流式细胞仪技术
流式细胞仪技术
①细胞生物学：定量分析细胞周期并分选不同细胞周期时相的细胞；分析生物大分子如DNA、RNA、抗原、癌基因表达产物等物质与细胞增殖周期的关系，进行染色体核型分析，并可纯化X或Y染色体。
②肿瘤学：DNA倍体含量测定是鉴别良、恶性肿瘤的特异指标。
近年来已应用DNA倍体测定技术，对白血病、淋巴瘤及肺癌、膀胱癌、前列腺癌等多种实体瘤细胞进行探测。
用单克降抗体技术清除血液中的肿瘤细胞。
③免疫学：研究细胞周期或DNA倍体与细胞表面受体及抗原表达的关系；进行免疫活性细胞的分型与纯化；分析淋巴细胞亚群与疾病的关系；免疫缺陷病如艾滋病的诊断；器官移植后的免疫学监测等。
④血液学：血液细胞的分类、分型，造血细胞分化的研究，血细胞中各种酶的定量分析，如过氧化物酶、非特异性酯酶等；用NBT及DNA双染色法可研究白血病细胞分化成熟与细胞增殖周期变化的关系，检测母体血液中Rh(+)或抗D抗原阳性细胞，以了解胎儿是否可能因Rh血型不合而发生严重溶血；检测血液中循环免疫复合物可以诊断自身免疫性疾病，如红斑狼疮等。
⑤药物学：检测药物在细胞中的分布，研究药的作用机制，亦可用于筛选新药，如化疗药物对肿瘤的凋亡机制，可通过测DNA凋亡峰，Bcl-2凋亡调节蛋白等。
细胞凋亡研究细胞凋亡是细胞在基因控制下的有序死亡，在疾病发生、发展中有重要作用，因而研究细胞凋亡有重要意义。
细胞凋亡检测方法很多，应用流式细胞仪技术可根据细胞在凋亡过程中发生一系列形态、生化变化从多个角度对细胞凋亡进行定性和定量的测定。
1. 细胞形态变化：通过流式细胞仪测定细胞光散射的变化来观察细胞凋亡。
在细胞凋亡早期，细胞前向角光散射的能力显著降低，90°角光散射的能力增加；在细胞凋亡晚期，前向角和90°角光散射的信号均降低。
此方法特异性不强，目前使用较少。
2 细胞膜功能改变：（1）磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine PS）异位：正常情况下，PS位于细胞膜内层，细胞发生凋亡时PS从细胞膜内翻转并暴露在细胞膜外层，是细胞发生凋亡的早期事件。
流式细胞技术原理及方法
流式细胞技术原理及方法
流式细胞技术（Flow cytometry）是一种用于检测和分析细胞的高通
量技术，能够同时分析多种细胞参数。
其原理是通过将单个细胞悬浮液通
过一个细长管道，然后通过激光束照射细胞并记录细胞与激光的相互作用，最后用多个光学信号检测器来收集和分析这些信息。
细胞排序是流式细胞技术的第二步。
流式细胞仪可以根据不同的细胞
参数，如大小、形状和荧光强度等对细胞进行排序。
这种方法可以根据用
户的需求，选择性地分离和收集一些细胞亚群，进一步进行下一步的实验
分析。
数据分析是流式细胞技术的最后一步。
流式细胞仪会收集大量的数据，包括荧光信号的亮度和位置等信息。
这些数据通常以直方图的形式呈现，
可以通过专业的分析软件进行解析和统计分析。
数据分析可以帮助研究人
员确定细胞亚群的比例、亚群之间的差异和相似性等信息。
流式细胞技术在许多领域中被广泛应用。
在免疫学研究中，流式细胞
技术可以用来分析和鉴定免疫细胞亚群，如T细胞、B细胞和巨噬细胞等，以及它们的功能状态和表达的分子。
在癌症研究中，流式细胞技术可以用
来检测肿瘤细胞和癌症干细胞，以便进行诊断和预后评估。
在生物医药研
究中，流式细胞技术可以用来评估各种药物对细胞表型、凋亡和增殖等影
响的研究。
综上所述，流式细胞技术是一种强大的细胞分析方法，能够同时检测
和分析多种细胞参数。
这种技术的原理和方法相对复杂，但其在生物医学
研究和应用中具有广泛的应用前景。
流式细胞仪及流式细胞术
流式细胞仪及流式细胞术流式细胞仪技术流式细胞仪技术，主要是测量群体中单个细胞经适当染色后其成分所发出的散射光和荧光，经染色的细胞在悬液中以单行流过高强度光源的焦点，当每个细胞经过焦点时，发出一束散射光/或荧光。
它们经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器(光电倍增管或一个固态装置)，光检测器把散射光定量转化成电信号，经数字转换器进行数字化后而成整数，然后进行电子存储，以后数据可以调出显示和进行分析。
其优点如下：1、具有操作简便，只要将染色的单个细胞推入仪器中，就会得出数据。
2、具有较高的灵敏度及测定速度，而且每次可测出许多数据，一般情况下，每秒可测5000个细胞，能迅速分析和记数大量细胞，并能准确统计群体中荧光标记细胞的比例。
