流式细胞仪分析技术
流式细胞技术原理及方法
流式细胞技术原理及方法
流式细胞技术（Flow cytometry）是一种用于检测和分析细胞的高通
量技术，能够同时分析多种细胞参数。
其原理是通过将单个细胞悬浮液通
过一个细长管道，然后通过激光束照射细胞并记录细胞与激光的相互作用，最后用多个光学信号检测器来收集和分析这些信息。
细胞排序是流式细胞技术的第二步。
流式细胞仪可以根据不同的细胞
参数，如大小、形状和荧光强度等对细胞进行排序。
这种方法可以根据用
户的需求，选择性地分离和收集一些细胞亚群，进一步进行下一步的实验
分析。
数据分析是流式细胞技术的最后一步。
流式细胞仪会收集大量的数据，包括荧光信号的亮度和位置等信息。
这些数据通常以直方图的形式呈现，
可以通过专业的分析软件进行解析和统计分析。
数据分析可以帮助研究人
员确定细胞亚群的比例、亚群之间的差异和相似性等信息。
流式细胞技术在许多领域中被广泛应用。
在免疫学研究中，流式细胞
技术可以用来分析和鉴定免疫细胞亚群，如T细胞、B细胞和巨噬细胞等，以及它们的功能状态和表达的分子。
在癌症研究中，流式细胞技术可以用
来检测肿瘤细胞和癌症干细胞，以便进行诊断和预后评估。
在生物医药研
究中，流式细胞技术可以用来评估各种药物对细胞表型、凋亡和增殖等影
响的研究。
综上所述，流式细胞技术是一种强大的细胞分析方法，能够同时检测
和分析多种细胞参数。
这种技术的原理和方法相对复杂，但其在生物医学
研究和应用中具有广泛的应用前景。
流式细胞术名词解释
流式细胞术名词解释
流式细胞术（flow cytometry）是一种高速、高效的单细胞分析
技术，广泛应用于生命科学中。
该技术利用激光束和多重探针对单个
细胞进行多参数分析，可以快速获取细胞表面、内部分子以及细胞特
性的详细信息。
在流式细胞术中，细胞被分散在流动液体中，通过细胞分流器进
入流式细胞仪的测量单元。
激光器对细胞进行激发，然后由散射仪和
荧光仪收集并分析激发光信号。
散射光可以提供关于细胞大小和形状
的信息，而荧光探针可以用于检测细胞表面抗原、内部蛋白、DNA含量、RNA含量等多种细胞特征。
流式细胞术的优势在于可以快速高效地处理大量的样本，适用于
单细胞和多种细胞的分析。
同时，该技术还可以对细胞进行有效的分
选和分离，具有极高的精确性和灵敏度。
因此，流式细胞术在生物学、医学、生物工程等领域中得到了广泛的应用。
例如，在癌症诊断中，
通过流式细胞术可以区分不同类型的癌细胞，进一步指导治疗方案的
设计和实施。
总之，流式细胞术已经成为现代生命科学中不可或缺的工具之一。
其在高通量、高精度分析和细胞分选中的优势，可以为研究细胞和疾
病提供重要的科学基础。
实验七-流式细胞仪检测技术
实验七-流式细胞仪检测技术实验七流式细胞仪检测技术免疫细胞是一组不均一的细胞群体。
各种特定的细胞群其细胞表面表达有各自特异的表面标志分子，利用这些特异的表面标志，可以鉴定、分离和纯化相应的细胞群。
随着单克隆抗体技术的诞生和免疫标记技术（特别是荧光标记技术）的发展，以及计算机科学的应用，使利用仪器的方法检测特异的细胞膜表面分子成为可能。
本章介绍的荧光激活细胞分类技术就是采用单克隆抗体技术和免疫荧光标记技术，并结合光学检测和计算机分析技术而产生的鉴定和分离特定细胞亚群的技术。
实验原理流式细胞仪（flow cytometer）是一种能够探测和计数以单细胞液体流形式穿过激光束的细胞检测装置，由于在检测中使用的细胞标志示踪物质为荧光标记物，因此，用来分离、鉴定细胞的流式细胞仪有被称为荧光激活细胞分类仪（fluorescence activated cell sorter,FACS）,是分离和鉴定细胞群及亚群的一种强而有力的应用工具。
其原理是在一组混合的细胞群中，加入特异的针对特定靶细胞表面分子的荧光标记单克隆抗体，这种特异单克隆抗体与其对应的抗原靶分子结合，结合后的荧光标记抗体停留在特定细胞的表面，称为荧光抗体标记的靶细胞；将含有被标记细胞的混合细胞群混悬在一定容积的上样缓冲液中，再通过FACS的进样吸管孔，仪器就会将细胞悬液制成以单细胞排列的微细流束。
当每一个细胞通过仪器的激光束照射时，带在细胞上的荧光就会被相应的激光束激活并发出对应的荧光，通过敏感的光电倍增管即可检测到从细胞表面发出的荧光。
根据测得的散射光（scattered light ）可得到细胞大小及颗粒状态的信息；而从荧光的发射强度(fluorescence emissions)则提供了结合在细胞上的抗体信息，进而也被反映了该细胞表面相应分子的表达情况。
在流式细胞仪分离装置中，返回到计算机的信号，可用来产生一种电荷，这种电荷以特定准确的时间通过FACS的吸管孔，在与吸管孔的液体流相相遇时，可将液体流打碎成只含一个细胞的微滴。
流式细胞仪
流式细胞仪的机型
1. 台式机 检测和分析 B.D. : FACSCalibur; LSRII; LSRI
2. 大型机 分选细胞 B.D. : FACSVantage ；FACSAria Beckman Coulter: MoFlo （DAKO）
荧光抗体的搭配
理论上，不同通道检测的参数可以同时进 行检测。但是如果进行3个荧光参数的检测， 尽可能的选择只需要调节一对参数之间的 补偿的荧光。 如，FL1+FL2+FL4; FL1+FL3+FL4; 注意：PE-Cy5和APC不能同时检测。
流式细胞仪的数据显示和分析
