细胞内细胞因子的流式细胞仪检测
流式细胞术检测细胞内细胞因子的研究进展
流式细胞术检测细胞内细胞因子的研究进展【摘要】：细胞因子具有调节细胞生长、分化成熟、功能维持、调节免疫应答、参与炎症反应、创伤愈合和肿瘤消长等多种生物学功能。
因此，细胞因子的研究成果为临床上预防、诊断、治疗疾病提供了科学基础，特别是利用细胞因子治疗肿瘤、感染、造血功能障碍、自身免疫性疾病等，具有非常广阔的应用前景[1]。
随着细胞表面标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。
流式细胞术也成为了检测单细胞水平细胞因子表达能力的重要检测方法。
本文针对流式细胞术在胞内细胞因子检测中的研究进展作一综述。
【关键词】：流式细胞术；细胞内；细胞因子；检测技术引言：细胞因子(cytokine，CK)是由多种组织细胞(主要为免疫细胞)所合成和分泌的小分子多肽或糖蛋白，能介导细胞之间的相互作用，并在抵抗外来病原及维持机体内环境平衡中起到重要作用。
细胞因子的检测方法一般分为生物学测定法、分子生物学测定法及免疫学测定法。
而目前用于检测单个细胞特定细胞因子表达的手段则包括：多参数流式细胞术，酶联免疫斑点法ELISPOT[2]、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting dilution analysis，LDA）和单细胞PCR等生物分析技术。
相较于其它的检测方法，流式细胞术在细胞内细胞因子的检测上具有高效、简便、适应性广等优势。
一、流式细胞术的概述流式细胞术(flow cytometry，FCM)是一种能够对单个细胞或生物微颗粒的生物学性质进行定量分析和分选的检测手段，具有快速、高精度、高准确性、多参数和高通量等优点，是目前先进的细胞定量分析技术之一。
FCM能够快速分析单个细胞或粒子的多种特性，既可以定性，也可以定量，尤其适用于大量样品检测，已在临床检验工作中得到广泛应用。
流式细胞仪（fluorescenceactivated cell sorter，FACS）的检测分析已涉及到细胞生物学、免疫学、肿瘤学、遗传学、血液学、微生物学等学科。
细胞因子 化学发光法 流式细胞法
细胞因子化学发光法流式细胞法
细胞因子的免疫学测定方法包括ELISA法、流式细胞仪法和酶联免疫斑点试验法等。
以下是这三种方法的介绍：
- ELISA法：具有特异、简便、易于标准化等优点，可同时检测大量标本。
其缺点是敏感性偏低，不能判断细胞因子的生物学活性。
- 流式细胞仪法：主要用于细胞内细胞因子和细胞表面黏附分子的检测，能简单、快速地进行单个细胞水平的细胞因子或黏附因子的检测，精确判断不同细胞亚群的细胞因子和膜分子的表达情况。
- 酶联免疫斑点试验法：便于观察和计数分泌细胞因子的细胞，一个斑点代表一个细胞因子分泌细胞，斑点的颜色深浅程度与细胞分泌的细胞因子量相关。
在选择细胞因子测定方法时，需要根据实验目的和条件进行选择。
如果需要同时检测大量样本，ELISA法可能更为合适；如果需要精确判断不同细胞亚群的细胞因子和膜分子的表达情况，流式细胞仪法可能更为适合。
流式细胞术检测人和小鼠细胞内细胞因子方法的建立
流式细胞术检测人和小鼠Th细胞亚群早在1986年Mosmann等[1]依据小鼠分泌的细胞因子谱不同首次将Th细胞分为Th1和Th2两个功能不同的独立亚群。
Th1细胞主要分泌IL-2、、IL-12、IFN-γ和TNF- α等细胞因子，介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，参与细胞免疫及迟发型超敏反应。
Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、 IL-6、IL-10和IL13等细胞因子，其主要功能为刺激B细胞增殖并产生抗体，与体液免疫相关。
由于Th1/Th2 亚群及其相互之间的平衡在免疫应答的调节中起着关键的作用，Th1/Th2 平衡的失调与多种疾病的发生发展和预后有着密切的关系。
目前已发现许多感染性疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病以及移植排斥反应等都与Th1/Th2 平衡有关。
因此建立稳定有效的细胞内因子检测方法对于准确说明Th1/Th2细胞的作用非常重要。
目前检测的主要方法有酶联免疫法、ELISPOT法、荧光定量法及原位杂交等方法。
