《医学微生物学》动物接种实验与病毒培养技术实验
病毒的鸡胚培养法接种途径
新乡医学院微生物学教研室 监督电话:3029945 Email:jcbwsw@
内容提要
一 抗酸染色 二 病毒的接种技术 三 真菌菌落的观察 （小白鼠和鸡胚共用注射器16支，病毒悬液用 锥蓝染液代替，小白鼠8只，鸡胚15只，微 量移液器4支，真菌示教培养管4支）
缺陷：带毒，缺敏感动物。
常用动物：鼠、家兔、猴和羊等。
接种的途径：脑内、鼻内、皮内、腹腔内和静
脉注射等。
1 病毒的动物接种
目的 了解病毒的动物接种法 材料 小白鼠（1~3天或3周龄）， 乙型脑炎 病毒悬液， 1ml注射器（8支），碘酒 ， 棉签，眼科剪等
小白鼠的脑内接种（共8只小白鼠）
病毒的培养
病毒的概念：形态最小，结构最简 单的微生物。缺乏完整的酶系统， 无完整的细胞结构，必须在活的组 织细胞中才能增殖。
常用的分离、 培养、鉴定 病毒的分离培养 病毒的方法
动物接种法
鸡胚培养法
组织细胞培养法
动物接种（Animal inoculation）
最早应用的病毒培养法。 用途：分离鉴定、传代、制备免疫血清。
本次实验不做培养，接种完病毒，可将 鸡胚去除部分卵壳后，小心将卵壳内组 织倒入平皿中，观察接种的病毒替代液 （锥蓝染液）是否接种部位正确及各膜 囊等的组织结构。
注意事项
消毒小白鼠时不要碰到眼睛
注射时不要扎的太深以免扎到手
磨卵壳及钻孔时力量要适中
看过的鸡胚不要倒入水池，倒入指定的 大烧杯中
菌落光滑、湿润；无菌丝 隐球菌菌落 外观和酵母型菌落相似，显微镜下可看到假菌丝 白色念株菌菌落 菌落系由多细胞菌丝体所组成 大多数丝状真菌或霉菌的菌落
医学微生物学课程实习实验报告
医学微生物学课程实习实验报告一、实验目的通过本次实验，掌握医学微生物学的基本实验技能，了解细菌、病毒的形态结构及其生理特性，提高观察、分析问题和解决问题的能力。
二、实验原理医学微生物学是研究微生物在医学领域中的分布、分类、形态、生理、致病和免疫等方面的科学。
实验中，通过观察细菌、病毒的形态结构，研究其生理特性，从而为临床诊断和治疗提供理论依据。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：细菌、病毒样本，染色剂，培养基等。
2. 实验仪器：显微镜，培养箱，接种环，镊子，无菌棉拭子等。
四、实验步骤1. 细菌观察：（1）制备细菌涂片；（2）革兰染色；（3）显微镜观察，记录细菌形态、大小、排列等特征。
2. 病毒观察：（1）制备病毒样本涂片；（2）荧光染色；（3）显微镜观察，记录病毒形态、大小等特征。
3. 细菌生理特性研究：（1）接种细菌于不同培养基；（2）置于培养箱中培养；（3）观察细菌生长情况，记录菌落大小、形状、颜色等特征。
4. 病毒复制与感染实验：（1）接种病毒于细胞培养液；（2）观察细胞病变情况；（3）记录病毒复制、感染过程。
五、实验结果与分析1. 细菌观察结果：通过显微镜观察，发现细菌分为革兰阳性菌和革兰阴性菌。
革兰阳性菌呈紫色，菌体较大，排列紧密；革兰阴性菌呈红色，菌体较小，排列疏松。
2. 病毒观察结果：通过荧光染色，发现病毒呈圆形或椭圆形，大小约为100-300纳米。
