流式细胞仪检测技术
流式细胞技术原理及方法
流式细胞技术原理及方法
流式细胞技术（Flow cytometry）是一种用于检测和分析细胞的高通
量技术，能够同时分析多种细胞参数。
其原理是通过将单个细胞悬浮液通
过一个细长管道，然后通过激光束照射细胞并记录细胞与激光的相互作用，最后用多个光学信号检测器来收集和分析这些信息。
细胞排序是流式细胞技术的第二步。
流式细胞仪可以根据不同的细胞
参数，如大小、形状和荧光强度等对细胞进行排序。
这种方法可以根据用
户的需求，选择性地分离和收集一些细胞亚群，进一步进行下一步的实验
分析。
数据分析是流式细胞技术的最后一步。
流式细胞仪会收集大量的数据，包括荧光信号的亮度和位置等信息。
这些数据通常以直方图的形式呈现，
可以通过专业的分析软件进行解析和统计分析。
数据分析可以帮助研究人
员确定细胞亚群的比例、亚群之间的差异和相似性等信息。
流式细胞技术在许多领域中被广泛应用。
在免疫学研究中，流式细胞
技术可以用来分析和鉴定免疫细胞亚群，如T细胞、B细胞和巨噬细胞等，以及它们的功能状态和表达的分子。
在癌症研究中，流式细胞技术可以用
来检测肿瘤细胞和癌症干细胞，以便进行诊断和预后评估。
在生物医药研
究中，流式细胞技术可以用来评估各种药物对细胞表型、凋亡和增殖等影
响的研究。
综上所述，流式细胞技术是一种强大的细胞分析方法，能够同时检测
和分析多种细胞参数。
这种技术的原理和方法相对复杂，但其在生物医学
研究和应用中具有广泛的应用前景。
流式细胞检测原理
流式细胞检测原理
流式细胞检测是一种用于分析单个细胞的技术，它可以对细胞进行快速、高通量的分析。
流式细胞检测的原理是将单个细胞通过流式细胞
仪进行分析，通过检测细胞的荧光信号、散射光信号等参数，可以对
细胞进行分类、计数、分析等操作。
流式细胞检测的原理主要包括以下几个方面：
1.细胞样品的制备：流式细胞检测需要对细胞样品进行制备，通常是通过细胞培养、组织分离等方式获得。
制备好的细胞样品需要进行染色、标记等处理，以便于在流式细胞仪中进行检测。
2.细胞的流动：制备好的细胞样品通过流式细胞仪中的流动系统进行流动，流动速度可以达到每秒数千个细胞。
流动系统中的液体可以对细
胞进行冲洗、分离等操作，以便于对细胞进行分析。
3.细胞的激发和发射：流式细胞仪通过激光器对细胞进行激发，激发后的细胞会发出荧光信号、散射光信号等。
这些信号可以被流式细胞仪
中的探测器捕捉到，并转化为电信号。
4.数据的分析：流式细胞仪通过对捕捉到的信号进行分析，可以对细胞
进行分类、计数、分析等操作。
数据分析可以通过计算机软件进行，也可以通过人工进行。
流式细胞检测的优点在于可以对单个细胞进行分析，可以得到更加准确的数据。
同时，流式细胞检测可以对大量的细胞进行快速分析，可以在短时间内得到大量的数据。
流式细胞检测在生物医学研究、临床诊断等领域有着广泛的应用。
总之，流式细胞检测是一种非常重要的细胞分析技术，它可以对单个细胞进行快速、高通量的分析，为生物医学研究、临床诊断等领域提供了有力的支持。
流式细胞术基本原理_
流式细胞术基本原理_流式细胞术（flow cytometry）是一种通过激光照射、细胞荧光标记和单个细胞分析的技术，用于研究和识别细胞的性质和功能。
它可以分析多种类型的细胞，包括细菌、酵母、植物细胞和动物细胞。
流式细胞术具有高通量、快速并且可以同时分析多个参数等优势，因此被广泛应用于生物学研究、临床诊断和治疗等领域。
1.激光照射：流式细胞仪使用一束高能激光照射通过细胞悬液。
通常使用的激光有紫外线、蓝色、绿色和红色等多种波长。
激光束通过透镜系统聚焦，使细胞悬液中的细胞逐个经过照射点。
2.细胞荧光标记：在流式细胞仪实验前，细胞需要进行荧光染色，以便能够准确地测量和分析不同细胞参数。
荧光标记通常是通过将细胞与特定的标记分子（包括化学荧光染料、抗体或融合蛋白等）结合。