一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图。 1．单参数数据显示和分析— 一维直方图
90 Degree Light Scatter
Laser
FALS Sensor
SSC 与入射光成 90 ° 的光，与 细胞内部复杂度 相关，颗粒密度
90LS Sensor
根据FSC/SSC可以将全血中的淋巴细胞，单核 细胞和粒细胞分开
荧光参数 自发荧光：未经荧光染色，细胞内部的荧
光分子经激光照射后发出的荧光信号。 自发荧光的细胞成分： 核黄素，细胞色素等。 死亡细胞的自发荧光较高 需要设置阴性对照。
F/P FITC, PerCP: 2-9; APC, PE: 1; PE-Cy7, APC-Cy7: 1, N;
抗原密度 高丰度抗原：任何荧光素；低丰度抗原：PE，APC
染色指数 自发荧光
高：APC； 低：FITC 非特异形结合
FcR; 荧光自身
直接标记
流式细胞术基本原理与实用技术
流式细胞术基本原理与实用技术流式细胞术（Flow Cytometry）是一种常用的细胞分析技术，它基于光学、电子和计算机技术，能够对单个细胞进行快速、准确的多参数分析。
本文将介绍流式细胞术的基本原理和实用技术。
一、基本原理流式细胞术的基本原理是利用细胞在液体中悬浮的特性，在流动状态下通过一个细胞计数器，同时对细胞进行多参数的检测和分析。
其主要包括以下几个步骤：1. 细胞样品的制备：将待检测的细胞样品进行预处理，如离心、洗涤等，以获得单细胞悬浮液。
2. 细胞的进样：将细胞悬浮液通过微细管道进入流式细胞仪的流动系统中，形成单细胞的液体流。
3. 细胞的定位和聚焦：利用激光束对细胞进行定位和聚焦，使其逐个通过探测区域。
4. 细胞的激发和发射：通过激光束的照射，激发细胞中的荧光染料或标记物，使其发射特定波长的荧光信号。
5. 光信号的收集和处理：收集细胞发射的荧光信号，并经过光学系统进行分光、分束、分光和聚焦，最后通过光电倍增管或光电二极管转换为电信号。
6. 数据的获取和分析：将电信号转化为数字信号，并通过计算机系统进行数据采集、存储和分析，得到细胞的各项参数及相关统计学分析。
二、实用技术1. 细胞标记技术：为了能够准确地检测和分析细胞的特定性质，常常需要对细胞进行特异性的染色或标记。
常用的标记方法包括荧光染料、抗体标记和基因表达标记等。
2. 多参数分析技术：流式细胞术可以同时检测多个参数，如细胞大小、形态、表面标记物的表达、细胞周期等。
通过合理选择和配置荧光染料和滤光片组合，可以实现多重标记和多参数分析。
3. 数据分析软件：流式细胞术产生的数据量庞大，需要借助计算机软件进行数据的分析和解读。
常用的数据分析软件有FlowJo、CellQuest、ModFit等，它们可以对细胞的分布、比例、相关性等进行统计学分析和图形展示。
4. 高通量流式技术：随着科学研究的深入和技术的发展，高通量流式技术逐渐兴起。
它通过提高仪器的样品处理速度和自动化程度，实现对大量样品的快速检测和分析，广泛应用于生物医学研究和临床诊断。
流式细胞仪分析技术应用
绿色荧光强度
2. 二维等高图
• 由类似地图上的等高线组成，其本质也是 双参数直方图。
• 等高图上每一条连续曲线上具有相同的细 胞相对或绝对数，即“等高”。
• 曲线层次越高(越里面的线) 所代表的细胞 数愈多。
• 等高线越密集则表示细胞数变化率越大。
二维等高图
3. 假三维等高图
根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆 形门、多边形门、任意形状门和十字门。
A 淋巴细胞 B 单核细胞 C 中性粒细胞
A、B、C均 为任意门
线性门
第四节 流式细胞仪免疫分析的技术要求
• 样本制备 • 标记染色 • 液相芯片技术 • 质量控制
一、免疫检测样品制备
单细胞悬液 ➢外周血淋巴细胞样品的制备
液流断裂成液滴
空白液滴 不充电
弃去
含细胞的液滴 充电
偏转落入收集器
（二）分选的技术要求
• 分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬
液中细胞的含量成正比。
• 分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞
的百分率。
• 分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过
测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。
• 分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细
二、数据显示方式
直分析方图 • 单参数直方图 • 双参数直方图:点图 二维等高图 假三维等高图 • 三参数直方图 • 多参数分析
设门分析:REGION和GATE设置
（一）单参数直方图
由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数 (COUNT)构成，反映同样散射光或荧光 强度的颗粒数量的多少。
细 胞 相 对 数 量
• 1 × Phosphate Buffer Saline or HBSS (Ca/Mg++ free)
流式细胞分析技术讲解
