流式细胞仪分析技术及应用
流式细胞术及其应用(1)
血小板检测指标：
质膜糖蛋白：CD41/CD61（gpⅡb/Ⅲa）、
CD42b(GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ)
颗粒膜糖蛋白：CD62P、CD63、TSP。
活化：gpⅡb/Ⅲa复合物—活化早期标志物
CD62P—活化后期的表面标志
血小ห้องสมุดไป่ตู้抗体（PAIgG）。
网织血小板计数：常用染料为TO。
应用 血小板无力症诊断：
而现代流式细胞术，更是由于结合 了单克隆抗体技术、定量细胞化学和定 量荧光细胞化学的应用，使其在生物学、 临床医学、药物学等众多研究领域的应 用将会越来越广泛。
五、流式样品的制备中应注意的几个问题
㈠荧光素和抗体的选择
⒈荧光素的选择：现在国内引进的大多数流式 细胞仪只装有一个激光光源，即488nm光源，所以 我们在选择荧光素时要选择能被488nm激光激发的 荧光素，常用的荧光素有：
选择纯度高的抗体、用同型对照抗 体或双标记排除非特异荧光
在细胞生长状态良好时测试、避 免反复吹打
彻底消化、在用酒精固定细胞时 加入终浓度为1.5-3％的小牛血清
一、 流式细胞术的概念
流式细胞术（FCM）就是对在高速 流动的鞘液包括下的细胞、粒子进行分 析和分选的技术，这种细胞或粒子是经 过特异荧光标记的。其特点是测量速度 快，每秒钟能测数千个乃至上万个细胞， 且可进行多参数测量，另一特点是在分 析的同时可把具有指定特征的细胞分离 出来，这就是分选技术。
FCM(Flow Cytomytry 流式细胞术)
流式样品制备过程中常见的问题及解决对策
常见问题
原因
解决对策
细胞密度低 制备过程中细胞损失 增加离心时间、吸弃上清
非特异荧光强 碎片多
细胞聚集
荧光弱
利用流式细胞仪分析细胞存活率细胞周期ROS
利用流式细胞仪分析细胞存活率细胞周期ROS 流式细胞仪（Flow cytometry）是一种广泛应用于生物医学研究领域的技术，可用于分析细胞数量、形态、存活率、细胞周期等多个参数。
下面将详细介绍如何利用流式细胞仪来分析细胞存活率、细胞周期和ROS （Reactive Oxygen Species）。
一、分析细胞存活率细胞存活率是研究细胞毒性或细胞凋亡过程中的重要参数。
在流式细胞仪中，常用细胞染色剂PI（Propidium Iodide）来评估细胞的存活率。
PI是一种能够穿透破损细胞膜并结合DNA的染色剂，可以通过荧光检测器来测量。
具体操作步骤如下：1.培养待测试的细胞，并将细胞备样。
可以使用PBS洗涤一遍，以获得单细胞悬浮液。
2. 使用细胞培养基或PBS将细胞悬浮液稀释至合适的细胞浓度，通常在1×10^6 - 1×10^7 cells/mL之间。
3.加入适量的PI染色剂到细胞悬浮液中，一般终浓度为1-10μg/mL。
4.在黑暗条件下，在4°C冷藏室中孵育15-30分钟，避免光照和温度升高。
5.使用流式细胞仪进行测量。
设置PI染色剂的激发波长和检测通道，根据实验需要选择适当的过滤器。
6. 将细胞悬浮液转移到流式细胞仪的样本管中，进行数据采集和分析。
可以设置门控（gating）策略以排除细胞碎片和颗粒物。
通过分析样本中PI染色的细胞数量，可以计算出细胞的存活率。
二、分析细胞周期细胞周期分析是研究细胞增殖和凋亡机制的一项重要实验。
在流式细胞仪中，通过DNA染色剂染色和分析可以了解细胞的周期分布情况。
具体操作步骤如下：1.培养待测试的细胞，并将细胞备样。
可以使用PBS洗涤一遍，以获得单细胞悬浮液。
2. 使用细胞培养基或PBS将细胞悬浮液稀释至合适的细胞浓度，通常在1×10^6 - 1×10^7 cells/mL之间。
3.用酒精或细胞固定液固定细胞，一般在-20°C的环境中固定20-30分钟。
流式细胞仪分析技术及应用
〔一〕流式细胞仪的根本组成结构：
〔1〕 液流系统 〔2〕 光学系统 〔3〕 数据处理系统
〔1〕液流系统
• 由样本和鞘液组成
• 待测细胞
单个细胞的悬液
荧光染料标记的单抗对其染色
受清洁气体压力
从样品管进入流动室形成样本流
• 鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围， 保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。
能量传递复合染料
用化学法将两种不同激发波长的染料结合在 一起，在488nm激发光照射下，通过一个荧光染 料被激发后产生的发射波长再激发另一荧光染料 产生荧光信号，从而检测到该特定荧光信号。
能量传递复合染料机制