病毒粒子结构清晰，荧光染色剂使其发出绿色荧光。
3. 细菌生理特性研究结果：细菌在不同培养基上的生长情况各异。
例如，大肠杆菌在牛肉膏蛋白胨培养基上生长良好，形成较大菌落，颜色为红色；金黄色葡萄球菌在血平板上生长良好，形成较小菌落，颜色为金黄色。
4. 病毒复制与感染实验结果：病毒接种于细胞培养液后，细胞出现病变现象，如细胞体积增大、细胞膜破裂等。
通过观察病毒复制、感染过程，可以了解病毒的生物学特性。
六、实验结论通过本次实验，掌握了医学微生物学的基本实验技能，对细菌、病毒的形态结构及其生理特性有了更深入的了解。
实验八 病毒鸡胚接种与细培养
兽医微生物实验教学课件
（动物医学本科专业）
动物医学系
实验八 病毒鸡胚接种与培养
目的要求：
1、了解不同日龄鸡胚接种的途径和应用。 2、掌握鸡新城疫病毒鸡胚尿囊腔接毒、收毒方法。 3、掌握鸡胚成纤维细胞培养和新城疫病毒接种、病变观察及收毒。
病毒分离培养
分离培养：动物接种——原动物/实验动物 鸡胚接种——尿囊腔、卵黄囊、尿囊膜、羊膜腔等
细胞培养——原代细胞
二倍体细胞 传代细胞
cpe观察空斑ຫໍສະໝຸດ 基因克隆/扩增组织块培养——肠管、气管环等
鸡 胚 成 纤 维 细 胞 培 养 程 序 ：
在无菌条件下采取9－10日龄鸡胚 ↓ 除去头(或仅除去喙和眼)、爪和内脏，并剪成块 ↓ 用Hanks液等充分冲洗 ↓ 剪将其剪成lmm大小的碎块 ↓ 加入Hanks液或其他洗液，充分冲洗 ↓ 约4倍量的0.25％胰酶，并调整pH至7.6－7.8 ↓ 37℃水浴中感作30分钟，每10分钟轻轻摇动一次 ↓ 吸弃上层胰酶溶液 ↓ 用洗液轻洗2次后 ↓ 吸管充分吹打，直至形成均匀的细胞悬液 ↓ 准备细胞计数 ↓ 单层细胞培养
实验内容：
1、鸡胚的选择和接种途径：鸡胚发育正常时，可见清晰的血管和活 的鸡胚，血管及其主要分支均明显，呈鲜红色，鸡胚可以活动。 卵黄囊接种：6-8日龄的鸡胚； 绒毛尿囊腔接种：9-13日龄的鸡胚； 鸡胚血管注射：12-13日龄鸡胚； 羊膜腔和脑内注射：10日龄鸡胚。 2、鸡新城疫病毒接种液或接种病料的处理；照蛋、打孔；接种。接 种后的检查和收毒。 3、鸡胚成纤维细胞培养和新城疫病毒接种、病变观察及收毒。
医学微生物学实验技术
咽拭子、粪便、血液等。
样品保存与运输
03
采集后尽快送检，如需暂存，应选择合适的保存条件和运输方
式，避免样品变质或污染。
分离与纯化方法选择依据
微生物种类与特性
不同微生物具有不同的生长特性和营养需求，需选择适合的分离 与纯化方法。
样品来源与污染程度
样品来源和污染程度不同，需采用不同的分离与纯化策略。
实验目的灭菌
对实验器材、培养基等进行严 格消毒或灭菌处理，防止微生 物污染。
废弃物处理
对实验废弃物进行分类、收集 和处理，避免对环境和人员造
成危害。
03
微生物分离与纯化技 术
微生物样品采集与处理方法
采集工具与容器选择
01
无菌棉签、无菌吸管、无菌容器等，确保采集过程中不污染样
品。
采集部位与方法
02
根据微生物种类和感染类型，选择合适的采集部位和方法，如
利用PCR技术可以特异性地扩 增微生物的某个或某些基因片 段，实现快速、灵敏的微生物 检测和鉴定。