流式细胞分析技术讲解流式细胞仪分析技术及应⽤第⼀节概述⼀、⼯作原理⼆、散射光的测定三、荧光测量四、细胞分选原理第⼆节数据的显⽰与分析⼀、参数⼆、数据显⽰⽅式三、设门分析技术第三节流式细胞仪技术要求⼀、检测样品制备⼆、常⽤的荧光染料与标记染⾊三、胶乳颗粒的应⽤四、流式细胞技术的质量控制第四节流式细胞仪技术的要求第五节、流式细胞仪的科研应⽤第六节流式细胞术在临床检测中的主要应⽤⼀、细胞周期和DNA倍体分析⼆、染⾊体分析三、细胞表⾯标志的检测1、淋巴细胞及其亚群的分析2、淋巴细胞功能分析3、淋巴造⾎系统分化抗原及⽩⾎病免疫分型四、肿瘤耐药相关蛋⽩分析五、AIDS病检测中的应⽤六、⾃⾝免疫性疾病相关HLA抗原分析七、移植免疫中的应⽤流式细胞术(flow cytometry, FCM)亦称荧光激活细胞分选器(fluorescence-activated cell sorting, FACS):是⼀种集激光技术、电⼦物理技术、光电测量技术、电⼦计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为⼀体的新型⾼科技仪器。
是对于处在快速直线流动状态中的细胞或⽣物颗粒进⾏多参数、快速的定量分析和分选的技术。
⼴泛应⽤于基础研究和临床实践各个⽅⾯，包括细胞⽣物学、肿瘤学、⾎液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等。
流式细胞术主要包括：1、液流技术2、细胞的分选和计数技术3、数据的采集和分析技术流式细胞术发展史:1930年Caspersson和Thorell开始致⼒于细胞计数的研究1934年Moldaven最早设想细胞检测⾃动化，⽤光电仪记录流过⼀根⽑细管的细胞1940年Coons提出结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋⽩1949年Wallace Coulter申请了在悬液中计数粒⼦的⽅法的专利1950年Caspersson⽤显微UV-VIS检测细胞1953年Croslannd-Taylor应⽤分层鞘流原理，成功设计红细胞光学⾃动计数器1969年Van Dilla及其同事在Los Alamos, NM发明第⼀台荧光检测细胞计1972年Herzenberg研制出细胞分选器1975年Kohler等提出单克隆抗体技术，为细胞研究提供⼤量的特异免疫试剂⼤量⼚家不断⽣产流式细胞仪⽬前国内主要流式细胞仪⼚家：Beckton Dickinson(BD)公司、BACKMAN COULTER公司流式细胞术的特点：流式细胞术最⼤的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分⼦⽔平上获取多种信号对细胞进⾏定量分析或纯化分选细胞不被破坏，测量快速、⼤量、准确、灵敏、定量主要特点：单个细胞⽔平分析；多参数分析（同时多种荧光素标记）⽔平分析；⾼灵敏度、⾼分辨率、⾼重复性、⾼分选纯度；可分析⼤量细胞；速度快：5000-10000个细胞/秒；统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况；分选感兴趣的细胞：⾎细胞、⾻髓、组织培养细胞等。
临床免疫学检验第二十二章 流式细胞仪分析技术及应用
第二十二章流式细胞仪分析技术及应用本章要点1.流式细胞仪的分析及分选原理2.数据的显示与分析3.流式细胞仪免疫分析的技术要求4.流式细胞术在免疫学检查中的应用概述：流式细胞术（FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确地对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。
流式细胞仪的发展综合了激光技术、计算机技术、显微荧光光度测定技术、流体喷射技术、分子生物学和免疫学等多门学科的知识。
流式细胞仪：是集光电子物理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。
第一节流式细胞仪的分析及分选原理流式细胞计的基本结构流式细胞计主要由四部分组成。
它们是：流动室和液流系统；激光源和光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统。
一、工作原理（一）基本组成结构1.流动室和液流系统：流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作。
设计和制作均很精细，是液流系统的心脏。
样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射出。
为了保证液流是稳液，一般限制液流速度<10m／s。
由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴线上。
流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。
2.激光源和光学系统：经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。
常用的光源有弧光灯和激光；激光器又以氩离子激光器为普遍，也有配合氪离子激光器或染料激光器。
光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。
氩离子激光器的发射光谱中，绿光514nm和蓝光488nm的谱线最强，约占总光强的80%；氪离子激光器光谱多集中在可见光部分，以647nm较强。
免疫学上使用的一些荧光染料激发光波长在550nm以上，可使用染料激光器。
