室施以反向压⼒，将液流从流动室冲⼊样品管，持续⼀定时间后，以鞘液回注满流动室。
PRIME结束，仪器恢复STANDBY状态。
4.储液箱抽屉：在主机左下⽅之储液箱抽屉。
可向前拉开，内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤器SheathFilter，及空⽓滤⽹Airfilter。
请注意⽓路减压阀VENTTOGGLE之位置。
鞘液筒：位于抽屉左侧，容积4升。
BD-FACSCalibur流式细胞仪-细胞凋亡-操作步骤
BD-FACSCalibur流式细胞仪-细胞凋亡-操作步骤BD/FACSCalibur流式细胞仪检测细胞凋亡操作步骤1、先给鞘液桶接超纯水。
2、把鞘液桶装上，拧紧。
3、开左边开关，从右向左依次打开，即总电源插头-交流稳定电压-插板-稳定输出电源。
（关机时从左向右关）。
4、按流式细胞仪开关。
换上新的已装超纯水的流式管。
5、将减压阀调至“run”（水缸旁边的黑色按钮）。
6、排气：将白色的手动排气阀从小头向大头移动，排气，2-3次，至无气泡。
最后停至小头。
自动排气：开始时是“低速”“standby”，调至“低速”“prime”，待排气完成会自动跳到“standby”，如此循环，到流式管内无气泡为止。
7、插电脑白色插头，打开电脑。
8、到无气泡时候调到“hign”“run”。
9、输入开机密码，打开电脑桌面上的“CELLQuest”（第四个图标）启动软件。
File→open Document→date→先找到打开自己之前的文件（cell dw 2018LSD）→Acquire→Connect to Cytometer→Acquisition面板中点击“change”修改文件名和日期，count改成1，即从第一个开始。
10、Acquire→counters→点击下面Acquisition control面板中的Acquire，看是否正常。
11、上样。
使仪器处于low run状态，样品管支架左移，上样品管后支架回位。
确认Acquisition control 窗口中Setup前需打勾（即不收集数据，用于仪器设置），点击Acquire。
仪器设置完成后，取消Setup前的“√”，点击Acquire 正式开始收集数据。
调界面操作：Cytometer →Detectors/Amps出现Detectors/Amps界面后，调FSC和SSC和FL1和FL3。
FSC调节的是门内细胞位置的左右，FSC调到E-1；SSC 调节的是门内细胞位置的上下，SSC调Voltage 值，Amp Gain不动。
流式细胞仪操作步骤(FACSCalibur)
一、开机程序：1.检查鞘液桶和废液桶。
确认鞘液充满状态（鞘液为鞘液桶体积的3/4位置，可以连续工作3个小时左右）、盖紧黑盖、管道畅通、废液桶有足够空间容纳本批标本排弃的废液。
如果要添加鞘液，要先释放鞘液桶中气压。
2.依次打开流式细胞仪FACSCalibur稳压器、主机开关、电脑开关，打印机。
3.气压阀置于加压位置，待流式细胞仪处于STANDBY状态，做Prime，以排除管路中气泡。
二、运行FACSComp软件、检查仪器状况1.制备三色标准微球样本。
一般情况向1ml鞘液（或过滤PBS）中加入1滴质控小微球，也可以根据实际情况调节浓度。
2.机器预热5 min，打开FACSComp软件，选择保持路径。
选择所需校正内容，如果使用的微球是新一批产品要输入微球的批号。
3.在软件界面左侧Assay Selection选项中选择质控类型，即实验过程中是否需要清洗样品。
4.上样品，微球溶液上样之前要充分混匀。
功能键设置在“RUN”。
5.仪器自动检查，并做电压、补偿等设置。
6.FACSComp软件运行完毕，显示结果通过测试。
7.做Set up。
8.打印校正结果，退出FACSComp程序。
备注：在质控过程中，如果提示收集细胞速度慢可以提高细胞收集速度，但是在调节灵敏度（Sens）时，一定要用“Low”的状态上样，保证仪器灵敏度的准确。
在使用仪器过程中要养成好的习惯，在上样品过程中，仪器保持在“Low”“Standby”状态。
三、样品分析软件：CellQuest Pro软件，选择“联机”。
1.（2）对实验样本进行命名；（3）对实验通道进行预设（FSC,SSC,FL1-FL4）。
备注：如果界面被关闭，重新调出步骤：2.调出质控模板。