流式细胞术检测细胞内因子是一种相对快速、重复性好并能准确定量的方法。
我们参照国内外的一些文献，对于人和小鼠Th1和Th2细胞的流式检测方法进行了探索，并比较了两者之间的不同。
由于未活化的淋巴细胞所分泌的细胞因子极少，用流式细胞仪很难检测出来，因此在检测前需刺激活化。
目前国内外推荐的刺激物主要为PMA （佛波酯）和离子霉素（Ionomycin）。
淋巴细胞在刺激物的作用下活化，分泌细胞因子到细胞外。
由于流式细胞仪只能对细胞表面或内部的抗原进行检测，因此必须阻止细胞因子的分泌。
抑制细胞因子分泌的试剂为Brefedlin A 或莫能霉素（Monensin）。
Th1/Th2 细胞首先是CD4+ T淋巴细胞。
因此如何确定CD4+ T淋巴细胞非常重要，我们主要围绕该问题进行探讨。
材料与方法试剂PMA（Sigma）贮存液：PMA 溶于DMSO 浓度为0.1mg/ml -20℃保存。
工作液：贮存液1:100 稀释于RPMI 1640培养基中，此时为1µg/ml。
检测细胞因子的常用方法
检测细胞因子的常用方法以检测细胞因子的常用方法为标题，本文将介绍细胞因子检测的常用方法及其原理和应用。
细胞因子是一类由免疫细胞产生的蛋白质分子，它们在细胞间传递信号，调节免疫反应和炎症反应。
细胞因子的异常表达与多种疾病的发生和发展密切相关，因此准确地检测和定量细胞因子对于研究疾病的机理、诊断疾病和评估治疗效果至关重要。
常用的细胞因子检测方法主要包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、流式细胞术和多重荧光素酶联免疫分析法（Luminex）等。
ELISA是一种常用的细胞因子检测方法。
它基于酶标记的抗体与待测细胞因子的特异性结合，通过酶的催化作用产生可观测的信号。
ELISA的原理是将待测细胞因子样本加入已经涂有特异性抗体的酶标板孔中，经过洗涤去除未结合物质，然后加入酶标记的二抗与待测细胞因子结合，再次洗涤后加入底物，底物与酶发生反应生成可观测的产物。
通过测量产物的颜色或荧光信号强度，可以定量检测细胞因子的含量。
流式细胞术也是一种常用的细胞因子检测方法。
它基于细胞因子与荧光标记的抗体的结合，通过流式细胞仪检测细胞因子的表达水平。
流式细胞术的原理是将待测细胞因子标记上荧光物质的抗体与细胞混合，使其结合到目标细胞表面的细胞因子上。
然后，通过流式细胞仪将荧光标记的细胞分析出来，并计算细胞因子的表达水平。
Luminex是一种高通量的细胞因子检测方法，它可以同时检测多个细胞因子。
Luminex的原理是将待测细胞因子样本加入含有多个不同荧光标记的微球的混合物中，每个荧光标记对应一个特定的细胞因子。
待测细胞因子与荧光标记的微球结合后，通过流式细胞仪检测微球上的荧光信号来定量细胞因子的含量。
Luminex具有高灵敏度、高通量和多重检测的优势，被广泛应用于细胞因子的研究和临床诊断。
细胞因子检测方法的选择应根据实验需求和样本特点来确定。
ELISA 适用于单个细胞因子的检测，操作简单，结果稳定可靠；流式细胞术适用于分析单个细胞的细胞因子表达水平，可以获得细胞因子的表达图谱；Luminex适用于同时检测多个细胞因子，具有高效、快速和经济的特点。
流式胞内细胞因子检测
流式胞内细胞因子检测流式胞内细胞因子检测是一种用于研究细胞因子在单个细胞水平上的表达和分泌的技术。
细胞因子是一类产生于免疫细胞和其他细胞类型中的小分子蛋白质，对于细胞的发育、增殖、分化和功能调节具有重要作用。
流式胞内细胞因子检测可以帮助科研人员了解细胞因子的表达模式、功能和调控机制，从而深入研究细胞免疫学、炎症反应、感染和免疫相关疾病等领域。
流式胞内细胞因子检测的原理是利用单克隆抗体与特定细胞因子结合，然后使用荧光标记的二抗检测这种结合。
首先，需要选取合适的抗体对细胞因子进行检测。
抗体通常选择单克隆抗体，因为其高度特异性和亲和性。
对于胞内细胞因子的检测，首先需要破坏细胞膜，使细胞内的细胞因子释放到胞外液中。
一般来说，可以通过细胞固定和渗透化处理来实现这一步骤。
接着，使用标记有荧光染料的二抗与细胞因子结合，产生荧光信号。
最后，使用流式细胞仪对细胞进行分析，并得到细胞因子的表达和分泌水平。
流式胞内细胞因子检测的优势之一是可以在单个细胞水平上进行分析。
通过研究单个细胞的细胞因子表达水平，可以得到更准确、具体的结果，避免了整体细胞群体的平均值的混淆。