488nm
575nm CY5
PE
CY5
藻红蛋白
CY5
花青苷5
670nm 红色荧光
〔二〕免疫荧光标记
细胞悬液形成液流柱 压电晶体 产生机械振动
流动室振动
液流断裂成液滴
空白液滴 不充电
弃去
含细胞的液滴 充电
偏转落入收集器
〔二〕分选的技术要求
• 分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正 比。
• 分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分率。 • 分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之
流式细胞术的特点
流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及 功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取 多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。
细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量
流式细胞术开展史
• 1930年Caspersson和Thorell开始致力于细胞计数的研究 • 1934年Moldaven最早设想细胞检测自动化，用光电仪记录流过一根毛
FCM(流式细胞术检测)原理及临床应用
流式细胞术(flow cytometry FCM)是利用流式细 胞仪对单个生物颗粒(红细胞、白细胞、各类组织细 胞、血小板、微生物等)以及人工合成微球的物理和 生物学特性进行多参数定量分析，并能对特定细胞 群体加以分选的分析技术。
FCM的工作原理
流式细胞仪组成：
1.液流系统 2.光学系统 3.数据处理系统
双标记或多标记分析：目前使用的流式细胞仪 能用一个激光束激发检测三色甚至四色荧光信 号。检测时需注意荧光补偿。
常用免疫荧光染料组合
荧光染料 FITC+PE
激发波长 （nm）
488
发射波长（nm） 525、575
颜色 绿色、橙色
FITC+PeCy5
488
525、675
绿色、红色
FITC+ECD
488
实体瘤以多倍体居多；
G0 期：DNA 合成静止期 G1 期：DNA 合成前期 S 期： DNA 合成期 G2 期：DNA 合成后期 M 期： 细胞分裂期
DNA 倍体 2N 2N
2N-4N 4N 4N
DNA非2倍体出现是鉴别良性与恶性肿瘤的特异性指 标:
良性肿瘤和正常组织良性增生不出现DNA非2倍体细 胞而恶性肿瘤常可出现异倍体细胞；
过去认为 FCM测定残存白血病细胞不可靠， 因为现用的 McAb不能鉴别正常血细胞与白血 病细胞。虽然至今尚未发现白血病细胞特异抗 原，但近来有人提出根据白血病细胞的以下特 征， FCM检测的敏感度可明显提高
白血病细胞的某些抗原表达量明显高于相应 的正常血细胞
如小儿ALL，其CDl0+细胞的荧光强度可 高达3-4个对数值，而其 CD45则为弱阳性或 阴性。
525、625
流式细胞仪分析技术及应用
流式细胞仪分析技术及应用流式细胞术（FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。
流式细胞仪的发展综合了激光技术、计算机技术、显微荧光光度测定技术、流体喷射技术、分子生物学和免疫学等多门学科的知识。
概述流式细胞仪由液流系统、光学与信号转换测试系统和信号处理及放大的计算机系统三大基本结构组成，可对细胞悬液中的单个细胞或特定细胞或其超微结构进行多参数快速分析。
一、工作原理（了解）基本组成结构1.液流系统由样本和鞘液组成。
待测细胞被制备成单个细胞的悬液，经荧光染料标记的单克隆抗体染色后置入样品管中，在清洁气体压力下进入流动室形成样本流；鞘液是辅助样本流被正常检测的基质液，其主要的作用是包裹在样本流的周围，使其保持处于喷嘴中心位置以保证检测的精确性，同时又防止样本流中细胞靠近喷孔壁而堵塞喷孔。
2.光学系统由激光光源、分光镜、光束成形器、透镜组和光电倍增管组成。
（1）激光光源：现代流式细胞仪采用的多为气冷式氢离子激光器，常用激光束波长为488nm，15mW。
（2）分光镜：作用是反射较长波长的光，通过较短波长的光。
（3）光束成形器：由两个十字交叉放置的圆柱形透镜组成。
（4）透镜组：有3个透镜，作用是将激光和荧光变成平行光，同时除去离散的室内光。
（5）滤片：长通滤片，允许长于设定波长的光通过；短通滤片，允许短于设定波长的光通过；带通滤片，允许一定带宽的波长通过，其他波长的光不能通过。