3.画图选择画图工具（一般选择散点图），Inspect界面会自动弹出，对几选中图形），将更改横纵坐备注：第一个散点图横坐标为FSC，纵坐标为SSC。
（1一般获取10000个细胞。
（2（3）将所有补偿调为0（4）将非52（5）FSC和SSC（64.上阴性对照将阴性对照管混匀，上机，功能键设置在“RUN”,散点图出现细胞信号，第一个图：让细胞信号出现在自己看上去舒服的区域；其他三个散点图，要将细胞信号调整到阴性区域，即左下角区域。
流式细胞仪操作步骤(FACSCalibur)
流式细胞仪操作步骤(FACSCalibur)一、开机程序：1.检查鞘液桶和废液桶。
确认鞘液充满状态（鞘液为鞘液桶体积的3/4位置，可以连续工作3个小时左右）、盖紧黑盖、管道畅通、废液桶有足够空间容纳本批标本排弃的废液。
如果要添加鞘液，要先释放鞘液桶中气压。
2.依次打开流式细胞仪FACSCalibur稳压器、主机开关、电脑开关，打印机。
3.气压阀置于加压位置，待流式细胞仪处于STANDBY状态，做Prime，以排除管路中气泡。
二、运行FACSComp软件、检查仪器状况1.制备三色标准微球样本。
一般情况向1ml鞘液（或过滤PBS）中加入1滴质控小微球，也可以根据实际情况调节浓度。
2.机器预热5 min，打开FACSComp软件，选择保持路径。
选择所需校正内容，如果使用的微球是新一批产品要输入微球的批号。
3.在软件界面左侧Assay Selection选项中选择质控类型，即实验过程中是否需要清洗样品。
4.上样品，微球溶液上样之前要充分混匀。
功能键设置在“RUN”。
5.仪器自动检查，并做电压、补偿等设置。
6.FACSComp软件运行完毕，显示结果通过测试。
7.做Set up。
8.打印校正结果，退出FACSComp程序。
备注：在质控过程中，如果提示收集细胞速度慢可以提高细胞收集速度，但是在调节灵敏度（Sens）时，一定要用“Low”的状态上样，保证仪器灵敏度的准确。
在使用仪器过程中要养成好的习惯，在上样品过程中，仪器保持在“Low”“Standby”状态。
三、样品分析软件：CellQuest Pro1.软件，选择“联机”。
Acq Connect（1）在弹出的界面中的选择数据存储路径（Directory 菜单）；（2） 对实验样本进行命名；（3） 对实验通道进行预设（FSC,SSC,FL1-FL4）。
备注：如果界面被关闭，重新调出步骤：2.调出质控模板。
3. 画图 选择画图工具（一般选择散点图），Inspect 界面会自动弹出，对几够选中图形），将 改为 ,更改横纵备注：第一个散点图横坐标为FSC ，纵坐标为SSC 。
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一、开机程序：
1.检查鞘液桶和废液桶。
确认鞘液充满状态（鞘液为鞘液桶体积的3/4位
置，可以连续工作3个小时左右）、盖紧黑盖、管道畅通、废液桶有足
够空间容纳本批标本排弃的废液。
如果要添加鞘液，要先释放鞘液桶中
气压。
2.依次打开流式细胞仪FACSCalibur稳压器、主机开关、电脑开关，打印
机。
3.气压阀置于加压位置，待流式细胞仪处于STANDBY状态，做Prime，以
排除管路中气泡。
二、运行FACSComp软件、检查仪器状况
1.制备三色标准微球样本。
一般情况向1ml鞘液（或过滤PBS）中加入
1滴质控小微球，也可以根据实际情况调节浓度。
2.机器预热5 min，打开FACSComp软件，选择保持路径。
选择所需校
正内容，如果使用的微球是新一批产品要输入微球的批号。
3.在软件界面左侧Assay Selection选项中选择质控类型，即实验过
程中是否需要清洗样品。
4.上样品，微球溶液上样之前要充分混匀。
功能键设置在“RUN”。
5.仪器自动检查，并做电压、补偿等设置。
6.FACSComp软件运行完毕，显示结果通过测试。
7.做Set up。
8.打印校正结果，退出FACSComp程序。
备注：在质控过程中，如果提示收集细胞速度慢可以提高细胞收集速度，但是在调节灵敏度（Sens）时，一定要用“Low”的状态上样，保证仪器灵敏度的准确。
在使用仪器过程中要养成好的习惯，在上样品过程中，仪器保持在“Low”“Standby”状态。
三、样品分析软件：CellQuest Pro
软件，选择“联机”。
1.
