流式细胞仪结果分析
sybergreen流式细胞结果解读
Sybergreen流式细胞仪是一种用于检测细胞遗传学和细胞分化的先进工具，其结果解读需要结合实验的具体情况以及相关知识和技能。
首先，Sybergreen流式细胞仪主要用于检测细胞内Syber Green I染料标记的DNA的荧光强度，从而确定细胞的DNA倍体和细胞类型。
在正常的情况下，二倍体细胞和单倍体细胞的荧光强度会有明显的差异，而异常倍体细胞的荧光强度可能会下降。
因此，Sybergreen流式细胞仪结果通常会显示不同倍体细胞的荧光强度分布图。
其次，对于结果的分析，需要注意以下几点：
1. 阳性细胞数量：观察荧光强度分布图中的阳性细胞数量，如果数量较多，则说明该指标在某些细胞中存在异常。
2. 倍体类型：观察荧光强度分布图中的各倍体类型的比例，如果某一种异常倍体细胞的荧光强度明显高于其他倍体类型，则说明该异常倍体细胞的数量较多。
3. 阳性细胞的形态：在观察异常细胞时，需要注意阳性细胞的形态是否与正常细胞存在差异。
异常细胞的数量增多时，需要观察是否有一些特殊形态的细胞出现。
在具体的应用中，Sybergreen流式细胞仪可以用于检测肿瘤细胞的DNA倍体和增殖活性，从而判断肿瘤的恶性程度、患者的预后以及治疗效果等。
同时，该仪器还可以用于干细胞研究、组织分化研究等领域。
但是需要注意的是，在解读Sybergreen流式细胞仪结果时，需要结合患者的临床资料、病理诊断、免疫组化染色以及其他检测结果等进行综合分析。
综上所述，解读Sybergreen流式细胞仪结果需要具备一定的细胞遗传学和流式细胞仪方面的知识，并结合患者的具体情况进行分析。
只有在充分理解实验数据的基础上，才能准确地评估病情、制定治疗方案和评估治疗效果。
流式结果分析
流式检测细胞凋亡
常用检测试剂盒：FITC-PI(常见细胞) PE-ADD（绿色荧光的细胞）
正常细胞，膜电位正常时，JC-1通过线粒体膜极性进入 线粒体内，并因浓度升高而形成发射红色荧光的多聚体，而 凋亡细胞，线粒体跨膜电位去极化，JC-1从线粒体内释放， 浓度降低，逆转为发射绿色荧光的单体形式。故而可以通过 检测绿色和红色荧光来定性(细胞群的偏移）定量（细胞群 的荧光强度）的检测线粒体膜电位的变化
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
流式原理
流式原理
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流式结果分析
流式原理
流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束 ，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射 下，产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二 极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角 度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光 信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和 带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。
流式检测细胞周期
表面标志物、蛋白等
将所要检测的蛋白用带有荧光标记的一抗 孵育后，蛋白就会带上相应的荧光，之后用 流式检测荧光值，便可得到表达情况
表面标志物——以CD44为例
线粒体膜电位的检测
线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，线粒体跨膜电 位的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事 件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出 现之前，一旦线粒体DYmt崩溃，则细胞凋亡不可逆转。
流式细胞仪及流式细胞术
流式细胞仪及流式细胞术流式细胞仪技术流式细胞仪技术，主要是测量群体中单个细胞经适当染色后其成分所发出的散射光和荧光，经染色的细胞在悬液中以单行流过高强度光源的焦点，当每个细胞经过焦点时，发出一束散射光/或荧光。
它们经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器(光电倍增管或一个固态装置)，光检测器把散射光定量转化成电信号，经数字转换器进行数字化后而成整数，然后进行电子存储，以后数据可以调出显示和进行分析。
其优点如下：1、具有操作简便，只要将染色的单个细胞推入仪器中，就会得出数据。
2、具有较高的灵敏度及测定速度，而且每次可测出许多数据，一般情况下，每秒可测5000个细胞，能迅速分析和记数大量细胞，并能准确统计群体中荧光标记细胞的比例。
3、应用广泛，即可用于测定细胞活力、繁殖周期和细胞定型分析，也可区别死亡细胞、分裂细胞和静止细胞群，既可测定DNA和RNA、测凋亡峰，又可测蛋白含量，特别是胞浆蛋白。