将大量的微生物基因探针固定 在芯片上，通过与待测微生物 样品的杂交反应，可以一次性 检测多种微生物的存在和种类 。
通过直接提取环境样品中的全 部微生物DNA进行测序和分析 ，可以研究微生物群落的组成 、结构和功能，为微生物生态 和进化研究提供新视角。
的利用能力和酶活性。
应用领域
生理生化鉴定技术广泛应用于临 床微生物学、食品微生物学、环 境微生物学等领域，用于检测和 鉴定病原微生物、食品污染菌等
。
分子生物学鉴定技术进展
基因测序技术
聚合酶链式反应（PCR）
生物芯片技术
宏基因组学技术
通过测定微生物的基因组序列 ，可以准确鉴定微生物的种类 和遗传特征，为微生物分类和 进化研究提供有力手段。
兽医生物制品基本生产技术—病毒培养技术
细胞的制备
2.单层细胞的传代 多采用EDTA(乙二胺四乙酸)-胰酶消化法，胰酶浓度为
0.025％，EDTA浓度为0.01％。 具体方法：单层细胞弃去营养液，加37℃预热的EDTA-胰
酶消化液（覆盖细胞表面），待细胞开始脱落时，弃去消 化液，加入少量生长液轻轻吹打使细胞分散，再用生长液 稀释，分装成2～3瓶培养。 某些半悬浮培养或悬浮培养的细胞如SP2/O瘤细胞，不需 消化液消化，采用机械吹打即可形成单细胞。
病毒的细胞接种增殖技术
3.病毒增殖的判断指标 • 细胞病变效应（CPE ）
细胞圆缩 细胞聚集 形成合胞体 轻微病变
倒置显微镜
病毒的细胞接种增殖技术
接种单纯疱疹病毒1型的人角膜上皮细胞（CPE） （A-正常细胞，B-感染后8h，C-感染后12h， D-感染24h ）
病毒的细胞接种增殖技术
4.病毒的收获 一般在CPE达80%左右时收获。 通过冻融、超声波等方式破碎细胞，使病毒充分释放，
病毒的增殖过程
4.生物合成
• 病毒利用宿主细胞作为生物合成机构，使病毒核酸表达和 复制,产生大量的病毒蛋白质和核酸。
mRNA的合 成
早期：特异性酶的合成 核酸复制 结构蛋白质合成
病毒的增殖过程
5.装配与释放 • 新合成的毒粒结构组分组装成完整的病毒颗粒，称做病毒
的装配,亦称成熟。
• 成熟的子代病毒颗粒以一定的途径释放到细胞外。
如，猪甲状腺细胞培养猪传染性胃肠炎病毒 ·非宿主动物细胞
如，鸭胚成纤维细胞培养马立克氏病病毒。
病毒的细胞接种增殖技术
2.影响病毒在细胞中增殖的因素 （1）血清
• 维持液中血清含量：一般不超过2% （2）温度
• 最适温度多为37℃。 • 有些病毒生长的最适温度高于或低于37℃。 如，狂犬病
《医学微生物学》实验目的和要求及实验室规则及注意事项
《医学微生物学》实验目的和要求及实验室规则及注意事项医学微生物学是医学专业的基础课程之一，主要研究微生物在人体中的生理和病理过程。
实验是医学微生物学学习的重要环节，通过实验可以加深对理论知识的理解和应用，提高学生的实际操作能力。
本文将详细介绍医学微生物学实验的目的和要求，以及实验室规则和注意事项。
一、实验目的和要求1.实验目的(1)了解微生物的基本概念和分类特征，掌握基本的病原微生物检测技术；(2)学习常见病原微生物的培养和鉴定方法，掌握微生物的培养技术和实验操作；(3)培养学生的实际动手能力、数据分析能力和科学研究思维。
2.实验要求(2)精确记录实验数据，准确并规范地填写实验报告；(3)遵守实验室规则，严格遵循实验安全操作规程。