（6）光电倍增管（PMT）：主要作用是检测散射光和荧光，同时将光学信号转换成电脉冲（数字数据）信号。
3.数据处理系统主要由计算机及其软件组成，进行实验数据的分析、存储、显示，是流式细胞仪组成部件中的重要环节。
二、散射光的测定散射光信号的产生是细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信号，散射光的强弱与细胞的大小、形状、光学同性、胞内颗粒折射有关，与接收散射光的方向也有关。
流式细胞术在免疫学中的应用
流式细胞术在免疫学中的应用
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种利用流式细胞仪对细胞或其他生物颗粒进行快速、多参数、定量分析和分选的技术。
在免疫学领域，流式细胞术具有广泛的应用，为免疫学家提供了一种强大的研究工具。
1. 免疫细胞分型和计数：流式细胞术可以通过标记抗体与细胞表面或内部的特定抗原结合，从而对不同类型的免疫细胞进行分类和计数。
这对于监测免疫系统的状态、研究免疫疾病以及评估免疫治疗效果非常重要。
2. 细胞活化和功能分析：流式细胞术可以检测细胞表面标志物的表达水平，从而评估免疫细胞的活化状态和功能。
例如，通过检测 CD69、CD25 等活化标志物的表达，可以研究T 细胞的活化；通过检测细胞因子的表达，可以分析 Th1、Th2、Th17 等不同类型的 T 细胞亚群。
3. 免疫细胞凋亡检测：流式细胞术可以通过 Annexin V/PI 双染色法等技术，检测免疫细胞的凋亡情况。
这对于研究免疫细胞的生存和死亡调节机制、评估药物对免疫细胞的影响以及探讨免疫相关疾病的发病机制具有重要意义。
4. 免疫细胞分选：流式细胞仪可以根据细胞的物理或生物学特性，将目标细胞从混合细胞群体中分离出来。
这一技术在细胞培养、基因转染、单细胞分析等方面具有重要应用。
5. 高通量筛选：流式细胞术可以同时分析大量样本，实现高通量筛选。
这对于药物筛选、抗体发现以及寻找新的免疫治疗靶点等研究具有重要价值。
总之，流式细胞术在免疫学中的应用非常广泛，为深入了解免疫系统的结构和功能、探索免疫相关疾病的发病机制以及开发新型免疫治疗策略提供了重要的技术支持。
流式细胞术临床应用范围
流式细胞术临床应用范围流式细胞术是一种广泛应用于生物医学领域的高端技术，通过流式细胞仪可以对细胞进行高通量单细胞分析。
随着技术的不断创新和发展，流式细胞术在临床应用中的范围也逐渐扩大，为疾病的诊断、治疗和预防提供了重要的支持和帮助。
一、疾病诊断流式细胞术在临床诊断中的应用范围非常广泛，可以用于各种类型的疾病的确诊和分型。
例如，在血液学领域，流式细胞术可以用于白血病和淋巴瘤等血液系统疾病的诊断与鉴别诊断；在免疫学领域，流式细胞术可以用于自身免疫性疾病的诊断和病情监测。
二、免疫细胞治疗随着免疫细胞治疗技术的不断成熟，流式细胞术在该领域的应用也越来越广泛。
通过流式细胞术可以对患者的免疫细胞进行分选、激活和扩增，用于治疗各种肿瘤和疾病。
例如，CAR-T细胞治疗就是基于流式细胞术的原理开发而来，已经在临床上取得了较好的疗效。
三、药物筛选在药物研发领域，流式细胞术被广泛应用于药物的筛选和评估。
通过流式细胞术可以快速、准确地评估药物对细胞的毒性和活性，为药物研发提供重要的数据支持。
同时，流式细胞术还可以用于研究药物的作用机制和药效评价。
四、疾病预防与流行病学研究流式细胞术在疾病预防和流行病学研究中也发挥着重要作用。
通过流式细胞术可以对疫情中的病原体进行快速检测和鉴定，为疾病的早期诊断和防控提供重要的支持。
此外，流式细胞术还可以用于研究疾病的发病机制和流行规律，为疾病的预防和控制提供科学依据。
综上所述，流式细胞术在临床应用中的范围十分广泛，涉及到疾病诊断、治疗、药物研发、疾病预防和流行病学研究等多个领域。
随着技术的不断进步和应用的深化，相信流式细胞术将在未来发挥更加重要的作用，为人类健康事业作出更大的贡献。
流式细胞仪在造血干细胞生物学研究中的应用
2、基因功能研究：流式细胞术可以与基因敲除技术相结合，用于研究基因在 细胞生长和分化中的作用，这有助于深入了解基因的功能和调控机制。
3、疫苗研发：流式细胞术可以用于研究免疫细胞的活化和分化，这有助于疫 苗的研发和免疫学研究。
应用场景
1、细胞分类：流式细胞仪可通过检测细胞表面标志物或细胞内抗原物质，对 细胞进行分类和亚群分析，有助于揭示细胞在生理和病理状态下的功能和作用。
2、细胞计数：流式细胞仪可快速准确地测定细胞样品中的细胞数量和细胞浓 度，为生物学研究和临床诊断提供依据。