此外，流式胞内细胞因子检测还可以同时分析多种不同细胞因子的表达和分泌水平，可以全面了解细胞因子的调控网络。
另外，流式胞内细胞因子检测还具有高灵敏度和高速度的特点，可以快速得到结果，并且对于微量样品的检测也有很好的表现。
流式胞内细胞因子检测在多个研究领域发挥了重要作用。
在免疫学领域，可以通过检测不同类型免疫细胞中细胞因子的表达水平，了解它们在免疫应答中的作用和调控机制。
在炎症反应研究中，可以检测炎症细胞中细胞因子的表达水平，从而了解炎症反应的机制，并寻找调控炎症的目标。
此外，流式胞内细胞因子检测还可以应用于感染和免疫相关疾病的研究，帮助科研人员了解疾病的发病机制和炎症信号通路。
然而，流式胞内细胞因子检测也存在一些局限性和挑战。
首先，流式胞内细胞因子检测需要选择合适的抗体对特定细胞因子进行检测。
流式细胞仪的简要介绍与注意事项
流式细胞仪的简要介绍与注意事项(流式细胞仪,注意事项)来源：评论：0我要评论[流式细胞仪的简要介绍与注意事项(流式细胞仪,注意事项)] 一、流式细胞仪的检测范围1．流式细胞仪可以检测细胞结构，包括：细胞大小、细胞粒度、细胞表面面积、核浆比例、DNA含量与细胞周期、R NA 含量、蛋白质含量。
2．流式细胞仪可以检测细胞功能，包括：细胞表面/ 胞浆/ 核的特异性抗原、细胞活性、细胞内细胞因子、酶活性、激素结合位点和细胞受体。
[关键词:流式细胞仪注意事项]…••一、流式细胞仪的检测范围1．流式细胞仪可以检测细胞结构，包括：细胞大小、细胞粒度、细胞表面面积、核浆比例、DNA含量与细胞周期、R NA 含量、蛋白质含量。
2．流式细胞仪可以检测细胞功能，包括：细胞表面/ 胞浆/ 核的特异性抗原、细胞活性、细胞内细胞因子、酶活性、激素结合位点和细胞受体。
二、流式细胞仪的临床应用1．流式细胞术在肿瘤学中的应用：流式细胞术可以检测肿瘤细胞增殖周期、检测肿瘤细胞表面标记、癌基因表达产物、进行多药耐药性分析、检测凋亡；2．流式细胞术在血液学中的应用：检测白血病和淋巴瘤细胞、活化血小板、造血干细胞（CD34+）计数、白血病与淋巴瘤的免疫分型、网织红细胞计数、细胞移植的交叉配型和免疫状态监测；3．流式细胞术在免疫学中的应用：可以进行淋巴细胞及其亚群分析、淋巴细胞免疫分型、检测细胞因子。
三、流式细胞仪的科研应用主要有细胞动力学功能研究、环境微生物分析、流式细胞术与分子生物学研究。
四、流式细胞术常规检测时的样品制备(一) 直接免疫荧光标记法取一定量细胞（约1×106细胞/ml），直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应（如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入），孵育20～60分钟后，用PBS（pH7.2 ～7.4）洗1～2次，加入缓冲液重悬，上机检测。
本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。
细胞因子检测方法
细胞因子检测方法
细胞因子检测方法是一种用于测量和评估细胞因子水平的实验技术。
细胞因子是一类重要的分子信使，它们在免疫调节、炎症反应和细胞信号传递中发挥着关键作用。
通过检测细胞因子的水平，可以更好地了解免疫系统的功能状态，对疾病的诊断和治疗具有重要意义。
目前，常用的细胞因子检测方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、流式细胞术和多重细胞因子检测技术等。
ELISA是一种常规的实验方法，通过特异性抗体与目标细胞因子结合，然后通过酶标记的二抗进行检测，并测量光学信号来定量细胞因子的水平。
ELISA具有高灵敏度和特异性，常用于检测单个细胞因子的水平。
流式细胞术是一种可以同时检测多个细胞因子的方法。
它基于细胞表面标记和荧光染料，通过流式细胞仪分析细胞因子的表达。
流式细胞术具有高通量和多参数分析的优势，可以同时检测多个细胞因子，为复杂疾病的研究提供了便利。
此外，近年来出现了多重细胞因子检测技术，如Luminex和Bio-Plex等。
这些技术基于微球和荧光染料的原理，可以同时检测上百种细胞因子，具有高通量和高灵敏度的特点。
多重细胞因子检测技术在疾病的诊断和治疗方面有着巨大的潜力。
细胞因子检测方法在临床诊断和研究中发挥着重要作用。
