利用流式细胞术分析细胞周期时相(精)
流式细胞术检测细胞周期
流式细胞术检测细胞周期流式细胞术在许多题中常用到，但对其结果的分析却不是很清楚。
在此收集点相关资料并以实验中的一张图片为例，大家共同学习。
图中白色箭头及尾部G1,G2,S是我用PS加上去的，方便讨论。
首先来认识下图：1.纵坐标Cell Number：即计数到的有效细胞数；2.横坐标DNA Content：即DNA量，为什么用DNA量来区别各周期我们等下再讲；3.G1、G2、S三期在上图已经用箭头标示；4.右侧数字含义：Mean G1=195.4即G1期DNA含量平均值为195.4；%G1=73.6即G1期细胞数占总数的73.6%；以此类推……下面从细胞周期的角度看各参数的意义：1、细胞周期指由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，所需的时间叫细胞周期时间。
可分为四个阶段（见图）：①G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间；②S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期；③G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间；④M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。
2、从增殖的角度来看，可将高等动物的细胞分为三类：①连续分裂细胞，在细胞周期中连续运转因而又称为周期细胞，如表皮生发层细胞、部分骨髓细胞。
②休眠细胞暂不分裂，但在适当的刺激下可重新进入细胞周期，称G0期细胞，如淋巴细胞、肝、肾细胞等。
③不分裂细胞，指不可逆地脱离细胞周期，不再分裂的细胞，又称终端细胞，如神经、肌肉、多形核细胞等等。
细胞周期的时间长短与物种的细胞类型有关，如：小鼠十二指肠上皮细胞的周期为10小时，人类胃上皮细胞24小时，骨髓细胞18小时，培养的人了成纤维细胞18小时，CHO细胞14小时，HeLa细胞21小时。
不同类型细胞的G1长短不同，是造成细胞周期差异的主要原因。
3、流式细胞结果图各参数的意义：前面讲过，常用的流式细胞术分析细胞周期的方法是依据细胞DNA含量（横坐标）来分析的：G1期：细胞DNA复制还没有开始，也是DNA含量最少的，即流式检测结果图的第一个峰；S 期：细胞开始复制，到完成复制，是一个一倍DNA到二倍DNA的过程，在流式结果图中显示期跨度特别大（第二个不高但很宽的峰）；G2期：DNA复制完成至分裂的一段时间，此时细胞内含二倍DNA，在流式结果图中的第二个峰；M期：细胞分裂过程，此时细胞内也是二倍DNA，用DNA含量的方法是无法与G2期分开，所以有第三峰明显升高时报告：G2/M期阻滞。
利用流式细胞术分析细胞周期时相
细胞内的DNA含量随细胞周期进程发生周期性变化，如G0/G1期的DNA含量为2C，而G2期的DNA含量是4C。 仪器：流式细胞仪，细胞培养设备，离心机，水浴，冰箱 了解流式细胞术在细胞生物学研究中的应用
掌 握 用 流 式 细 胞 仪 测 量 细 胞 群 体 DNA 仪器：流式细胞仪，细胞培养设备，离心机，水浴，冰箱
膜封口。4℃固定过夜（可长至2周）
• 800rpm 15min收集固定细胞，PBS洗2次 • 用0.4mL PBS重悬细胞并转至Tube中轻轻吹打（防止细胞破碎） • 加RNase-A约3µL至终浓度约为50µg/mL ，37℃水浴消化30 min； • 加PI约50µL至终浓度约为65µg/mL ，在冰浴中避光染色30 min。 • 用300目（孔径40~50微米）尼龙网过滤，上机检测 • 样品分析测定及打印
了解流式细胞术在细胞生物学研究中的应用 实验目 的 通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白 质、抗原等物理及化学特征。 实 验 原理
取对数生长期细流胞，式倒细去培胞养液仪，的胰酶工适度作消原化细理胞，是用将培养待液吹测打细，8胞00rp放m ,入离心样15品mi管n去上中清，。 在气体的压力下 实用验300利目进用（流孔入式径充细40胞~满5术0微分鞘米析液）细尼胞的龙周网期流过时动滤相，室上机。检在测 鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷 加RNas出e-A，约3形µL至成终细浓度胞约为柱50。µg/m通L ，过37对℃水流浴消动化液30 m体in；中排列成单列的细胞进行逐个检测，得