3、DNA/RNA提取：流式细胞仪在结合特异性抗体和其他标记物后，可从细胞 中提取 DNA或 RNA进行基因表达谱分析、突变检测等研究。
流式细胞仪在造血干细胞生物 学研究中的应用
01 引言
03 应用举例
目录
02 介绍流式细胞仪 04 参考内容
引言
造血干细胞是人体造血系统的基础，对于理解血液疾病的发病机制、寻找治疗 策略等方面具有重要意义。流式细胞仪（Flow Cytometry，FCM）是一种在细 胞水平上对生物样品进行高速分析的技术，能够在短时间内获取大量有关细胞 的信息。本次演示将探讨流式细胞仪在造血干细胞生物学研究中的应用，以期 为相关领域的深入研究提供参考。
参考内容
引言
流式细胞仪（Flow Cytometry，FCM）是一种在液流中快速检测细胞特性的技 术。它通过将单个细胞与特异性抗体或其他标记物结合，将细胞的多种特性， 如细胞大小、内部结构、细胞表面标志等转化为光信号，再通过光电检测系统 和计算机数据处理系统进行数据分析和显示。流式细胞仪在生物学研究中具有 广泛的应用价值，为生命科学、医学和生物技术等领域提供了强有力的工具。
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选择不同的单抗及染料可同时测定一个细胞上的 多个不同特征。
线性放大器和对数放大器
高能态电子回基态，释放过剩能量成为光子。 这种能量的转换称为荧光。 激发光谱：能够激发荧光物质的波长范围。 发射光谱：荧光物质的发射波长范围。由于更 多的能量消耗在吸收转换而不是荧光转换中，所 以发射光波长要高于激发光波长。 光源的谱线愈接近被激发物质的激发光谱的峰 值，所产生的荧光信号愈强。 流式细胞仪大多采用氩离子激光器，因为488nm 的激光器能够激发一种以上的荧光。
（二）双参数直方图
双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测 量细胞的两个测量参数，根据这两个参数 就可以确定细胞在图上的表达位置。
双参数信号通常采用对数信号，最常用的 是点密图。在图中，每个点代表一个细胞， 点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光 强度的颗粒数量的多少。
1、双参数直方图点图
红 色 荧 光 强 度
流式细胞仪常检测的细胞特性
细胞组成 细胞功能
大小 粒度 DNA, RNA含量 蛋白质含量
钙离子, PH值, 膜电位
细胞表面/胞浆/核--特异 性抗原 细胞活性 胞内细胞因子 激素结合位点
酶活性
一、工作原理
采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单
色性与激发效率；
利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技
术，保证检测的灵敏度和特异性；
用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞
的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测
速度与统计分析精确性。
1.流式细胞仪的基本结构
（1） 液流系统
（2） 光学系统
（3） 数据处理系统
（1）液流系统
由样本和鞘液组成
待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料 标记的单抗对其染色 受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流 鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作 用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于 喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。
（一）分选基本原理
细胞悬液形成液流柱
压电晶体
产生机械振动
流动室振动 液流断裂成液滴
空白液滴
含细胞的液滴 充电 偏转落入收集器
不充电 弃去
（二）分选的技术要求
分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬
液中细胞的含量成正比。
分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞
的百分率。
分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过