这些标记物可以与细胞的特定结构（如表面抗原、内源性蛋白等）相互作用，从而使细胞在流式细胞仪中发出荧光。
3. 光散射和荧光检测：经过激光照射后，细胞会散射光线。
光散射可以分为两种类型：前向散射（forward scatter，FSC）和侧向散射（side scatter，SSC）。
FSC反映细胞的大小，而SSC反映细胞的复杂性和内部结构。
同时，通过引入适当的滤光片和光学分束器，可以同时检测细胞所发出的荧光信号。
流式细胞仪通常具有多个荧光探测器，可以同时检测多个荧光染料。
4.数据分析：通过流式细胞仪获得的数据是复杂的多维数据，需要进行后续的数据分析和解释。
常见的数据分析方法包括数据精炼、数据规范化、聚类分析、细胞子群分析等。
可以通过计算机软件对数据进行处理和可视化，以获得有关细胞种群组成和特征的更深入的理解。
流式细胞术在许多研究领域和临床应用中发挥着重要作用。
例如，通过流式细胞术可以定量检测一些细胞亚群的数量和频率，用于检测和监测疾病的发生和发展，如肿瘤、免疫性疾病等。
此外，流式细胞术还可以用于筛选新药的有效性和安全性评估，以及研究细胞信号转导、基因表达和细胞分化等生物学过程。
最详细的流式细胞仪实验方法
最详细的流式细胞仪实验方法流式细胞仪（Flow cytometry）是一种高精度的细胞分析技术，可用于快速鉴定和分离多种类型的细胞。
本文将介绍一种常用的流式细胞仪实验方法，包括样品准备、细胞染色、细胞分析和数据分析等步骤。
一、样品准备1.收集细胞：制备单细胞悬液，如细胞培养物等。
2.细胞计数：使用细胞计数器或血细胞计数板等工具，计算细胞密度。
3. 调整浓度：根据流式细胞仪系统的要求，将细胞悬液的浓度调整至适当的浓度（一般建议在1×10^5至1×10^6个细胞/ ml之间）。
二、细胞染色1.封闭非特异结合位点：为了减少非特异性结合，可使用FBS（胎牛血清）或BSA（牛血清蛋白）等以阻断非特异位点。
2.添加荧光染料：选择合适的染料，如草酰胺（CFSE）、丙酮染料(ATTO)或FITC等。
按照厂家说明书中建议的浓度将染料添加到样品中，好洗脱或者可用来鉴定细胞的抗体，如表面标记、核酸染色剂或功能性抗体。
3.染色溶液：在4°C下孵育细胞悬液至少30分钟（具体时间根据实验需要决定）。
4.洗涤：向样本管中加入足够的缓冲液，使细胞悬液稀释五倍，并离心沉积细胞。
5.弃去上清液：将上清液弃去，然后用足够的缓冲液再次洗涤沉积的细胞。
6.重悬：向样品管中加入适量的缓冲液，使细胞形成合适的细胞密度。
三、设置流式细胞仪1.打开仪器：确保仪器已开启并运行正常，各通道和检测器已连接好，并预热至适当温度。
2.校正：根据仪器的手册，对流式细胞仪进行校正和标定，以确保流式细胞仪的准确性和稳定性。
3.样品管固定：将样品管插入到流式细胞仪中相应的槽中，以确保准确读取。
4.设置参数：在计算机或流式细胞仪仪器的界面上设置所需参数，如细胞个数、细胞染色等。
四、细胞分析1.利用流式细胞仪：启动流式细胞仪软件，并确保硬件与软件连接正常。
2.定位细胞：在细胞分析开始前，调整激光位置和侦测器的灵敏度，以确保对准确获取细胞。
实验七-流式细胞仪检测技术
实验七-流式细胞仪检测技术实验七流式细胞仪检测技术免疫细胞是一组不均一的细胞群体。
各种特定的细胞群其细胞表面表达有各自特异的表面标志分子，利用这些特异的表面标志，可以鉴定、分离和纯化相应的细胞群。
随着单克隆抗体技术的诞生和免疫标记技术（特别是荧光标记技术）的发展，以及计算机科学的应用，使利用仪器的方法检测特异的细胞膜表面分子成为可能。
本章介绍的荧光激活细胞分类技术就是采用单克隆抗体技术和免疫荧光标记技术，并结合光学检测和计算机分析技术而产生的鉴定和分离特定细胞亚群的技术。