3、应用广泛，即可用于测定细胞活力、繁殖周期和细胞定型分析，也可区别死亡细胞、分裂细胞和静止细胞群，既可测定DNA和RNA、测凋亡峰，又可测蛋白含量，特别是胞浆蛋白。
基本流程原理：1、将待测细胞染色后制成单细胞悬液，用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定的角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。
2、流式细胞仪通常以激光作为发光源。
经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。
这两种信号同时被前向光电二极管和90度方向的光电倍增管接收。
散射光不依赖任何细胞样品的制备技术，被称为细胞的物理参数或固有参数，散射光有包括前向角散射和侧向叫散射，前向角散射与被测细胞直径的平方密切相关，侧向角散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信号。
荧光信号也有两种，一种是细胞自身在激光照射下发出的微弱荧光信号，另一种是经过特异荧光素标记后的细胞受激发照射后得到的荧光信号。
流式细胞术基本原理与实用技术
流式细胞术基本原理与实用技术流式细胞术（Flow Cytometry）是一种常用的细胞分析技术，它基于光学、电子和计算机技术，能够对单个细胞进行快速、准确的多参数分析。
本文将介绍流式细胞术的基本原理和实用技术。
一、基本原理流式细胞术的基本原理是利用细胞在液体中悬浮的特性，在流动状态下通过一个细胞计数器，同时对细胞进行多参数的检测和分析。
其主要包括以下几个步骤：1. 细胞样品的制备：将待检测的细胞样品进行预处理，如离心、洗涤等，以获得单细胞悬浮液。
2. 细胞的进样：将细胞悬浮液通过微细管道进入流式细胞仪的流动系统中，形成单细胞的液体流。
3. 细胞的定位和聚焦：利用激光束对细胞进行定位和聚焦，使其逐个通过探测区域。
4. 细胞的激发和发射：通过激光束的照射，激发细胞中的荧光染料或标记物，使其发射特定波长的荧光信号。
5. 光信号的收集和处理：收集细胞发射的荧光信号，并经过光学系统进行分光、分束、分光和聚焦，最后通过光电倍增管或光电二极管转换为电信号。
6. 数据的获取和分析：将电信号转化为数字信号，并通过计算机系统进行数据采集、存储和分析，得到细胞的各项参数及相关统计学分析。
二、实用技术1. 细胞标记技术：为了能够准确地检测和分析细胞的特定性质，常常需要对细胞进行特异性的染色或标记。
常用的标记方法包括荧光染料、抗体标记和基因表达标记等。
2. 多参数分析技术：流式细胞术可以同时检测多个参数，如细胞大小、形态、表面标记物的表达、细胞周期等。
通过合理选择和配置荧光染料和滤光片组合，可以实现多重标记和多参数分析。
3. 数据分析软件：流式细胞术产生的数据量庞大，需要借助计算机软件进行数据的分析和解读。
常用的数据分析软件有FlowJo、CellQuest、ModFit等，它们可以对细胞的分布、比例、相关性等进行统计学分析和图形展示。
4. 高通量流式技术：随着科学研究的深入和技术的发展，高通量流式技术逐渐兴起。
它通过提高仪器的样品处理速度和自动化程度，实现对大量样品的快速检测和分析，广泛应用于生物医学研究和临床诊断。
流式细胞仪
1、流式细胞术(英文flow cytometry)是一种生物学技术，用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。
这种技术可以用来对流过光学或电子检测器的一个个细胞进行连续的多种参数分析。
目录* 1 原理* 2 流式细胞仪(flow cytometer)* 3 应用* 4 参见原理一束单色光（通常是激光）照到流体力学聚焦的一股流体上。
若干个检测器瞄向流束和激光相交的这个点，其中一个和激光在同一直在线（称作前散射(FSC)），其它几个和激光垂直（旁散射(SSC)和一个或几个荧光监测器）。
当每个悬浮颗粒通过光束时会按某种方式把光散射，同时所带有的荧光化合物被激发并发射出频率低于激发光的荧光。
这些散射光和荧光的组合数据被检测器记录，根据各检测器亮度的波动（每个细胞会显出一个散射或荧光的峰）就能够推算出每个颗粒的物理和化学性质。
前散射与细胞体积相关，而旁散射取决于颗粒的内部复杂程度（比如核的形状、胞质内颗粒的种类或者末的粗糙程度）。