二、实验室规则1.实验室开放时间实验室开放时间为每周一至周五的08:30-17:30，周六至周日不开放。
2.实验室装备使用(1)学生在使用实验室设备前，必须接受相关培训并取得资质证书；(2)使用实验室设备时要注意操作规程，禁止随意调试和拆卸实验室设备；(3)实验后要及时清洗和归位实验器材，保持实验室的整洁和环境卫生。
3.实验室安全(1)实验室进入前必须穿戴实验斗篷、手套、口罩等个人防护用品；(2)实验结束后必须洗手，并做好实验台面和器材的清洁工作；(3)对于具有较高危险性的实验，需要两人互相检查和确认实验装置和操作步骤。
三、注意事项1.实验前的准备工作(1)查看实验指南，了解实验目的和要求，熟悉实验步骤；(2)检查实验器材和试剂的完整性和可用性；(3)清洁实验台面，并准备所需的清洁消毒用品；(4)穿戴合适的实验服装和个人防护用品。
2.实验中的注意事项(1)操作时要细心、耐心，并注意实验安全；(2)严禁饮食、吸烟或涂抹口红等行为；(3)注意实验器材和实验台面的清洁和整理；(4)在实验中遵循实验步骤，严禁修改或省略步骤。
3.实验后的工作(1)清洗和归位实验器材，保持实验室整洁；(2)保存和整理好实验数据，并根据要求填写实验报告；(3)关闭实验设备和实验室电源，确保实验室安全。
病毒的动物接种实验报告
病毒的动物接种实验报告一、实验目的本次实验的主要目的是研究某种特定病毒在不同动物体内的感染情况和致病性，以便更深入地了解该病毒的特性和传播机制，为后续的病毒防控和治疗研究提供基础数据和理论支持。
二、实验材料1、病毒株：经过严格筛选和鉴定的目标病毒株。
2、实验动物：选取了小鼠、大鼠、豚鼠、兔子等常见的实验动物，每种动物根据实验需求分为不同的实验组和对照组，每组动物数量充足以保证实验结果的可靠性。
3、实验器材：包括无菌注射器、移液器、培养皿、离心机、显微镜等。
4、防护设备：实验人员配备了全套的防护服装、手套、口罩等，以确保实验过程中的生物安全。
三、实验方法1、病毒培养与制备在无菌条件下，将病毒株接种到合适的细胞培养体系中，进行病毒的增殖和培养。
经过一定的培养时间后，收集含有病毒的培养液，通过离心、过滤等方法进行纯化和浓缩，制备出用于动物接种的病毒液。
2、动物接种对于小鼠和大鼠，采用腹腔注射的方式接种病毒液，剂量根据动物体重和实验设计进行精确计算。
豚鼠和兔子则通过皮下注射或肌肉注射的途径接种病毒，同样控制好接种的剂量。
3、观察指标与检测方法每天定时观察动物的临床症状，包括精神状态、饮食情况、活动能力、体温变化等。
定期采集动物的血液、组织样本等，进行病毒载量的检测、病理切片分析等。
四、实验结果1、小鼠实验组在接种病毒后的第 2 天，部分小鼠开始出现精神萎靡、食欲不振的症状。
随着时间的推移，症状逐渐加重，出现体温升高、毛发凌乱、呼吸急促等表现。
至第 5 天，部分小鼠死亡，对死亡小鼠进行解剖发现，其内脏器官有明显的病理变化，如肝脏肿大、脾脏淤血等。
存活的小鼠在接种后的第 7 天开始逐渐恢复，但仍有部分小鼠表现出一定程度的虚弱和生长迟缓。
2、大鼠实验组大鼠的症状出现相对较晚，在接种后的第 3 天开始有部分大鼠出现精神不振的情况。
第 4 天起，陆续出现体温升高、活动减少等症状。