实验原理流式细胞仪（flow cytometer）是一种能够探测和计数以单细胞液体流形式穿过激光束的细胞检测装置，由于在检测中使用的细胞标志示踪物质为荧光标记物，因此，用来分离、鉴定细胞的流式细胞仪有被称为荧光激活细胞分类仪（fluorescence activated cell sorter,FACS）,是分离和鉴定细胞群及亚群的一种强而有力的应用工具。
其原理是在一组混合的细胞群中，加入特异的针对特定靶细胞表面分子的荧光标记单克隆抗体，这种特异单克隆抗体与其对应的抗原靶分子结合，结合后的荧光标记抗体停留在特定细胞的表面，称为荧光抗体标记的靶细胞；将含有被标记细胞的混合细胞群混悬在一定容积的上样缓冲液中，再通过FACS的进样吸管孔，仪器就会将细胞悬液制成以单细胞排列的微细流束。
当每一个细胞通过仪器的激光束照射时，带在细胞上的荧光就会被相应的激光束激活并发出对应的荧光，通过敏感的光电倍增管即可检测到从细胞表面发出的荧光。
根据测得的散射光（scattered light ）可得到细胞大小及颗粒状态的信息；而从荧光的发射强度(fluorescence emissions)则提供了结合在细胞上的抗体信息，进而也被反映了该细胞表面相应分子的表达情况。
在流式细胞仪分离装置中，返回到计算机的信号，可用来产生一种电荷，这种电荷以特定准确的时间通过FACS的吸管孔，在与吸管孔的液体流相相遇时，可将液体流打碎成只含一个细胞的微滴。
流式细胞检测内容
流式细胞检测内容
流式细胞检测是一种用于分析单个细胞的技术，通过流式细胞仪可以对细胞进行高通量的检测和分析。
流式细胞检测可以提供关于细胞的多个参数的信息，包括形态、大小、表面标记物的表达水平和分布、细胞周期状态等等。
流式细胞检测的内容主要包括以下几个方面：
1. 细胞计数和活力分析：通过测量细胞数量来评估样品中细胞的浓度，并通过活细胞染色来分析细胞的存活率。
2. 表面标记物分析：利用荧光标记的抗体或其他可特异性结合到细胞表面的分子来分析细胞表面标记物的表达水平和分布情况。
3. 细胞周期和DNA含量：通过核酸染色剂如荧光素染色剂或DNA特异性抗体来分析细胞的DNA含量、细胞周期和细胞增殖状态。
4. 免疫细胞功能分析：通过检测细胞的细胞因子分泌、胞外泌液和细胞内蛋白的表达来评估和分析细胞的免疫功能。
5. 细胞凋亡分析：通过核酸染色剂和特定的抗体来检测细胞凋亡的特征，如细胞核形态变化和磷酸化的蛋白质表达。
6. 细胞排序：根据细胞表面标记物的表达水平，可以使用流式细胞仪将特定类型的细胞分离、分选和收集。
通过对以上内容的分析，可以获得关于样品中细胞的多个参数和特性的信息，从而进行进一步的研究和分析。
流式细胞仪及流式细胞术
流式细胞仪及流式细胞术流式细胞仪技术流式细胞仪技术，主要是测量群体中单个细胞经适当染色后其成分所发出的散射光和荧光，经染色的细胞在悬液中以单行流过高强度光源的焦点，当每个细胞经过焦点时，发出一束散射光/或荧光。
它们经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器(光电倍增管或一个固态装置)，光检测器把散射光定量转化成电信号，经数字转换器进行数字化后而成整数，然后进行电子存储，以后数据可以调出显示和进行分析。
其优点如下：1、具有操作简便，只要将染色的单个细胞推入仪器中，就会得出数据。
2、具有较高的灵敏度及测定速度，而且每次可测出许多数据，一般情况下，每秒可测5000个细胞，能迅速分析和记数大量细胞，并能准确统计群体中荧光标记细胞的比例。
3、应用广泛，即可用于测定细胞活力、繁殖周期和细胞定型分析，也可区别死亡细胞、分裂细胞和静止细胞群，既可测定DNA和RNA、测凋亡峰，又可测蛋白含量，特别是胞浆蛋白。
基本流程原理：1、将待测细胞染色后制成单细胞悬液，用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定的角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。
2、流式细胞仪通常以激光作为发光源。