（2）对实验样本进行命名；
（3）对实验通道进行预设（FSC,SSC,FL1-FL4）。
备注：如果界面被关闭，重新调出步骤：
2.调出质控模板。
3.画图
选择画图工具（一般选择散点图），Inspect
界面会自动弹出，对几
选中图形）
，将更改横纵坐
备注：第一个散点图横坐标为FSC，纵坐标为SSC。
（1一般获取10000个细胞。
（2
（
3）将所有补偿调为0
（4）将非
52
（5）FSC和SSC
（6
4.上阴性对照
将阴性对照管混匀，上机，功能键设置在“RUN”,散点图出现细胞信
号，第一个图：让细胞信号出现在自己看上去舒服的区域；其他三个
散点图，要将细胞信号调整到阴性区域，即左下角区域。
通过移动通
道电压来实现。
获取实验数据：暂停刚才实验
注意：
5. RUN
”,如果细胞信号出现在双阳区域，说明
有细胞信号露到相邻通道中，要将细胞信号调节到单一通道中。
通过
移动通道补偿来实现，想要细胞信号向哪个通道移动，就用散点图中
的另一个通道去减，即想要移动的那个通道作为减数。
如在FL1和
FL2两个通道组成的散点图中，细胞信号出现在双阳区域，要将细胞
信号移动到FL1通道，就要调节FL2-FL1对应的补偿，直到细胞信号
只出现在FL1通道中，这样可以消除漏到FL2通道中的信号。
备注：FL1-FITC ，FL2-PE ，FL3-PerCP ，FL4-APC 。
根据实验要求选择流速，按设置顺序上样。
6. 点击“Acquire ”命令，仪器开始获取数据，并自动将数据文件保存
到规定的目录下。
7.
样本获取完毕，功能键设置在“STANDBY ”，并选择“脱机”命令。
8.
点击“Quit ”命令，退出CellQuest 软件。
9. 关机：（1）1% 次氯酸，高速（Hi ）“RUN ” 5-10 min ，Acquire 如果
细胞计算器中不显示有细胞则表示管道已经干净。
（2）用双蒸水高速（Hi ）“RUN ” 5-10 min ，Standby 5 min ，关
机。
四、DNA 倍性分析实验：
一、仪器情况检测，DNA 倍性分析的质控用CellQuest Pro 软件进行。
1.
（1）保证机器预热5 min ，打开CellQuest Pro 软件，选择“联机”。
做质控时，需要画三个图，第一个是散点图，横坐标是FSC ，纵坐标是SSC ；第二个是散点图，横坐标是FL2-Width ，纵坐标是FL2-Area ；第三个是直方图，横坐标是FL2-Area ，纵坐标是Counter 。
做DNA 倍性实验时一般使用PI 染色，）。
DNA 倍性分析不需要调节补偿。
因为属于单色实验，所以把电压界面 前的勾去掉。
将信号接收方式“Log ”改为“Lin ”，DDM Pram 改为“FL2阈值使用FL2，而不是FSC 。
去掉细胞群中粘连体，上样本，利用第二个图，调节FL2-A 和FL2-W 电压，使细
胞群信号显示在横纵坐标200位置，通常血细胞中单细胞成45℃，粘连体体积会比单细胞大，大概在横坐标400位置。
保存质控。
二、DNA倍性分析用ModFit LT软件进行。
（1）打开ModFit LT软件，调出样品检测结果，
（2）选择面积（FL2-A），选定X轴：FL2-W，Y轴：FL2-A。
（3）可以点击Auto选项，进行结果自动分析，也可以选择Manuale，人工分析。
FACSCalibur
每日开机程序
1.检查鞘液桶，确认：
❖鞘液充满状态(~3升)
❖盖紧黑盖
❖管路畅通，无扭曲
2.检查废液桶，确认：
❖废液桶充满100ml漂白剂
❖管路畅通，无扭曲
3.打开流式细胞仪。
4.打开电脑。
5.气压阀置于加压位置，并排除管路中气泡。
6.做Prime。
7.等待机器预热5---10分钟后可开始实验。
FACSCalibur
每日关机程序
1.用2ml10%稀释漂白剂(有效氯0.5-1%)作样品，将样品支撑架置于旁位，以外管吸入1ml。
2.将样品支撑架置于中位，以HI RUN 5分钟。
3.将样品换成蒸馏水重复1-2步,时间加倍。
4.放置盛有1ml蒸馏水的试管于样品支撑架上。
5.选择Standby模式5分钟后可关掉主机。
6.退出所有应用软件，在关掉主机之前关闭电脑。