流式细胞术分析细胞周期时相 流式细胞术在科学研究中的应用 了解流式细胞术在细胞生物学研究中的应用 仪器：流式细胞仪，细胞培养设备，离心机，水浴，冰箱
流式细胞术测定细胞周期
流式细胞术测定细胞周期一、实验原理碘化丙锭（PI）可以与细胞内DNA和RNA结合,采用RNA抑制剂将RNA 消化后,通过流式细胞术检测到的与DNA 结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA 含量的多少。
由于细胞周期各时相的DNA 含量不同,通常正常细胞的G1/G0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N),而G2/M期具有四倍体细胞的DNA 含量(4N),而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。
因此,通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时,可以将细胞周期各时相区分为G1/G0期,S期和G2/M 期,并可通过Multicycle软件计算各时相的百分率。
值得注意的是, PI不能通过细胞膜完整的细胞(如活细胞和早期凋亡细胞) ,在标本制备时,必须先用乙醇或其他破膜剂增强细胞膜的通透性,才能使PI进入细胞内与细胞内的核酸结合。
乙醇通常为终浓度为70%的冷乙醇。
二、实验准备1、试剂胰酶、PBS、纯乙醇（4℃）、RNase A、Triton X-1002、主要器材300目尼龙过滤网三、实验步骤1、每个样品细胞数不得少于100万。
2、胰酶消化，收集细胞（贴壁细胞）或1000rpm离心5分钟直接收集细胞（悬浮细胞）。
3、4℃ PBS洗一次，将细胞重悬于0.3ml 4℃ PBS，加入0.7ml 4℃的纯乙醇，将枪头伸入液面下，轻轻打入乙醇，轻柔混匀两次，4℃固定过夜。
4、1000rpm离心5分钟，去上清，加入染色缓冲液PI染色缓冲液：50 μg/ml PI0.1 mg/ml RNase A0.05% Triton X-100总体积1ml/样品，37℃孵育40分钟。
5、1000rpm 离心5分钟，小心去除上清，加入1ml PBS，轻柔混匀，300目过滤，上机检测。
流式细胞仪细胞周期图详解
1
流式细胞术检测细胞周期
1. 纵坐标Cell Number：即计数到的有效细胞数；
2. 横坐标DNA Content：即DNA量，为什么用DNA量来区别各周期
3. G1、G2、S三期在上图已经用箭头标示；
4. 右侧数字含义：Mean G1=19
5.4即G1期DNA含量平均值为195.4；%G1=73.6即G1期细胞数占总数的73.6%；
①G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间；
② S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期；
②G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时
间；④ M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。
③
3、流式细胞结果图各参数的意义：
前面讲过，常用的流式细胞术分析细胞周期的方法是依据细胞DNA 含量（横坐标）来分析的：
G1期：细胞DNA复制还没有开始，也是DNA含量最少的，即流式检测结果图的第一个峰；
S 期：细胞开始复制，到完成复制，是一个一倍DNA到二倍DNA 的过程，在流式结果图中显示期跨度特别大（第二个不高但很宽的峰）；
G2期：DNA复制完成至分裂的一段时间，此时细胞内含二倍DNA，在流式结果图中的第二个峰；
M期：细胞分裂过程，此时细胞内也是二倍DNA，用DNA含量的方法是无法与G2期分开，所以有第三峰明显升高时报告：G2/M期阻滞。
流式细胞术检测细胞周期的原理及技术流程
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流式细胞术检测细胞周期的原理及技术流程
流式细胞术检测细胞周期的原理及技术流程哎呀，这可是个不简单的活儿啊！今天我们就要聊聊流式细胞术检测细胞周期的原理及技术流程。
话说这个方法可是科学家们研究细胞生长和分裂的重要工具呢，那咱们就好好聊聊吧！咱们得明白什么是细胞周期。