经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。
这两种信号同时被前向光电二极管和90度方向的光电倍增管接收。
散射光不依赖任何细胞样品的制备技术，被称为细胞的物理参数或固有参数，散射光有包括前向角散射和侧向叫散射，前向角散射与被测细胞直径的平方密切相关，侧向角散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信号。
荧光信号也有两种，一种是细胞自身在激光照射下发出的微弱荧光信号，另一种是经过特异荧光素标记后的细胞受激发照射后得到的荧光信号。
流式细胞仪常用的几种检测方法
流式细胞仪常用的几种检测方法1.细胞计数和生存率检测：流式细胞仪可以通过测定细胞的大小、形状和胞内染色物来实现细胞计数和生存率的检测。
通过自动聚焦和自动获取图像的功能，可以对大量的细胞进行计数和分析，并得出生存率数据。
2.表面标记检测：流式细胞仪可以利用荧光染料或荧光标记抗体对细胞表面的蛋白质、糖类或其他生物分子进行检测。
这种检测方法主要用于检测细胞表面标记的数量和分布情况，例如测定细胞表面特定抗原的表达水平。
3.细胞周期分析：流式细胞仪可以通过染色剂或荧光标记抗体对细胞进行染色，然后分析细胞在不同细胞周期阶段的比例。
这种检测方法可以用于研究细胞的增殖能力、细胞周期调控机制以及细胞周期与疾病发展的关系。
4.细胞凋亡检测：流式细胞仪可以利用染色剂或荧光标记抗体对细胞凋亡的标志物进行检测。
凋亡是细胞死亡的一种形式，通过测定凋亡细胞的数量和凋亡标志物的表达水平，可以研究细胞凋亡的调控机制以及细胞凋亡与疾病的关系。
5.细胞功能检测：流式细胞仪可以通过检测细胞内Ca2+浓度、ROS （活性氧物种）水平、蛋白质磷酸化等细胞功能指标来研究细胞的信号转导和功能活性。
例如，利用荧光染料可以测定细胞内钙离子的浓度变化，以研究细胞响应外界刺激的机制。
此外，流式细胞仪还可以进行细胞分选、多色细胞分析和细胞细胞间相互作用的研究。
细胞分选功能可以根据细胞标记物的表达水平将细胞分离出来，用于研究特定功能细胞的特性。
多色细胞分析可以用于同时检测多种标记物的表达水平，以揭示不同细胞类型的分子特征。
细胞间相互作用的研究可以通过检测细胞间的共聚或共表达标记物来研究细胞间的相互作用和相互影响。
总的来说，流式细胞仪是一种功能强大的实验室设备，常用于细胞生物学和疾病研究。
通过不同的检测方法，可以在细胞水平上研究细胞的数量、表面标记、周期、凋亡、功能以及细胞间相互作用等方面的特征。
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流式细胞仪的特点
•单个细胞/生物颗粒分析 •同时多参数、多荧光分析 •高通量检测/高速度 10000个细胞/秒以上 •定性/定量分析 •分选特定性状或功能的细胞 •可检测的样本种类多样
•(1)外周血，骨髓，细针穿刺，洗脱液，实体 组织，培养细胞 •(2)血清、血浆、培养上清、细胞裂解液
FCM的免疫学应用
• 免疫功能和免疫调控的研究 • 淋巴细胞和单核细胞的活化 • 细胞因子的研究 • 淋巴细胞的增殖 • 树突状细胞的研究
• HLA-B27检测
淋巴细胞亚群分析
• 使用特异的单克隆抗体，进行多色分析， 同时分析淋巴细胞上多种抗原的表达，可 以将淋巴细胞亚群区分开，进行定量分析
目前流式细胞仪可以检测的类别
细菌
浮游生物
红细胞
淋巴细胞
DM：0.2μ m ——15μ m
单核细胞
中性粒细胞
流式细胞仪的基本构造
信号收集与数据 处理系统
流动室与液流系统：将 细胞单个压入流动室
光学滤镜
激光发射器 发出所需要的波长的激光
光源与光学系统
侧向散射光检测器
前向散射光检测器
流动室
荧光信号 聚焦的激光光束
放射自显影 细胞成像定量分析系统
分光高度计，荧光高 度计，干涉光高度计
细胞计数仪
流式细胞仪
???