FS与SS信号通过 计算机处理，得到 FS-SS图，由此可仅 用散射光信号对未染 色的活细胞进行分析 或分选---血细胞分 类的基本原理，但不 能分析表面分子。
中性粒细胞 单核细胞
淋巴细胞
光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群
三、荧光测量
荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受 激发后产生，发射荧光波长与激发光波长不同。
一、 参数
FSC：反映颗粒的大小
SSC：反映颗粒的内部结构复杂程度
FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少
二、数据显示方式
直分析方图 单参数直方图 双参数直方图:点图 二维等高图 假三维等高图 三参数直方图 多参数分析 设门分析:REGION和GATE设置
（一）单参数直方图
由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数 (COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的 颗粒数量的多少。
流式细胞仪分析技术及应用
第一节 概述 一、工作原理 二、散射光的测定 三、荧光测量 四、细胞分选原理 第二节 数据的显示与分析 一、参数 二、数据显示方式 三、设门分析技术 第三节 流式细胞仪免疫分析的技术要求 一、免疫检测样品制备 二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色 三、免疫胶乳颗粒的应用 四、流式细胞免疫学技术的质量控制
测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。
分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细
胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。 与分选速度成反比。
第二节 数据的显示与分析
参数：FS,SS,FL 数据显示方式 （单参数直方图 、双参 数散点图 、二维等高图 、假三维等高 图 、三参数散点图 ） 设门分析技术
第四节 流式细胞术在免疫学检查中的应用 一、淋巴细胞及其亚群的分析 二、淋巴细胞功能分析 三、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型 四、肿瘤耐药相关蛋白分析 五、AIDS病检测中的应用 六、自身免疫性疾病相关HLA抗原分析 七、移植免疫中的应用 第五节 流式细胞术在细胞凋亡研究中的应用
前言
流式细胞术：七十年代发展起来的,• 计算机技术、 集 激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一 体, 同时具有分析和分选细胞功能。 测细胞大小、内部颗粒性状, 检测细胞表面和细胞 浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,对群体细胞在单细 胞水平上进行分析, 短时间内检测分析大量细胞; 分 类收集某一亚群细胞。 常用的由美国生产:BECKMAN- COULTER公司和 Becton-Dickinson公司(B-D公司)。流式细胞仪主要 有两型:临床型（小型机、台式机）和综合型（大型 机、分析型）。
液流系统示意图
喷嘴 鞘液
Fluorescence signals
Focused laser beam
FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
液流系统
作用：依次传送待测样本中的细胞到激光照 射区，理想状态是把细胞传送到激光束的中 心。且在特定时间内，只有一个细胞或粒子 通过激光束。 必须在流动室内把细胞注入鞘液流。流动室 是液流系统的核心部件，台式机中流动室称 为样品槽，大型机称之为喷嘴。 在流动室内细胞液柱聚焦于鞘液中心，细胞 在此与激光相交。
三、设门分析技术
Gate设置：指在某一张选定参数的直
方图上，根据该图的细胞群分布选定
其中想要分析的特定细胞群，并要求
该样本所有其他参数组合的直方图只
体现这群细胞的分布情况。
根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、 多边形门、任意形状门和十字门。
Laser
FALS Sensor