将有机染料做为激光器泵浦的一种成份，可使原激光器的光谱发生改变以适应需要即构成染料激光器。
例如用氩离子激光器的绿光泵浦含有Rhodamine 6G水溶液的染料激光器，则可得到550～650nm连续可调的激光，尤在590nm处转换效率最高，约可占到一半。
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流式细胞仪常检测的细胞特性
细胞组成
细胞功能
大小
细胞表面/胞浆/核--特异性抗原
粒度
细胞活性
DNA, RNA含量
胞内细胞因子
蛋白质含量
细胞在液柱中与激光束相交时 向周围360°立体角方向散射的光线 信号，它的强弱与细胞的大小、形 状、胞内颗粒折射等有关，主要分
为前向散射光和侧向散射光。
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前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光 以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细 胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。
测得的FS与SS信 号通过计算机处理， 可得到FS-SS图，由 此可仅用散射光信号 对未染色的活细胞进 行分析或分选。
此为血细胞分类的 基本原理，但不能分 析表面分子。
单核细胞
中性粒细胞
淋巴细胞
光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群
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三、荧光测量
• 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激 发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。
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流式细胞术（FCM）以其快速、灵活、 大量、灵敏和定量的特色，广泛应用于 基础研究和临床实践各个方面，包括细 胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、 药理学、遗传学及临床检验学等，在各 学科领域发挥着重要的作用。
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4
第一部分 流式细胞仪的分析及分选原
理
第二部分 数据的显示与分析
第三部分 流式细胞仪免疫分析的技术
• 滤片：长通、短通、带通
• 光电倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）
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光学系统示意图
Flow Tip
SS and FL Detector
FS Detector
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Laser
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（3）数据处理系统
主要由计算机及其软件组成
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二、散射光的测定
要求
第四部分 流式细胞术在免疫学检查中
的应用
第五部分 应用举例
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第一部分 流式细胞仪的分析 及分选原理
流式细胞仪是将流体喷射技术、激光技 术、空气技术、γ射线能谱术及电子计算机 等技术与显微荧光光度计密切结合的一种非 常先进的检测仪器。
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6
该仪器具有高度的精密性，测定的数 据准确可靠。既可分析单个细胞，也能区 分群体细胞，检测的速度可达5000个细 胞/秒，分选纯度可高达99%以上。
流式细胞仪分析技术
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1
概述
流式细胞术(flow cytometry, FCM)是20世 纪70年代发展起来的一种以流式细胞仪为工 具，能快速测量细胞的物理或化学性质，如 大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、 抗原等，并可对其分类、收集的高新技术。
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流式细胞术（FCM）借鉴了荧光显微镜 技术, 同时利用计算机技术、激光技术、电 子技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学
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基本过程
已标记的单细 硅化管 胞悬液和鞘液