基本流程原理：1、将待测细胞染色后制成单细胞悬液，用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定的角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。
2、流式细胞仪通常以激光作为发光源。
经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。
这两种信号同时被前向光电二极管和90度方向的光电倍增管接收。
散射光不依赖任何细胞样品的制备技术，被称为细胞的物理参数或固有参数，散射光有包括前向角散射和侧向叫散射，前向角散射与被测细胞直径的平方密切相关，侧向角散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信号。
荧光信号也有两种，一种是细胞自身在激光照射下发出的微弱荧光信号，另一种是经过特异荧光素标记后的细胞受激发照射后得到的荧光信号。
流式细胞术分析PMA诱导THP1分化为巨噬细胞的表型特征
流式细胞术分析PMA诱导THP1分化为巨噬细胞的表型特征一、本文概述流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种在液流中快速分析单个细胞的多参数特性的强大技术。
该技术通过标记特异性抗体与细胞表面或内部抗原的结合，结合流式细胞仪的高通量分析能力，使我们能够精确测量细胞群体的表型特征。
在生物医学研究中，流式细胞术广泛应用于细胞分化、细胞周期、细胞凋亡、信号转导等多个领域。
本文旨在利用流式细胞术分析佛波酯（Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）诱导人急性单核细胞白血病细胞系THP-1分化为巨噬细胞的表型特征。
我们将通过流式细胞术检测分化过程中细胞表面标志物的表达变化，如CDCD68等，以及细胞内分子如肿瘤坏死因子TNF-α、白介素IL-1β等的表达情况，从而全面揭示PMA诱导THP-1细胞向巨噬细胞分化的分子机制。
通过本文的研究，我们期望能够为深入理解巨噬细胞分化过程中的分子事件提供新的视角，并为开发针对巨噬细胞相关疾病的治疗策略提供理论依据。
本文还将探讨流式细胞术在细胞分化研究中的应用价值，以期为生物医学领域的研究人员提供有益的参考。
二、材料与方法1 细胞系：人单核细胞系THP-1，购自美国ATCC（American Type Culture Collection）。
2 试剂：佛波酯（Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA），购自Sigma-Aldrich公司；RPMI 1640培养基、胎牛血清（FBS）、青霉素/链霉素双抗，购自Gibco公司；流式细胞术抗体，包括但不限于CDCDHLA-DR等，购自BD Biosciences或eBioscience公司。
3 仪器：流式细胞仪（如FACS Canto II，BD Biosciences）；二氧化碳培养箱；离心机；倒置显微镜。
1 细胞培养：THP-1细胞在含有10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素双抗的RPMI 1640培养基中，于37℃、5% CO2的条件下培养。
流式细胞仪结果分析
双 参 数 散 点 图 分 析
散点图
等高线图
密度图
FCM的主要测定指标：FSC, SSC, FL1, FL2, FL3 (FL4)
FCM标记方法
单标：一种单抗/tube--FL1, FSC, SSC（三参数）
双标：两种单抗/tube--FL1, FL2, FSC, SSC（四参数）
三/四标：三种单抗/tube、四种单抗/tube--FL1-FL3/4, FSC, SSC
……
1. 上机检测
单色/双色/多色样本 参数调节
电压、阈值、设门、补偿
2. 细胞分选 3. 细胞表面和胞内标志检测 4. 细胞周期(PI单染) 5. 细胞凋亡（Annexin V与PI双染）
举例：FACS Calibur可检测FL1-4四个通道的4个颜色
检测器组 所需探测器 （激光器） （PMT）位置
流式细胞仪分析细胞周期
依据细胞DNA含量（横坐标）： G1期：DNA复制还没开始，
也 是 DNA 含 量 最 少 的 ， 即 流 式 检测结果图的第一个峰；
S期：DNA开始复制，到完 成 复 制 ， 是 一 个 一 倍 DNA 到 二 倍 DNA 的 过 程 ， 在 流 式 结 果 图
中显示期跨度特别大（第二个 不高但很宽的峰）；
“设门”就是确定阳性细胞群，去除散点部分。
指在细胞分布图中，根据该图的细胞群分布选定其中
想要分析的特定细胞群（细胞基本来自于同一状态，有数据显示
1. 直方图（Histogram）
可比较性）。通过“设门”得到不同的区域，从而对 其中的细胞进行单参数或多参数分析。
设门是流式细胞仪分析中的一种重要技术，只有
颗粒杂质、气泡 对检测的影响
流式细胞术的原理与应用-FACS-aria
信号检测
FALS Sensor
Freq
散射光信号 （FSC、SSC）： 物理参数
Fluorescence
Fluorescence detector (PMT3, PMT4 etc.)