至第 7 天，有少量大鼠死亡，解剖结果显示其病理变化与小鼠类似，但程度相对较轻。
医学微生物学实验大纲
《医学微生物学》课程实验教学大纲课程名称(中文)医学微生物学实验课程名称(英文) Experiments of Medical Microbiology课程编号50101164课程性质非独立设课课程属性基础课教材及实验指导书名称《医学微生物学实验指导》学时学分:总学时72总学分4实验学时 30实验学分开出时间：二年级四学期适用专业5年制临床、视光、麻醉、影像、法医、口腔、预防本科先修课程细胞生物学、组织胚胎学、生理学、生物化学、免疫学一、课程简介及基本要求医学微生物学是研究病原微生物的形态、结构、生命活动规律以及与机体相互关系的一门学科，是基础医学中的一门重要学科。
为学习临床各科的感染性疾病、传染病、超敏反应性疾病和肿瘤等奠定重要的理论基础；同时，也可运用所学的知识直接为控制和消灭感染性疾病、保障人民健康服务。
课程学习要求掌握各种重要致病微生物的生物学特性，致病性和免疫性，微生物学检查方法和防治原则等内容，课程包括医学微生物学理论和实验两部分内容。
二、课程实验目的要求医学微生物学实验是医学微生物学课程的重要组成部分，是医学各专业学生的必修基础课程。
医学微生物学实验的形式可分为教师示教（包括多媒体、电视教学录像）和学生操作两种。
《医学微生物学实验》开设实验项目41个，其中基础实验（含基本操作）32个，技能训练实验6个，综合性实验3个。
实验总学时30学时。
其目的在于通过实验，使学生巩固和加深所学的理论知识，掌握必要的微生物学基本技术，培养独立观察、思考和分析、解决问题的能力，为今后的医学实践打下一定的基础。
三、适用专业5年制临床、视光、麻醉、影像、法医、口腔、检验、预防本科四、主要仪器设备普通显微镜，倒置光学显微镜，暗视野显微镜，荧光显微镜，恒温温箱，恒温水浴箱，普通冰箱，生物安全柜或超净台，高压蒸汽灭菌器，过滤器。
五、实验方式和要求1．预习学生在课前应按照实验课程进度表的安排预习实验指导以及教材有关章节，对该次实验的目的要求、实验内容、基本原理和操作方法有一定的了解。
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《医学微生物学》动物接种实验与病毒培养技术实验实验动物在病原微生物中的研究上占有重要地位。
利用实验动物可以进行病原菌的分离鉴定、毒力的检测、制备免疫血清等生物制品；进行各种皮肤试验；建立人工感染的动物模型；进行发病机制、疾病防治以及免疫机制的研究等。
一、实验动物的管理1．实验室常用的动物：家兔、豚鼠、小白鼠、大白鼠、地鼠、绵羊、鸡等，根据实验的目的选择最适宜的动物。
2．实验动物必须与正常动物分开饲养，动物室内要经常保持清洁和空气畅通，并应有防蚊、防蝇、防逃跑及保暖设备。
3．实验动物要精心饲养，喂以适当的饲料并给以充足的水，任何动物也不要断水。
4．实验动物要有详细的记录，包括性别、体重、体表特征(如毛色等)、接种材料、接种日期、接种途径、剂量、次数以及接种变化等。
5．实验动物应做好标记，对较大动物如家兔、豚鼠等可用金属号码牌固定于耳朵上，对较小动物如大白鼠、小白鼠等可用复红(或苦味酸等染料)涂于身体的不同部位，以资识别。