简单来说，就是细胞从一个生命周期阶段到另一个阶段的过程。
就像人一样，从出生到长大再到老去，每个阶段都有不同的特点和任务。
而细胞也是这样，它们也有自己的生命周期，从分裂开始，到分化成不同的细胞类型，再到死亡或修复损伤。
如何知道这些细胞在什么时候开始分裂、什么时候结束呢？这就需要用到流式细胞术了。
流式细胞术的原理其实很简单，就是通过激光或其他光源对细胞进行照射，然后利用特殊的摄像头捕捉不同颜色的荧光染料标记的细胞。
这些荧光染料会因为细胞内部的某些分子而发光，所以我们可以通过观察荧光的颜色和强度来判断细胞的状态和位置。
咱们就来看看流式细胞术的技术流程吧。
第一步，准备工作。
先要把待检测的细胞样本准备好，然后把它们稀释到一定浓度，这样可以让更多的地方都能看到荧光信号。
接着，要把样品放到流式细胞仪上，这里有一个小技巧：要尽量让样品均匀分布，这样才能保证检测结果的准确性哦！第二步，激光照射。
这时候要用到激光器或者其他光源对样品进行照射。
记住啊，这个过程一定要快，否则荧光信号可能会减弱或者消失。
不过不用担心，现在的流式细胞仪都设计得很聪明，能够自动调整激光功率和时间长度，以获得最佳的检测效果。
第三步，数据采集。
照射完成后，流式细胞仪就会自动记录下每个荧光信号的位置、强度和持续时间等信息。
这些数据会被传输到电脑上进行分析和处理。
别看这步骤听起来简单，实际上需要非常高的精度和速度才能做到哦！第四步，数据分析。
这一步主要是通过软件对收集到的数据进行分析和比对，找出其中的规律和异常情况。
比如说，我们可以通过观察不同细胞的荧光信号强度来判断它们的生命周期阶段；也可以通过比较不同样品之间的荧光信号差异来寻找潜在的疾病标志物等等。
流式细胞仪用于细胞周期分析
流式细胞仪用于细胞周期分析细胞周期生物学基础细胞的生成依赖于细胞的割裂而产生两个子代细胞的进程。
在割裂进程最需要复制并传递给子代细胞的是细胞核，因为它包括了细胞的遗传信息载体-DNA。
在绝大多数情形下，一个生物体的每一个细胞都含有相等的DNA物质和相同成份的染色体。
因此，细胞在割裂前必需复制DNA如此它的子代细胞就可以够拥有与父代相同的DNA含量。
细胞由DNA含量增加至割裂，再由它的子代继续复制并割裂，那个进程称之为细胞周期。
在细胞周期中最具特征性的阶段是在割裂前的DNA含量增加并达到2倍量的时候，并在现在细胞开始割裂其自身-有丝割裂期。
细胞周期中这两个循环步骤通常以一字母来表示：S期（合成期）和M期（有丝割裂期）。
当细胞周期中的S期和M期被概念后，咱们可观察到在有丝割裂完成后和DNA合成刚开始之时有短暂的停顿或间隙，一样的停顿或间隙存在于DNA合成期后和有丝割裂开始之时。
这两个间隙咱们将之命名为G1和G2期。
如此整个细胞周期可划分为G1 →S →G2 →M →G1，如下图所示：图1显示了细胞周期中个环节在流式细胞仪上分析时的图谱特征当细胞没有进入割裂进程时（咱们机体中的绝大部份细胞），它们处于细胞周期的G1期的位置上。
因此G1细胞在数量上绝对是居各期细胞之首并在流式图谱上形成最高的信号峰。
在G1期细胞中有一群细胞特别安静而且没有进入细胞循环的任何生物学特征，咱们称这些细胞为G0期细胞。
一些发生在G1和G2期细胞内的生物进程现还不完全明了。
处于G1期的细胞已开始为割裂前的DNA的复制和细胞成长预备许多RNA和蛋白分子。
处于G2期的细胞则会修复在DNA复制进程发生的错误并识别出在M期时将DNA平均等分的切割位置。
细胞循环中这些阶段的长度因细胞种类的不同而不同。
典型细胞循环中各期的进展时刻为：G1期12小时，S期6小时，G2期4小时及M期小时。
分析和流式细胞术细胞周期分析流式细胞最初的应用之一即是检测细胞的DNA含量，它可快速将细胞循环中的其它阶段与有丝割裂期区别开来。
流式细胞术的应用-周期检测
细胞周期的检测目录一、背景知识二、实验设计原则三、实验操作步骤四、实验结果分析一、背景知识1、细胞周期：G0/G1二倍体S二倍体---四倍体G2/M四倍体细胞周期(cell cycle)是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程。
共分为静止期(GO期)、DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)与分裂期(M期)。
在细胞周期的各个时期，DNA的含量随各时相呈现出周期性的变化。
通过核酸染料标记DNA，并由流式细胞仪进行分析，可以检测细胞周期。