可以检测的参数有：细胞的体积和形态复杂程度、细胞中的色素、DNA（细胞周期分析、细胞动力学、细胞增殖等）、RNA 染色体分析和分选（文库构建、染色体涂染）、蛋白质、细胞表面抗原（CD标记）、胞内抗原（各种细胞因子(cytokine)、次级媒介等）、核抗原、酶活性、pH，胞内离子化的钙、镁，膜电势、膜流动性细胞凋亡(apoptosis)（定量检测DNA降解、线粒体膜电位、通透性变化）、细胞存活能力、监测细胞电通透性、氧爆作用(oxidative burst) 、研究癌细胞中的多重耐药性(multi-drug resistance, MDR) 、谷胱甘肽、各种组合（DNA/表面抗原等等）流式细胞仪(flow cytometer)流式细胞仪又称荧光激活细胞分选器、荧光活化细胞分类计（FACS，Fluorescence Activated Cell Sorter）。
现代的流式细胞仪每秒可以实时检测几千个颗粒，并且可以主动分离具有不同特性的颗粒。
细胞生物学流式细胞仪分析技术研究
细胞生物学流式细胞仪分析技术研究细胞生物学是生物学的一个分支，主要研究细胞的结构、功能和活动。
随着科学技术的进步，越来越多的细胞生物学研究利用流式细胞仪分析技术，这项技术已成为现代细胞生物学研究的重要手段之一。
一、什么是流式细胞仪？流式细胞仪是一种现代化的细胞生物学技术，通过细胞的物理特性分离和分析细胞，使得细胞间的差异得以更加细致地研究。
通俗来说，流式细胞术就是将需要研究的细胞通过某种方式变成单个细胞，然后运用指定的设备将这些单个细胞分类。
二、流式细胞仪有什么特点？流式细胞仪在细胞分析中的作用主要体现在如下几个方面：1、高速度：流式细胞仪一般能够分析数百个或者数千个细胞，但是也有少量最高能够同时分析几十万个细胞的超大型仪器，分析速度极快。
速度快意味着样本优选几次，可以在非常短的时间内分析出大量的样本，从而追踪细胞分析对结果的影响。
2、高精度：流式细胞仪分析的样本极具目测性，同时将数据处理相当精确，因此流式细胞仪可以准确地分析不同的细胞质、核形态及染色体。
3、多参数同时分析：流式细胞仪可以对许多参数获得同时数据。
不仅能够分解及分析荧光染料的强度及频率，这项技术还可以同时测量多个分子。
三、流式细胞仪常用于哪些领域？流式细胞仪分析技术被广泛应用于不同的研究领域和实践环境中。
其中一些领域有：1、生物医学研究：流式细胞仪在生物医学研究领域中，是一种非常有用的手段，用于分析细胞的数量和特征。
2、病毒学研究：流式细胞仪也可以应用于抗病毒抵抗性和治疗策略的研究。
3、肿瘤学研究：利用流式细胞仪可以分析癌细胞繁殖性、凋亡率、侵袭性等细胞特性，为癌症的预后及治疗方案提供有用的信息。
四、流式细胞仪实验该如何进行？流式细胞仪实验一般需要分为以下几个步骤：1、准备细胞悬液：通常使用生长良好的单细胞悬液作为分析样品。
样品为新鲜的活细胞，一般从培养物、外周血或组织雾化制得。
2、细胞净化：细胞悬液需要通过漂浮中和负离子小珠、葡聚糖或其他分离方式，使其具有悬浮性，然后进行进一步处理。
流式细胞仪分析技术
流式细胞仪分析技术流式细胞仪（Flow cytometry）是一种广泛应用于细胞学和免疫学研究的分析技术。
它结合了光学、生物技术和数字技术，可以迅速、准确地分析单个细胞的形态特征、生理状态、分子表达和细胞功能等。
流式细胞仪分析技术与传统的显微镜观察方法相比，具有高通量、高灵敏度、高分辨率、高准确性和自动化等优势。
流式细胞仪分析技术的原理是基于细胞在流体中的特性和细胞与激发光交互作用时所产生的光信号。
具体而言，流式细胞仪通过光源产生一束激发光，并经过一系列的光路元件，将光束聚焦在细胞悬液中的细胞上。
细胞在激发光的作用下，会发出散射光和荧光光，然后通过一系列的光学滤波器和光学器件，将光信号转化为电信号，并通过光敏器件转化为数字信号。
最终，这些数字信号可以被计算机采集和分析，从而得到细胞的相关参数和信息。
1.细胞计数和细胞大小测量：流式细胞仪可以通过细胞的散射光信号，计算细胞的浓度和大小。
这对于确定细胞的增殖状态、细胞密度和细胞生长速度等具有重要意义。
2.细胞凋亡分析：流式细胞仪可以通过荧光标记技术，检测细胞凋亡相关的标志物，如细胞膜外磷脂翻转和DNA断裂等。
这对于研究细胞凋亡的发生和调控机制非常重要。
3.细胞表面标记物检测：流式细胞仪可以利用荧光标记的抗体，检测细胞表面的特定抗原或受体，从而研究细胞的分型、功能和相互作用等。
这对于免疫细胞的表型分析和免疫细胞亚群的鉴定非常有价值。
4.荧光蛋白标记检测：流式细胞仪可以利用荧光蛋白标记，检测细胞内特定蛋白的表达水平和分布情况。
这对于研究基因表达调控和蛋白质相互作用等具有重要意义。
总之，流式细胞仪分析技术在生命科学研究中起到了重要的作用。