荧光信号： 非特异荧光 + 特异荧 光
26
散射光信号
前向角散射光信号（FSC ，Forward Scatter ）：与激光方向同轴 侧向角散射光信号（SSC， Side Scatter ）：与激光束垂直
48
细胞膜检测： Annexin V/PI双染色法
死亡和晚 期凋亡
活细胞： annexinV-/PI早期凋亡： annexinV+/PI死亡和晚期凋亡： annexinV+/PI+
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活细胞
早期凋亡
新功能基因CB12质粒转染的293T细胞明显促 进细胞凋亡 FL1:FITC-annexinV, FL2:PI
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信号的显示方式
单参数直方图（Histogram） 双参数：
二维点图(Dot Plot) 等高线图(Contour Plot) 二维密度图(Density Plot)
三维图(3D Plot)
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单参数直方图（Histogram）
阴性区
阴性 对照
横坐标：荧光信号的 强弱 (相对强度)，反 映了细胞抗原的表达 含量
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前向散射光信号(FSC)
前向散射光信号（FSC ）：与细胞相对大小和体积相关
28
侧向散射光信号（SSC)
侧向角散射光（SSC） :代表细胞内部的精细结构变化，对胞膜、 胞质、核膜变化更敏感
流式细胞仪结果分析
流式细胞仪结果分析一、获取数据在进行流式细胞仪结果分析之前，首先需要获取实验数据。
流式细胞仪会输出每个样本细胞的荧光强度、散射性质等参数。
这些参数可以代表细胞的表型特征或者亚细胞结构。
根据实验的需要，可以选择一种或多种指标进行数据分析。
二、数据清洗和预处理由于实验过程中可能会受到一些随机因素的干扰，比如机器灵敏度、噪声等，得到的数据可能存在一些异常值。
因此，在进行数据分析之前，首先需要对数据进行清洗和预处理，以减少这些异常值的干扰。
数据清洗可以通过以下几种方法进行：1.去除非细胞事件：流式细胞仪在采集数据时可能会采集到一些非细胞事件，比如细胞碎片、空白颗粒等，可以通过设置或者后续数据处理来去除这些非细胞事件。
2.去除离群值：根据实验的需要和数据的分布情况，可以使用统计学方法或者软件工具来判断和去除离群值。
3.数据归一化：如果实验中使用了多个荧光探针，不同探针之间的信号强度可能有差异。
可以通过归一化处理来消除这种差异，以确保数据的可比性。
三、统计分析数据清洗和预处理之后，可以进行统计分析来描述和解析数据。
流式细胞仪的数据通常是多维的，可以使用多种统计分析方法来从不同角度揭示数据的特点和规律。
1.基本统计分析：包括均值、标准差、中位数等指标，可以帮助了解数据的集中趋势和离散程度。
2.相关性分析：通过计算各个参数之间的相关系数，可以研究不同指标之间的关系。
例如，可以使用皮尔逊相关系数来衡量两个参数之间的线性相关性。
3.差异分析：比较不同样本或不同组的数据之间的差异。
常用的差异分析方法有t检验、方差分析等。
四、数据可视化为了更好地理解和传达数据的结果，可以使用数据可视化技术将数据以图表、图像等形式展示出来。
常用的数据可视化方法包括散点图、条形图、箱线图等。
通过数据可视化，可以帮助研究者直观地观察数据的分布情况、群体几何形状和特征变化趋势等。
五、结果解读在进行流式细胞仪结果分析时，需要根据实验目的和样本特性进行结果的解读。
流式细胞凋亡结果解读
流式细胞凋亡结果解读
流式细胞凋亡结果解读是通过流式细胞术来评估细胞中的凋亡程度。
凋亡是一种正常的细胞死亡形式，它在维持机体内细胞平衡中起着重要的调节作用。