盛装动物的笼具等，也应付以标签。
6．接种后的动物应每天观察1～2次，注意动物的精神状态，活动能力、饮食和大小便情况，体温、注射部位的反应以及全身反应，如不安、耸毛、震颤、弓背、麻痹及死亡等，并应详细记录之。
7．感染动物死亡后，应立即剖检或暂时冻存。
动物的排泄物及使用的笼具等必须严格消毒。
任何用过的动物，不宜再做其他试验。
二、实验动物的选择选择实验动物应注意以下几点：1．易感性：是选择实验动物的首要条件。
2．动物健康：体质健康、发育正常、体重适宜；最好使用自己繁殖的动物，由市场购买的动物至少经过一周的隔离观察，证明无隐性感染方可使用；某些特殊实验应需选用专门喂养繁殖的无菌动物；实验动物应容易获得，便于喂养和管理。
3．动物大小：同一实验应选用大小一致的动物，通常以年龄或体重为标准。
4．性别：某些实验最好选用同一性别，特别是免疫的动物和需要观察较长时间的实验动物。
5．动物品系：某些实验要求使用纯系动物，纯系小鼠用于免疫学、杂交瘤及病毒感染等研究。
三、小白鼠腹腔接种[目的要求]l．掌握小白鼠腹腔接种的实验方法。
2．了解动物接种在微生物分离和鉴定中的作用。
3．了解其他的动物接种方法，如动物皮下、皮内、肌肉、家兔耳静脉注射等接种方法。
4．了解实验动物的处死和尸检的方法。
[原理]在临床微生物实验室中，动物接种主要用于分离和鉴定病原微生物。
通过在易感和不易感动物体内传代，微生物的各种性质都可能发生变化。
常用的实验动物包括大鼠、小鼠、豚鼠、家兔及绵羊等。
常见的接种部位包括皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔及脑内等部位。
本实验主要进行小鼠的腹腔内接种。
[器材和动物]1．菌液肺炎链球菌培养液。
2．器具鼠笼、无菌注射器、棉球煮针锅、剪刀、解剖台、大头针、纸张。
3．试剂碘酒、酒精、3％来苏儿、凡士林。
4．动物小白鼠。
[步骤和方法]１.接种方法：（１）用无菌注射器以无菌操作方式吸取肺炎链球菌培养液，吸取量稍多于使用量，排除气泡(将注射器针头朝上，使气泡上升，在针头上裹以消毒棉球，然后轻轻推出，须避免菌液四溅，特别注意防止眼结膜感染)。
（２）用右手轻拖小白鼠尾，使其爬行于粗糙物面上，再用左手拇指和示指抓紧小白鼠两耳及颈项皮肤，鼠体被固定在左手手指与掌间，用左手无名指和小指夹住鼠尾，用碘酒消毒腹壁皮肤。
（３）左手倾斜，使小鼠头部稍向下，将预先准备好的菌液注入腹腔内，注射时右手持已吸有菌液的注射器，针尖自小白鼠左侧腹股沟处刺穿皮肤，使针尖(针头宜小，常用5号针头)在皮下组织内向前移动1cm左右，然后再轻轻向下刺进腹腔。
抽吸注射器，如无回血或尿液，表示针头未刺人肝、膀胱等脏器，即可进行注射，注入菌液0.2ml后将针头退出，用酒精棉球轻擦针刺处消毒。
（４）将接种小鼠用的肺炎链球菌菌液作一张细菌涂片，以备与以后的实验结果比较。
（５）将注射后的小白鼠做好标记(以染液涂于鼠的头部或背部)，置于鼠笼中，填写实验动物记录卡或标签，包括实验动物的名称、编号、注射材料及部位、剂量和注射日期等，然后将卡片挂在动物容器上。
２.结果观察方法：（１）感染动物须隔离喂养，并逐日观察，注意有无发病症状，如食欲不振、竖毛、不活泼等现象，加以记录，必要时定期测量体重及体温。