它可以为研究人员提供关于细胞数量、大小、形态、生理状态、分子表达和细胞功能等多样化信息，为细胞学和免疫学的基础研究、新药研发和临床诊断等方向提供有力的支持。
随着技术的不断发展和改进，流式细胞仪分析技术将在未来发展得更加成熟和广泛应用。
流式细胞仪常用技术方法)
流式细胞仪常用技术方法细胞周期/DNA分析（PI法）一、鞘液准备（至少3L PBS，提前一天准备）0.01M的PBS配制方法：800ml蒸馏水中溶解NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO40.24g；调节pH到7.2-7.4（用HCl或NaOH调节，各地蒸馏水的酸碱度不同），加蒸馏水定容至1L，0.22um滤膜过滤后，室温保存。
二、制备一个阴性对照来设定流式细胞仪的取样参数和十字门的范围：没有染色的细胞（制备过程如下，仅不加抗体）三、实验步骤1.取对数期生长细胞，倒去培养液，胰酶适度消化细胞，用培养液吹打，1000rpm，离心10min弃上清；2.PBS洗2次，加0.5ml吹匀，务必吹散；3.加入70%预冷乙醇中（标准做法是将细胞悬液加入预冷70％酒精），固定时可加入Triton X-100以增加膜的通透性）封口膜封口，4℃固定1-2h或过夜（可长至一个月）；4.1000rpm×10min离心收集细胞，PBS洗两次；5.用0.4mlPBS重悬细胞并转移至离心管中轻轻吹打；6.加入Rnase-A约3ul至终浓度50ug/ml，37℃水浴消化30min；7.加入PI约50ul至终浓度约为5-50ug/ml，室温避光染色30min；8.用300目滤网过滤，上机检测。
细胞周期/DNA分析(BD公司CycleTEST PLUS DNA Reagent Kit)一、鞘液准备（至少3L PBS，提前一天准备）0.01M的PBS配制方法：800ml蒸馏水中溶解NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO40.24g；调节pH到7.2-7.4（用HCl或NaOH调节，各地蒸馏水的酸碱度不同），加蒸馏水定容至1L，0.22um滤膜过滤后，室温保存。
二、制备一个阴性对照来设定流式细胞仪的取样参数和十字门的范围：没有染色的细胞（制备过程如下1-6）三、若做DNA倍体分析，需另设附加对照管肿瘤细胞和外周血单核细胞的混合管，比例至少为2：1四、实验步骤1. 将细胞消化后，用冷PBS洗细胞两次，300g×5min（若细胞数过少可提高转速到500g），为减少细胞损失可用1.5ml离心管离心；2. 弃上清留大约50ul下面的液体防止碰到细胞团，加入1ml Buffer Solution并低速混匀细胞。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
能量传递复合染料机制
488nm
575nm CY5
PE
CY5
藻红蛋白
CY5
花青苷5
670nm 红色荧光
（二）免疫荧光标记
¾ 荧光染料与细胞成分的四种结合方式 结构亲和式 嵌入结合 共价键结合 荧光标记抗体特异性结合
测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。
• 分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细
胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。 与分选速度成反比。
第二节 数据的显示与分析
• 参数：FS,SS,FL • 数据显示方式 （单参数直方图 、双
参数散点图 、二维等高图 、假三维 等高图 、三参数散点图 ） • 设门分析技术
第十七章 流式细胞仪分析技术及应用
第一节 概述 一、工作原理 二、散射光的测定 三、荧光测量 四、细胞分选原理
第二节 数据的显示与分析 一、参数 二、数据显示方式 三、设门分析技术
第三节 流式细胞仪免疫分析的技术要求 一、免疫检测样品制备 二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色 三、免疫胶乳颗粒的应用 四、流式细胞免疫学技术的质量控制
激发 波长 488
568
488
488
荧光颜 色
绿 525
红 615
橙 575
633 红 670
488 红 670
溶解性 易
不易
易
易
对PH敏感 性
特点
敏感 易溶于水，与抗体结 合不影响特异性
不敏感 稳定，偶联后量子产 额低
不敏感 具较多发光基团，消 光系数和量子产额高
不敏感 减少交叉，成本高
能量传递复合染料