通过测量细胞因子的水平，可以评估免疫功能、炎症反应和疾病进展等，为疾病的早期诊断和治疗提供
了重要的参考依据。
随着技术的不断进步，细胞因子检测方法将持续发展，为临床医学和生物学研究提供更多的可能性。
细胞因子流式
细胞因子流式
细胞因子流式是一种检测细胞因子表达水平、类型、数量和功能的
高通量技术。
它是基于细胞分析仪原理的一种技术，可以将多种细胞
因子同时分析，从而获得更为全面和准确的信息。
细胞因子是一类介导细胞间信号传递的小分子蛋白质。
它们在机体免疫、炎症、发育和修复过程中发挥重要的生物学功能。
目前已知的细
胞因子有多种，包括促炎症因子、细胞生长因子、趋化因子等。
细胞因子流式技术主要通过使用荧光标记的单克隆抗体识别和检测不
同种类的细胞因子。
利用流式细胞仪的精细检测能力，可以实现同时
检测多种不同种类的细胞因子。
细胞因子流式技术的优点在于快速、高通量、准确、方便。
它可以用
于研究免疫细胞在病毒感染、恶性肿瘤、炎症和自身免疫性疾病等多
种疾病中的免疫调节机制。
同时，它还可以帮助研究人员快速发现新
的免疫调节标记并开发新的治疗方法。
除此之外，细胞因子流式技术还可应用于药物筛选、免疫细胞疗法、
临床诊断等多个领域。
它在新药开发、免疫治疗和疾病诊断中的应用
前景非常广阔。
总的来说，细胞因子流式技术在生命科学领域中具有重要的应用价值。
它的应用不仅可以促进我们对于细胞因子在生物学过程中的作用机制
的深入理解，而且可以在实际应用中为疾病的防治和药物开发做出重要的贡献。
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细胞内细胞因子的流式细胞仪检测一、简介随着研究的进展，仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能满足需要。
在单细胞水平研究细胞因子的表达能力对研究细胞因子在疾病中的作用越来越显的重要无比。
目前检测单个细胞特定细胞因子的表达手段包括：ELIspot、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting dilution analysis，LDA）和单细胞PCR，应用原位杂交技术和免疫组化方法观察细胞因子蛋白表达及mRNA表达可以识别Th1和Th2细胞，此方法可获得较强的细胞内信号，但此方法工作量大、主观性强，难以进行大样本检测，且人肉眼识别能力有很大的局限性，而ELISPOT及单细胞PCR技术，技术性强、劳动强度大，难以进行广泛推广。
随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。
下面主要对胞内细胞因子流式细胞技术作以介绍。
早期细胞因子表达与细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。
尽管研究应用T 淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如TH1(IL－2，IFN－ )与TH2(IL－4，IL－5，IL－10)，但这些研究很难外推，因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还未被揭示。
近来，Jung与Picker采用了monensin、PMA等药物预孵，用Brefeldin(BFA)、Monensin 阻断了胞内高尔基体介导的转运的方法使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。
因为自然状态下，T淋巴细胞产生少量的细胞因子，通常要对T淋巴细胞体外活化进行研究。
在体外刺激过程中，T淋巴细胞产生的细胞因子已释放出来，胞内细胞因子信号较弱，难以进行检测。
这一方法可检测单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。
在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。
且这些研究清楚地证明，只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子，静止的正常淋巴细胞(T、B、NK)不能分泌细胞因子。