目标细胞分选
流式细胞术
流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种 可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒 （通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特 定群体加以分选
研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生 物、及人工合成微球等
FCM的科研应用
树突细胞研究 干细胞研究 癌症病人的多药耐药性 细胞动力学功能研究 环境微生物分析 流式细胞术与分子生物学研究
FCM的应用——肿瘤学
• 细胞周期分析 • 细胞凋亡的分析
•凋亡细胞的分析 •凋亡相关蛋白的分析 • 肿瘤相关基因表达的研究 • 多药耐药基因的研究
细胞周期分析
M G2
G0
细胞周期G1
s
细 胞 数 量
DNA分析
G0 G1
s G2 M
0
200
400
600
800
1000
2N
4N
DNA分析的临床意义
DNA分析诊断肿瘤
DNA非整倍体细胞峰 突出的四倍体细胞峰 SPF>15%
DNA倍体分析：
结合临床病理的形态学诊断，对一些恶性肿瘤进行早期诊 断，跟踪随访和早期治疗，大大提高一些肿瘤的治愈率和 生存率。尤其对一些细胞抽吸物、体液、组织液的脱落细 胞的分析，意义尤为重要。
细胞凋亡—Caspases-3
细胞凋亡—Annexin V
细胞凋亡—Annexin V
细胞凋亡—BrdU
FCM的应用——免疫学
• 淋巴细胞免疫分型
• 淋巴细胞亚群分析 • CD4绝对计数
• HIV的诊断与研究
• 淋巴细胞 CD4/CD8分析 • CD4绝对计数 • T细胞活化
• 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测
但仍然保持膜的完整性：Annexin V/PI • 细胞核DNA的断裂改变：TUNNEL实验（
APO-BRDU，APO-DIRECT）
• 凋亡相关蛋白：
• Fas • Bcl-2
细胞凋亡—PI分析
调亡细胞
正常G0/G1期细胞
PI - Fluorescence
Events
细胞凋亡—Active Caspases-3
•两者相结合就能说明 细胞种类
二维等高图和密度图
Pseudo 3D Plot
3D Plot
假三维图与三维图
常用荧光染料的特性
荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm)
FITC
488
525
PE(RD1) 488
575
ECD
488
Hale Waihona Puke 620PeCy5 488675
PI
488
620
PECy7 488
Injector Tip
鞘液
分选
将目标细胞 分离并富集 ，进行后续 研究。
分选纯度 >99%
流式细胞仪显示图的种类
FSC和SSC
直方图
散点图
•把前向散射光图和侧 向散射光图的一维图 像在二维图像上投影， 便是我们平常所看到 的流式图。
•所以横坐标表示的是 细胞的直径大小；纵 坐标表示的是细胞的 复杂程度。
755
PerCP 488
670
TO
488
525
用途
颜色
免疫荧光 绿色
免疫荧光 橙色
免疫荧光 橙红
免疫荧光 红
DNA染色 橙红
免疫荧光 深红
免疫荧光 红
RNA染色 绿
流式细胞术操作流程
样品 培养细胞 新鲜组织 石蜡包埋
单细胞 悬液
标记 荧光抗体
检测
表型测定
细胞分选
统计学 分析
继续 培养
FCM的检测范围
增殖状态分析：
反映了肿瘤的生长速度和侵袭性
正常人骨髓细胞DNA分析(ModiFIT)
多发性骨髓瘤
FCM在肿瘤早期诊断和鉴别诊断中的作用
DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌 变的一个重要标志
在病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信 息
DNA非整倍体的交界瘤应按恶性对待 形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可
第23讲
流式细胞仪检测技术 （FCM）
EPICS XL 流式细胞分析仪
Dual Parameter Histograms
细胞组学研究的过去、现在和未来
18世纪，明视野显微镜发明
暗视野光镜，相差显微镜， 微分干涉对比显微镜，偏振
光显微镜，荧光显微镜
单光子共聚焦显微镜，多光 子共聚焦显微镜
大体荧光成像系统
细胞结构
细胞功能
细胞大小 细胞粒度
细胞表面/胞浆/核 的特异性抗原
细胞表面面积
细胞活性
核浆比例
DNA含量与细胞周 期
细胞内细胞因子 酶活性
RNA含量
激素结合位点
蛋白质含量
细胞受体
FCM的临床应用
HIV免疫分型，CD4绝对计数 白血病和淋巴瘤的免疫分型 肿瘤的细胞周期和倍体分析 网织红细胞计数 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测 干细胞计数 残量白血病细胞检查 HLA-B27检查 血小板功能及相关疾病
能 DNA指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助
指标
细胞凋亡分析
• 细胞凋亡与细胞坏死是两个不同的过程 • 细胞凋亡的主要检查手段
• 形态学检测 • Ladders实验 • 流式细胞术检测
• 与凋亡相关的病理过程
• HIV • 自身免疫性疾病 • 肿瘤
细胞凋亡分析
• 细胞凋亡的主要指标
• 细胞内酶改变：Caspase-3活化 • 细胞膜不对称性改变，磷脂酰丝氨酸外翻，