• 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的 多个不同特征。
• 线性放大器和对数放大器
荧光染料的特性
•激发波长(EXCITING) •发射波长(EMISSION)
荧光补偿
四、细胞分选原理
通过流式细胞仪进行细胞分选 主要是在对具有某种特征的细胞需 进一步培养和研究时进行的。
（一）分选基本原理
1.流式细胞仪的基本结构：
（1） 液流系统 （2） 光学系统 （3） 数据处理系统
（1）液流系统
• 由样本和鞘液组成 • 待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标记的
单抗对其染色 受清洁气体压力 从样品管进 入流动室形成样本流 • 鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是 包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心 位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。
此为血细胞分类 的基本原理，但不能 分析表面分子。
单核细胞
中性粒细胞
淋巴细胞
光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群
三、荧光测量
• 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激 发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。
• 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过 波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧 光信号区分开，送入不同的光电倍增管。
¾ 免疫荧光标记方法 直标:干扰少,但需购买多种单抗 间标:步骤多,干扰多,不需标记多种抗体 组合标记
三、免疫胶乳颗粒技术的应用
• 免疫胶乳颗粒的应用即液相芯片技术是把微小 的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把 针对不同检测物的乳胶微球混合后再加入待标 本，在悬液中与微粒进行特异性地结合，经激 光照射后不同待测特产生不同颜色，并可进行 定量分析。因检测速度极快，所以又有“液相 芯片”之称 。
FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）
光学系统示意图
Flow Tip
SS and FL Detector
FS Detector
Laser
（3）数据处理系统
主要由计算机及其软件组成
基本工作原理
基本过程
已标记的单细 硅化管 胞悬液和鞘液
流动室 形成稳态 喷嘴 水平激光与之 荧光染料被
单细胞液柱
垂直相交 激发发光
荧光检测系统和
收集光信号 光电倍增管
放大 脉冲信号
散射光感受系统
计算机系统 分析结果
流式细胞仪与显微镜的区别
区别 光源 对象 承载工具 检测信号 放大方式 统计 结果
流式细胞仪 激光
细胞、生物粒子 鞘液及流动室 光学信号 PMT、放大电路 计算机，>5000
多参数，综合分析
显微镜 自然光、灯光 细胞、组织等
细胞悬液形成液流柱 压电晶体 产生机械振动
流动室振动
液流断裂成液滴
空白液滴 不充电
弃去
含细胞的液滴 充电
偏转落入收集器
（二）分选的技术要求
• 分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬
液中细胞的含量成正比。
• 分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞
的百分率。
• 分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过
洗涤
尼龙网过滤
使贴壁细胞脱落
¾新鲜实体组织单细胞悬液的制备
• 机械法 • 酶处理法 • 化学试剂处理法 • 表面活性剂处理法
¾单细胞悬液的保存
• 深低温保存法（一年） • 乙醇或甲醇保存法（2周） • 甲醛或多聚甲醛保存法（2月）
二、常用的荧光染料与标记染色
适用条件:
• 有较高的量子产额和消光系数 • 对488nm的激发光波长有较强的吸收 • 发射光波长与激发光波长间有较大的波长差 • 易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性