流动室 形成稳态 喷嘴 水平激光与之 荧光染料被
单细胞液柱
垂直相交 激发发光
荧光检测系统和
收集光信号 光电倍增管
放大 脉冲信号
散射光感受系统
计算机系统 分析结果
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1.流式细胞仪的基本结构：
（1） 液流系统 （2） 光学系统 （3） 数据处理系统
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荧光补偿
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四、细胞分选原理
通过流式细胞仪进行细胞分选主 要是在对具有某种特征的细胞需进 一步培养和研究时进行的。
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（一）分选基本原理
细胞悬液形成液流柱 压电晶体 产生机械振动
流动室振动
液流断裂成液滴
空白液滴 不充电
弃去
含细胞的液滴 充电
偏转落入收集器
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激素结合位点
钙离子, PH值, 膜电位 酶活性
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一、工作原理
经荧光色素染色的细胞或包裹在鞘液里的其
他生物微粒，从50－100μm的喷嘴逐个高速
喷出，通过一个聚焦的光源，进而通过各种光
敏元件测量这些细胞或微粒所发射的散射光以
及荧光，经计算机分析和处理可得到多种信息
参数。
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10
结构示意图
• 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过 波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧 光信号区分开，送入不同的光电倍增管。
• 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的 多个不同特征。
• 线性放大器和光染料的特性
•激发波长(EXCITING) •发射波长(EMISSION)
等多门高新技术的发展, 将荧光显微镜的激 发光源改为激光, 使之具有更好的单色性与 激发效率, 因而大大提高了检测灵敏度, 同时 将固定的标本台改为流动的单细胞悬液, 用 计算机进行数据处理, 从而大大提高了检测 速度与统计精确性, 而且从同一个细胞中可 以同时测得多项参数, 被誉为是细胞分析领 域的“CT”。
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13
（1）液流系统
• 由样本和鞘液组成
• 待测细胞 单个细胞的悬液
荧光染料标记的单
抗对其染色 受清洁气体压力 从样品管进入流动
室形成样本流
• 鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是 包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心
位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。
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14
液流系统示意图
鞘液
喷嘴
Fluorescence signals
Focused laser beam
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FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
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16
（2）光学系统
• 激光光源：气冷式氩离子激光器
• 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长 波长
• 光束成形器：两十字交叉放置的透镜
• 透镜组：形成平行光，除去室内光
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前向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
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侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细胞 时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内部结 构属性。
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侧向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
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