侧向散射光（side scatter, SSC）：激光束 照射细胞时，光以90°角散射的讯号。用于 检测细胞内部结构属性。 SSC与被测 细胞的颗粒密度 和内部结构有关， 对细胞膜、胞质、 核膜的折射率更 为敏感。
侧向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
•主要分为前向散射光和侧向散射光。
前向散射光（forward scatter, FSC）：激光束照 射细胞时，光以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前 方散射的讯号。用于检测细胞等粒子的表面属性， 信号强弱与细胞体积大小成正比。
FSC不受细胞 荧光染色的影响， 常用于免疫表型分 析的信号处理。
前向散射光示意图
（2）光学系统
激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长 波长 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 透镜组：形成平行光，除去室内光 滤片：长通、短通、带通 光电倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）
光学系统示意图
Flow Tip
SS and FL Detector
流式细胞术的特点
分析速度：一般每秒检测1000～ 5000个细胞,大 型机可达每秒上万个细胞。
荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600 个荧光分子,两个细胞间荧光差＞5%即可区分。 前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射 （FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪 能够测量到0.2μm～０.5μm。
绿色荧光强度
A B C
淋巴细胞 单核细胞 中性粒细胞
双参数直方图点图
2. 二维等高图
由类似地图上的等高线组成，其本质也是 双参数直方图。 等高图上每一条连续曲线上具有相同的细 胞相对或绝对数，即“等高”。 曲线层次越高(越里面的线) 所代表的细胞 数愈多。 等高线越密集则表示细胞数变化率越大。
二维等高图
流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式 细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对 单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分 选的新技术。
流式细胞术的特点
能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功 能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助， 从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分 析或纯化分选。
3. 假三维等高图
是利用计算机技术对二维等高图的一种视觉直观的表现方 法。它把原二维图中的隐座标—细胞数同时显现，但参数维 图可以通过旋转、倾斜等操作，以便多方位的观察“山峰” 和“谷地”的结构和细节，有助于对数据进行分析。
（三）三参数直方图
（四）流式细胞仪的多参数分析
多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激 发光激发后，得到的荧光信号和散射光信 号可根据需要进行组合分析。
FITC、PE、PerCP、APC 染料的激发光谱
2013-7-22
FITC的发射光波长 530nm，PE发射光波长 570nm。其发射 光波长足够远，可使用不同的检测器来检测。被检测到的 荧光信号数量与粒子中标记上的分子数量成正比。
四、细胞分选原理
通过流式细胞仪进行细胞分选 主要是在对具有某种特征的细胞需 进一步培养和研究时进行的。
细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、 灵敏、定量
流式细胞术的特点
高速度：对细胞的标准分析速度达到了2x 104个/min，最大分析速度达到6x 104个/min。 高灵敏度：一般以能检测到单个微球上最少 标记有异硫氢酸荧光素(FTTC)或藻红蛋白 ((PE)荧光分子数目来表示。 高准确度：可检测两个细胞间细胞成分仅相 差1%左右的细胞。