胞内流式分析法是用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌，同时采用特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞的最小荧光背景。
具有其它方法难以比拟的优点：快速：流式定量检测细胞内细胞因子可在一天内完成，实验流程需6-8小时，实际操作时间为1-2小时，快速简便；简便：无需组织培养，可以全血分析，无需分离PBMCs；灵敏度高：高度灵敏的荧光标记与检测系统；高效：可以在同一个细胞内同时检测两种或更多种细胞因子，也可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞的亚型，进行多参数相关分析；安全：减少样本处理与生物源性污染接近生物体的分析条件：全血检测保留细胞及生化微环境更准确反映了体内状况。
二、所需仪器1.流式上样管及细胞培养皿或板2.25%CO2，37℃孵箱3. 混匀振荡器4.离心机5. 加样器、Tips6.流式细胞仪三、常用的标本类型和处理方法全血：使用肝素钠抗凝的真空采血管采血，不易采用肝素锂、EDTA和ACD抗凝剂，血样在8小时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5%。
如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。
自身血浆中外周血单个核细胞(PBMCs)：使用肝素钠抗凝的采血后，分离PBMCs，24小时内分析。
组织培养基中的外周血单个核细胞(PBMCs)：用Ficoll分离PBMCs，将细胞重悬于含10%热灭活胎牛血清(FBS)的RPMI－1640培养基中，调节细胞浓度为2×106细胞/ml。
细胞系与T细胞克隆：调节细胞浓度2×106细胞/mL于新鲜培养基中。
冰冻全血与PBMCs：使用1×红细胞裂解液处理活化的外周血或者PBMCs，用PBS漂洗，并用含1%的BSA及10%的DMSO的PBS重悬，－70℃冻存。
溶化后细胞置于染色管中，加上2～3mL的洗液，离心5分钟后，用破膜剂对细胞进行破膜和染色。
四、所需试剂1、细胞表面染色的荧光标记的单抗试剂依据实验需要选择特殊表面标志CD45圈定所有淋巴细胞CD3 圈定T淋巴细胞CD4 圈定T辅助淋巴细胞亚群CD8 圈定T抑制淋巴细胞亚群CD19/或CD20圈定B淋巴细胞CD56圈定NK淋巴细胞CD14圈定单核细胞2、荧光标记的细胞因子抗体：R&D提供FITC、PE和APC标记的细胞因子抗体3、溶血素：用外周全血检测时需使用溶血素（R&D目录号WL1000用于人或者WL2000用于小鼠；eBioscience目录号00-4333）溶解红细胞4、激活剂①Phorbol 12-Myristate 13 Acetate(PMA)（Alexis，目录号ALX-445-004-M001）A. DMSO中调节浓度0.1mg/mLB. 分装(20μL)，－20℃储存。
勿反复冻融C.每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：100稀释储存液D.PMA终浓度25ng/mL细胞悬液②Ionomycin （Alexis,目录号ALX-450-006-M001）A. 于乙醇中配制成浓度0.5mg/mLB. －20℃储存C. 每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：10稀释储存液D. Ionomycin终浓度1μg/mL细胞悬液③Staphylococcal enterotoxin B(SEB) (Sigma,Catalog No.S-4881)A. 无菌无叠氮钠PBS调节浓度0.5mg/mLB. 4℃储存C. SEB终浓度10μg/mL细胞悬液④CD3：包被在培养板中，在蛋白转运抑制剂存在下活化未稀释的血液细胞⑤CD28：加速不同刺激剂（包括SEB、CD3等）的活化效应，浓度一般为10ug/ml5、阻断剂阻断高尔基体介导的转运作用，使得刺激细胞表达的细胞因子聚集在胞浆内①Brefeldin-A(BFA) （eBioscience，目录号00-4506）A. 于DMSO中调节浓度5mg/mLB. 分装(20μL)，-20℃储存。
勿反复冻融。
C. 每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：10稀释储存液D. 激活最后4－5小时BFA终浓度10μg/mL细胞悬液。