Flow-count
（四）免疫检测的质控
• 同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照， 选用相同源性的未标记单抗作为对照调整和 设置电压，以保证特异性。
• 全程质量控制：与待测标本一起标记和检测， 结果达靶值，提示本次实验结果可靠。
第四节 在免疫学检验中的应用
流式细胞术目前已广泛地被应用于免疫学 基础研究和逐步进入临床应用各方面，用流式 细胞仪对细胞表面的抗原成分进行标记分析， 可区别多种细胞的特性，为细胞免疫的研究增 加了有效的手段和帮助。
微小的乳胶微球分别染成上百 种不同的荧光色（固相芯片是 用探针在芯片上的坐标位置给 基因的特异性编码；而液相芯 片则是用颜色来编码）
通过对标记不同荧光素分子的检测，实 现FCM对可溶性物质的定量分析
四、流式细胞免疫学技术的质量控制
（一）单细胞悬液制备的质控
• 适当的制备方式 • 处理红细胞 • 实体组织来源标本用机械法 • 温度25~37℃，pH7.0~7.2
根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆 形门、多边形门、任意形状门和十字门。
A 淋巴细胞 B 单核细胞 C 中性粒细胞
A、B、C均 为任意门
线性门
• Region设置:
区阈（region, R）与门(gate, G ) 是两个 相关的概念，区阈可与门对应，但是也 可以包含于门。
如十字门分析时，起 就可以由四个区域构 成，即 G=D1+D2+D3+D4。
载玻片 形态及染色 目镜×物镜、光学放大 人工，200 简单，单参数
二、散射光的测定
细胞在液柱中与激光束相交时 向周围360°立体角方向散射的光线 信号，它的强弱与细胞的大小、形 状、胞内颗粒折射等有关，主要分
为前向散射光和侧向散射光。
前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光 以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细 胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。
（二）免疫荧光染色的质控
• 温度 • pH • 染料浓度 • 固定剂
（三）仪器操作的质控
• 光路与流路校正: 确保激光光路与样品 流处于正交状态，减少变异（CV）。
Flow-check
• PMT（光电倍增管）校准: 保证样品检测 时仪器处于最佳灵敏度工作状态。
Flow-set
• 绝对计数校准: 保证计数的准确性。
1.双参数直方图点图
红 色 荧 光 强 度
绿色荧光强度
双参数直方图点图
2. 二维等高图
• 由类似地图上的等高线组成，其本质也是 双参数直方图。
• 等高图上每一条连续曲线上具有相同的细 胞相对或绝对数，即“等高”。
• 曲线层次越高(越里面的线) 所代表的细胞 数愈多。
• 等高线越密集则表示细胞数变化率越大。
D1 CD4+/CD3D2 CD4+/CD3+ D3 CD4- /CD3D4 CD4- /CD3+
第四节 流式细胞仪免疫分析的技术要求
• 样本制备 • 标记染色 • 液相芯片技术 • 质量控制
一、免疫检测样品制备
单细胞悬液 ¾外周血淋巴细胞样品的制备
分离单个核细胞
¾培养细胞的样品制备
蛋白酶消化 机械吹打
前向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细 胞时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内部 结构属性。
侧向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
测得的FS与SS信 号通过计算机处理， 可得到FS-SS图，由 此可仅用散射光信号 对未染色的活细胞进 行分析或分选。
二维等高图
3. 假三维等高图
（三）三参数直方图
（四）流式细胞仪的多参数分析
多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激 发光激发后，得到的荧光信号和散射光信 号可根据需要进行组合分析。
三、设门分析技术
Gate设置：指在某一张选定参数的直 方图上，根据该图的细胞群分布选定 其中想要分析的特定细胞群，并要求 该样本所有其他参数组合的直方图只 体现这群细胞的分布情况。