2、细胞周期常用的核酸染料1.碘化丙啶(Propidium Iodide, PI) 是一种可以嵌合到双链DNA和RNA 的碱基对中，并与之结合的荧光染料，无碱基特异性。
其与双链DNA结合后可以产生荧光，并且荧光强度和双链DNA的含量成正比。
细胞内的DNA被PI染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量的测定。
PI不能穿透细胞膜而被排斥在活细胞外，但是可以穿过破损的细胞膜而对核染色。
可用于区分活、死细胞。
利用这一特性，通常与Calcein-AM、Hoechst 33258或Hoechst 33342等活细胞荧光探针一起使用，同时对活细胞和死细胞染色和鉴定，用于细胞凋亡相关的研究。
也可以用作多重荧光染色的复染剂，兼容于各种细胞标记技术，包括直接或者间接的荧光抗体检测，mRNA原位杂交，细胞结构特异性的荧光探针检测法以及组织染色。
PI的单独染色也可以进行细胞周期的检测。
PI的摩尔吸光系数相对比较低，但是其具有足够大的斯托克斯频移来同时检测核酸DNA和荧光标记抗体，只需要使恰当的滤片。
PI适用于荧光显微镜，共聚焦显微镜，流式细胞仪以及荧光计分析。
2.7-氨基放线菌素(7-amino-actinomycinD，7-AAD) 是一种核酸染料。
它不能通过正常细胞膜。
7-AAD同PI有着相似的荧光特性，但其发射波谱较PI窄，对其他检测通道的干扰更小，在多色荧光分析中是PI的最佳替代品。
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实
验 原 理
流式细胞仪的工作原理是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下 进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷 出，形成细胞柱。通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得 到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋 白质、抗原等物理及化学特征。 细胞内的DNA含量随细胞周期进程发生周期性变化，如G0/G1期的DNA 含量为2C，而G2期的DNA含量是4C。利用PI标记的方法，通过流式细胞仪 对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。
细胞周期时相分析
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
实
•
• • • • • • • •
验
步
骤
取对数生长期细胞，倒去培养液，胰酶适度消化细胞，用培养液吹 打，800rpm , 离心 15 min去上清。
PBS洗2次，加0.5mL PBS吹匀，务必吹散。 用5mL注射器将细胞吸起，用力打入5mL 70%(预冷)乙醇中，封口 膜封口。4℃固定过夜（可长至2周） 800rpm 15min收集固定细胞，PBS洗2次 用0.4mL PBS重悬细胞并转至Tube中轻轻吹打（防止细胞破碎） 加RNase-A约3µ L至终浓度约为50µ g/mL ，37℃水浴消化30 min； 加PI约50µ L至终浓度约为65µ g/mL ，在冰浴中避光染色30 min。 用300目（孔径40~50微米）尼龙网过滤，上机检测 样品分析测定及打印
细胞周期时相分析
仪器、材料与试剂
仪器：流式细胞仪，细胞培养设备，离心机，水浴，冰箱 材料：HeLa细胞，5ml注射器，离心管，封口膜，微量移液器，Tips 试剂：70％乙醇（保存于4℃），RNase-A （10mg/ml,-20℃保存），
PI （650µg/ml，避光保存于-20℃），PBS(pH 7.4，保存于4℃)
实验 利用流式细胞 术分析细胞周期时相
细胞生物学实验
流式细胞术分析细胞周期时相
• 实验目的 • 实验原理 • 仪器、材料与试剂 • 实验步骤 • 实验报告及思考题
实
验
目
的
掌握流式细胞仪的工作原理 掌握用流式细胞仪测量细胞群体 DNA 含量分布的方法 了解流式细胞术在细胞生物学研究中 的应用
细胞周期时相分析
细胞周期时相分析
实验报告及思考题
实验报告
标明你所测定的样品中各周期时相的百分比？
思考题
1. 2.
流式细胞术在科学研究中的应用 本实验为何要采用对数生长期的细胞？
细胞周期时相分析