若有致死可能，务必在动物濒死前及时杀死并作解剖，进行病原学和病理学检查。
（２）小白鼠在濒死前或死亡后立即进行解剖，若尚未死亡可用人工处死，如拉其头及尾部，使其颈椎脱臼，即刻死亡。
（３）将小白鼠胸腹部朝上，四肢用大头针固定于铺有纸张的解剖板上，用碘酒消毒整个胸腹部及四肢，左手用镊子提起耻骨部皮肤，右手持剪刀在其上剪开，然后由小口中将剪刀头部伸入，将皮肤分离，并沿正中线自耻骨到下腭处将皮肤剪开，四肢处皮肤亦用剪刀分离后剪开(注意不能将肌肉层剪破)，将皮肤向两侧剥离，露出整个胸腹部，观察皮下组织及淋巴结有无水肿、出血和肿大等病变。
(4)另换无菌镊剪，左手持镊子先将腹壁提起，依照剪开皮肤的方法，右手持剪将腹壁自耻骨到横膈，横膈向两侧，耻骨至两腿处剪开(注意勿剪破肠)。
然后将腹壁翻向两侧观察腹腔。
如有渗出液则用接种环取渗出液接种于适当的培养基，并作涂片和染色镜检。
同时亦可剪取脾或肝脏，取切面作压迹涂片，如欲做组织切片检查时，可将脏器剪下浸入10％甲醛液内固定。
(5)再换一套无菌镊剪，将两侧肋骨沿锁骨中线切开，用镊子夹住胸骨下缘，将横膈肋骨缘剪断，将剪断的胸骨向上翻起暴露出胸腔，观察心肺有无病变及胸腔有无渗出液。
用无菌镊子将心脏固定，剪开心包膜，烧灼心室表面，以无菌注射器插入心脏内取心血数滴，置血平板上进行划线分离培养(或把心脏剪成两半，将切面在平板面压印后，再行划线分离)。
将血平板放入37 ℃培养箱培养24h，亦可将心脏剪开做压迹涂片。
(6)将腹腔渗出液或脏器压迹涂片用革兰染色和荚膜染色法染色镜检。
(7)7)动物尸体解剖完毕后，用垫在尸体下面的纸张将尸体包裹，集中后放焚烧炉中焚化。
所用的剪刀、镊子、注射器等均应煮沸消毒，实验台用3％来苏儿消毒擦洗干净。
[结果]１．腹腔渗出液或脏器压迹涂片经革兰染色镜检，可见有荚膜的革兰阳性双球菌，形态和染色特征符合肺炎链球菌。
２．血平板分离培养的结果，在划线区出现细小、灰白色、α-溶血的纯菌落，经鉴定符合肺炎链球菌。
四、鸡胚接种[目的要求]掌握能用鸡胚分离培养的病毒种类及四种常用的鸡胚接种途径。
[器材和试剂] ．1．毒种流行性感冒病毒悬液、乙型脑炎病毒悬液及2型单纯疱疹病毒悬液。
2．来享鸡受精卵。
3．1ml注射器及6号、12号针头，无菌生理盐水。
4．其他卵架、检卵灯、碘酒、酒精棉球，无菌手术刀、镊子、剪刀，平皿、砂轮、透明胶带等。
[步骤和方法]1．鸡胚的准备：选择表面光泽干净，最好是白色蛋皮的受精卵，放入38～39℃孵卵器内孵育，相对湿度40％～70％。
孵育3天后，需每日翻动鸡胚1次。
第4天起，用检卵灯观察鸡胚发育情况，未受精卵只见模糊的卵黄黑影，应予淘汰；受精卵可看到清晰的血管和鸡胚的暗影，随着转动鸡胚可见胚影活动。
随后每天观察一次，若出现胚动吊滞或胚影固定于卵壳，或血管昏暗模糊者，说明鸡胚将要死亡或已死亡，需随时淘汰。
生长良好的鸡胚一直孵育到适当的胚龄。
2．接种方法：（1）尿囊腔接种法：1)取9～11日龄鸡胚，在检卵灯下画出气室界限，于胚胎面与气室交界的边缘上约1mm处或在胚胎的对侧处，避开血管作一标记，作为注射点。
2)用碘酒、酒精消毒后，用无菌刀尖在记号处打一小孔。