在流式细胞凋亡结果解读中，我们通常会关注两个参数：细胞凋亡率和凋亡程度。
细胞凋亡率是指在一定细胞总数中凋亡细胞数量所占的比例。
常用的流式细胞仪会使用特定的荧光探针，如Annexin V和PI，以区分细胞的生死状态。
Annexin V可以结合在凋亡细胞表面的磷脂，而PI则能够进入已损伤的细胞。
通过流式细胞仪的检测和分析，我们可以确定细胞的凋亡率。
凋亡程度是指凋亡细胞中发生的具体变化。
在凋亡过程中，细胞会发生DNA 断裂和染色质凝固，体积也会减小。
通过流式细胞仪可以进一步评估这些变化。
例如，可以使用荧光染料如Hoechst 33342染色核酸，以观察DNA断裂。
同时，还可以使用其他荧光探针或标记特定蛋白来检测凋亡相关的分子信号途径。
通过准确评估细胞凋亡率和凋亡程度，我们可以了解细胞对于各种刺激的响应和机体内细胞死亡的调节情况。
这对于研究疾病的发生机制、药物研发以及评估治疗效果都具有重要意义。
总之，流式细胞凋亡结果解读是通过流式细胞术来评估细胞中的凋亡程度和凋亡细胞比例。
这种评估可以为我们研究细胞死亡的机制和判断治疗效果提供重要的参考。
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双 参 数 散 点 图 分 析
散点图
等高线图
密度图
FCM的主要测定指标：FSC, SSC, FL1, FL2, FL3 (FL4)
FCM标记方法
单标：一种单抗/tube--FL1, FSC, SSC（三参数）
双标：两种单抗/tube--FL1, FL2, FSC, SSC（四参数）
三/四标：三种单抗/tube、四种单抗/tube--FL1-FL3/4, FSC, SSC
颗粒杂质、气泡 对检测的影响
FSC：反映细胞相对大小及其表面积
外周全血细胞散射光双参数点图
SSC：反映颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性
（红细胞溶解后）
离线设门
在 线 设 门
对血液中淋巴细胞设门（R1）分析其免疫表型
B T
细胞分选
细胞表面标志物检测
从增殖的角度分类高等动物细胞
①连续分裂细胞，在细胞周期中连续运转因而又称为周期细胞，如表皮生发层细胞、 部分骨髓细胞。
“设门”就是确定阳性细胞群，去除散点部分。
指在细胞分布图中，根据该图的细胞群分布选定其中
想要分析的特定细胞群（细胞基本处于同一状态，有
数据显示
1. 直方图（Histogram）
可比较性）。通过“设门”得到不同的区域，从而对 其中的细胞进行单参数或多参数分析。
设门是流式细胞仪分析中的一种重要技术，只有
②休眠细胞暂不分裂，但在适当的刺激下可重新进入细胞周期，称G0期细胞，如淋 巴细胞、肝、肾细胞等。
③不分裂细胞，指不可逆地脱离细胞周期，不再分裂的细胞，又称终端细胞，如神 经、肌肉、多形核细胞等等。
不同类型细胞的G1长短不同，是造成细胞周期差异的主要原因。细胞周期的时间长 短与物种的细胞类型有关。
G1 期 (gap1) ； S 期 (synthesis phase) ； G2 期 (gap2) ； M 期 又 称 D 期 (mitosis or division)
特点：检测速度快，分析样本量大；可同时分析单个细胞的多种特征；强大的分 选功能。
所用流式细胞仪（Flow Cytometer）是集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、 电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。 有分析型流式细胞仪和分选型流式细胞仪。
流式细胞仪的检测范围
FL1
488nm蓝色激光
FL4
带通/长通透镜 530/30 585/42 670 LP
661/16
适用染料
FITC PE, PI PerCP, PerCP-Cy5.5, PE-Cy7
APC
搭配荧光素原则