注意：BFA过度孵育会导致细胞活力下降②Monensin （eBioscience，目录号00-4505）6、不含谷氨酰胺的RPMI-16407、固定剂：细胞在体外刺激后需要对细胞进行固定。
固定的目的在于通过蛋白的交联和变性一方面使细胞因子固定在细胞内，另一方面避免细胞表面抗原丢失。
含4%的多聚甲醛PBS溶液（eBioscience，目录号00-8222）8、破膜剂：含1％皂甙、0.05％叠氮化钠的Hanks溶液（HBBS）（eBioscience，目录号00-8333）将细胞膜穿孔，已利于荧光标记的细胞因子抗体进入细胞内，于相应的细胞因子结合9、其它试剂：无菌无叠氮钠PBS，乙醇，含1%多聚甲醛的PBS，4℃储存。
五、细胞培养和刺激的基本方法细胞活化的最终结果是产生细胞因子，根据检测指标和标本的不同，研究人员需要选择不同的刺激剂和刺激时间，以获得最佳的实验结果。
下表提供了检测一些常用细胞因子的推荐的活化方法。
表1、细胞内细胞因子流式检测推荐的阳性对照活化方法人TNF-人IL-1小鼠IFN小鼠TNF-为防止细胞内细胞因子分泌到胞外，在培养的最后4-6个小时，需要使用蛋白转运抑制剂(如3uM monensin，10mg/ml的BFA)方法1: 只使用转染细胞检测方法2: 人的PBMCs使用PMA (10 ng/ml) 和Ionomycin (1 uM) 刺激4-24 小时.方法3: 人的PBMC 使用LPS (0.5 - 1 ug/ml) 刺激24 小时.方法4: 人的PBMCs或者纯化的CD4＋细胞在包被人CD3抗体的培养板中，使用含有重组人的IL-2（10 ng/ml，目录号202-IL-010）和IL-4（10 ng/ml，目录号204-IL-005）的培养基培养两天；细胞洗涤后在含有重组人IL-2和IL-4的培养基中继续培养2天；最后收获细胞，使用PMA (10 ng/ml) 和Ionomycin (1 uM)刺激6小时方法5: CD4+ T 细胞使用PHA (10 ng/ml) 刺激4 days方法6: T 细胞使用抗CD3 的单抗、抗CD28的单抗和重组人的IL-1b (Lorre, et al., 1994, Clin Immuno Immunopath 70:1)方法7: 使用PMA (50 ng/ml) 和Ionomycin (500 ng/ml)刺激方法8: PBMCs细胞使用重组人IFNγ (10 ng/ml，目录号285-IF-100) 刺激2 小时，然后使用IFNγ (10 ng/ml) + LPS (1 ug/ml) 刺激22小时或者使用相同的方法刺激THP-1 细胞.方法9: EL4 在包被抗小鼠CD3抗体(25 ug/ml) 的培养板中，使用抗CD28 抗体(2 ug/ml) + PMA (5 ng/ml) + Ionomycin (500 ng/ml) 刺激6小时方法10: CD4＋T细胞在包被小鼠CD3(25 ug/ ml)抗体的培养板中，使用含有抗小鼠的CD28(2 ug/ml)的抗体，重组小鼠的IL-2（10 ng/ml，目录号402-ML-020）和IL-4（50 ng/ml，目录号404-ML-005）的培养基培养两天；然后在含有重组小鼠IL-2和IL-4的培养基中继续培养3天；最后收获细胞，使用PMA(5 ng/ml)、Ionomycin(500 ng/ml)和monensin刺激6小时。
方法11: 小鼠ip巨噬细胞使用Mouse ip 1 ug/ml LPS 刺激24小时方法12: 小鼠脾细胞使用PMA (5 ng/ml)和Ionomycin (500 ng/ml)刺激6小时六、流式检测细胞染色基本过程（以全血为例）1、收获细胞：肝素钠抗凝的静脉血，按1：1与培养基混匀，加刺激剂，同时加蛋白转运抑制剂（参照说明书），混匀后，37℃，5%二氧化碳培养4-6小时2、阻断Fc受体：用于消除非特异性的结合染色①在小鼠，可使用纯化的FcII/III受体的抗体（CD16/32），按照1ug/106细胞的用量，在染色缓冲液中4℃孵育15分钟，PBS清洗后，直接进行下一步染色。
②对于人和大鼠，可直接使用过量的与荧光抗体相同来源和亚型不相关的纯化Ig或者血清进行阻断3、细胞表面染色①加适当的细胞表面染色试剂20μL于Falcon管中，加入100μL激活后的全血(细胞浓度维持在2×106/mL) 混匀，室温暗处孵育15分钟；②加入溶血素，室温暗处孵育10分钟。