3)用无菌注射器吸取流行性感冒病毒悬液，从小孔处刺入5mm，注入病毒液0.1-0.2ml(图4-1)图4-1 尿囊腔接种法4)用透明胶带封闭注射孔，蜡笔标记号码及日期等，放卵架上置33～35℃孵箱孵育，每日检视鸡胚的死活，如果鸡胚在接种后24h内死亡者为非特异性死亡，弃之。
5)孵育48～72h取出，放4℃冰箱过夜。
6)次日取出鸡胚，消毒气室部位卵壳，用无菌剪刀沿气室线上缘剪去卵壳，用无菌镊子撕去卵膜。
7)用无菌毛细吸管吸取尿囊液，收集于无菌试管内。
用血凝试验检测有无病毒。
（2）卵黄囊接种法：1)取6～8日龄鸡胚，于检卵灯下画出气室及胚胎位置，垂直放于蛋架上，气室端向上。
2)碘酒、酒精消毒卵顶部气室中央，用无菌刀尖锥一小孔。
3)用装有12号长针头的lml注射器吸取乙型脑炎病毒液，自小孔刺入，对准胚胎对侧，垂直接种于卵黄囊内，深度为35mm左右，注入病毒液0.2～0.5ml退出注射器(图4-2)。
4)透明胶带封口，置37℃孵育，每天检卵羊膜并翻动2次。
5)取孵育24h以上濒死的鸡胚，无菌技术于气室端开窗，用镊子提起卵黄囊蒂，挤出卵黄囊液，用无菌生理盐水洗去卵黄囊上的卵黄囊液后，将囊置于无菌平皿内，低温保存、备用。
（3）绒毛尿囊膜接种法：1）取12日龄鸡胚，于检卵灯下标记胚胎位置及大血管处。
2）碘酒，酒精消毒附近无大血管走行的卵壳处，用小锯片在其上锯一三角形窗，同时用无菌刀尖在气室顶部锥一小孔。
3）用针头挑去三角形窗之卵壳，勿伤及卵壳膜，滴加灭菌生理盐税1滴于壳膜上。
4）用橡皮吸帽从气室小孔吸气，可见盐水被吸下，绒毛尿囊膜下沉，去壳膜后可见壳膜与尿囊膜之间形成人工气室。
5）用注射器吸取0.2～0.5ml 2型单纯疱疹病毒液滴于绒毛尿囊膜上，用透明胶带口(图4-3)。
置孵箱37℃孵育4～5天后收获。
6) 剪开气室,若接种效果成功，可在绒毛尿囊膜上见到明显疹斑，用无菌剪刀剪下膜，置于无菌平皿内，低温保存、备用。
图4-2 卵黄囊接种法图4-3 绒毛尿囊膜接种法（4）羊水囊接种法：1) 取12日龄鸡胚，在检卵灯下画出气室及胚胎位置。
2）碘酒、酒精消毒气室部卵壳，在气室顶开方形窗，选择无大血管处，用无菌镊子快速刺破绒毛尿囊膜进入尿囊后，再夹起羊膜，轻轻将其从绒毛尿囊膜破裂处拉出，以lml射器刺破羊膜，注入病毒液0.1～0.2ml（图4-4）。
3) 用镊子将羊膜轻轻送回原位，用透明胶带封闭气室端开窗，置孵箱37℃孵育3～5天。
4) 收获时，先消毒气室部，剪去壳膜及绒毛尿囊膜，吸弃尿囊液，夹起羊膜，用细头毛细吸管刺入羊膜腔内吸取羊水，收集于无菌小瓶内冷藏、备用。
图4-4 羊水囊接种法五、病毒细胞培养法（录像）细胞培养是目前最常用的病毒培养方法。
选择适当的原代培养细胞及传代细胞系作病毒分离培养。
细胞培养接种病毒的方法及病变观察（示教）：[材料]单层细胞培养瓶、营养液、Hanks液、无菌毛细滴管、病毒稀释液。
[方法]1．取已长成单层细胞的培养瓶二只，用无菌毛细滴管吸去管中液体，用Hanks溶液洗三次。
2．用无菌1ml吸管吸取稀释病毒液0.1ml加入一只单层细胞培养瓶中，另一只单层细胞培养瓶加0.1ml营养液作为对照，细胞瓶平放，使其接触整个细胞层，置37℃作用1小时，使病毒吸附到细胞上。