1. 不同型号的流式细胞仪的同样的一个通道检测荧光素的能力是不一样的。 2. 每个通道只能选择1种荧光素。 3. 各个通道之间的荧光素可以随意搭配
2. 二维点图（Dot Plot）
通过最佳的设门方式，才能准确地获取和分析。包括
3. 等高线图（Contour Plot） 在线设门和离线设门。
4. 密度图（Density） 5. 三维图（3D Plot）等
补偿对照（双色或多色分析中，荧光素发射光谱 重叠时）荧光补偿是指在流式细胞多色分析中，纠正
荧光素发射光谱重叠的过程，即从一个被检测的荧光
流式抗体荧光标记搭配
将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，区别经这些特殊处理发生选 择性凋亡的淋巴细胞亚型以及活细胞的分类。
由流式细胞仪能检测多少个通道（由有多少激光以及每激光的功能决定的）、需 要同时检测多少个指标、厂家的抗体有多少种荧光标记等决定。
不推荐APC和PE-Cy5一起使用，上流式以后，容易导致补偿过度。 推荐使用Alex Fluro488和Alex Fluro647。因为这些荧光非常明亮，对激光非常 稳定，适合流式细胞仪的光谱性质，对PH值不敏感，具有水溶性。此外，他们联合使 用时发射光谱存在巨大差异，无需补偿。
分析时，使用FL2-w和FL2-A显示。 FL2-A是指荧光峰面积，反映了细胞DNA含量 （前提是用Rnase处理去除RNA）； , FL2-H是指荧光峰的脉冲高度；FL2-W是指检测荧 光峰的脉冲宽度，该值通常在做细胞周期分析时应用, 用于去除粘连细胞。
流式测细胞周期，一般分为G0/G1,S,G2/M期三部份，如果有凋亡，在G0/G1期前面有个 凋亡峰(也称sub-G0期)，而如果分析时细胞窗口没设置好，可能在最前面还有细胞碎片
信号中去除任何其他的干扰荧光信号。
使用单种荧光素标记的单克隆抗体和其余荧光素
对应的同型对照抗体分别进行染色。
实验样本：自发荧光＋非特异荧光＋特异荧光
同型对照：自发荧光＋非特异荧光
单参数直方图分析
荧光峰的高低即在纵轴对 应的高度反映了具有此种 荧光强度的细胞在样本中 所占比例的相对多少，而 非绝对数目。
细胞结构
❖ 细胞大小 ❖ 细胞颗粒度 ❖ 细胞表面积 ❖ 核浆比例 ❖ DNA含量与细胞周期 ❖ RNA含量 ❖ 蛋白质含量 ❖ ……
细胞功能
❖ 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原 ❖ 细胞活性 ❖ 细胞内/外的细胞因子 ❖ 激素结合位点、细胞受体 ❖ 蛋白磷酸化 ❖ pH值 ❖ 钙离子浓度 ❖ 细胞膜电位、线粒体膜电位
流式细胞仪分析细胞周期
依据细胞DNA含量（横坐标）： G1期：DNA复制还没开始，
也 是 DNA 含 量 最 少 的 ， 即 流 式 检测结果图的第一个峰；
S期：DNA开始复制，到完 成 复 制 ， 是 一 个 一 倍 DNA 到 二 倍 DNA 的 过 程 ， 在 流 式 结 果 图
……
1. 上机检测
单色/双色/多色样本 参数调节
电压、阈值、设门、补偿
2. 细胞分选 3. 细胞表面和胞内标志检测 4. 细胞周期(PI单染) 5. 细胞凋亡（Annexin V与PI双染）
举例：FACS Calibur可检测FL1-4四个通道的4个颜色
检测器组 所需探测器 （激光器） （PMT）位置
流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）定义
流式细胞术是一种可以快速、准确、客观，并且能够同时检测快速直线流动状态 中的单个细胞的多项物理及生物学特性，加以分析定量的技术，同时可以对特定群体 加以分选。
研究对象为各种细胞（如外周血，骨髓，细针穿刺，灌洗液，实体组织，悬浮或 贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球等。最终获得单细胞悬液（天然，机械研 磨/消化）。