流式细胞术实验技巧及数据分析
基于白血病分类的流式细胞术数据分析
基于白血病分类的流式细胞术数据分析白血病是一种相对较为常见的恶性血液病，其患者人数逐年增加。
其中，淋巴细胞白血病与骨髓增生性疾病的鉴别诊断，尤其是B-淋巴细胞白血病与慢性淋巴细胞白血病的鉴别诊断是白血病分类中最为困难的问题之一。
液体肿瘤的流式细胞术可以快速、准确地定量观察肿瘤细胞的表型及其分布状态，从而为诊断、分型、危险分层、疗效评估和指导个性化治疗提供了重要的参考依据。
一、流式细胞仪及其原理流式细胞仪（flow cytometer）是一种分析生物颗粒的现代化仪器，通过微细水在单细胞水平上分离、激发、检测、采集和分析细胞，使得我们可以从样品中快速、可靠地获得多参数荧光信息。
其主要原理是实现细胞的有效分离、定量、激发和检测，并将其表型指纹信息记录下来，以便科研人员和医生进一步分析和诊断相关问题。
二、流式细胞仪的前处理前处理是流式细胞术的关键环节之一，目的是获得高纯度的单细胞悬液，以方便后续的分离、激发和检测。
其主要包括样本采集、样品制备和细胞洗涤三个方面。
1. 样本采集样本采集是前处理的第一步，样本的质量和数量对后续的分离、检测和数据分析具有重要的影响。
在样本采集过程中，需要注意避免样本污染、细胞凋亡、氧化等对样本品质的影响。
2. 样品制备样品制备是前处理的重要环节之一，主要包括细胞裂解、滤过、质量检测、细胞染色和标记等步骤，在操作过程中，需要严格按照流程要求，精细化操作。
3. 细胞洗涤细胞洗涤是前处理的最后一步，其主要目的是从制备好的样品中，去除多余的细胞碎片、溶质和垃圾等杂质，得到纯净的单细胞悬液。
三、数据分析和诊断数据分析和诊断是液体肿瘤流式细胞术的重要环节之一，通过细胞表型相关分析等手段，展开进一步的诊断、分型以及疾病危险评估。
1. 后续生物信息学分析后续生物信息学分析可以对流式细胞术得到的多参数荧光信息进行进一步的解析和比对，方便分析人员和医生从中挖掘更多的疾病相关指标。
2. 诊断和分型诊断和分型是流式细胞术的重要应用之一，其主要基于患者血液中病理细胞的表型学特征，进一步进行疾病的分类和诊断。
流式细胞术实验技巧及数据分析
流式细胞术应用领域
免疫学研究
用于检测免疫细胞表面标志物、 细胞亚群分类和功能分析等。
生殖医学研究
用于精子分析和胚胎发育监测等 。
血液学研究
用于检测白血病、淋巴瘤等血液 肿瘤细胞的表面抗原和基因表达 。
肿瘤学研究
用于检测肿瘤细胞的生长、凋亡 和转移等生物学特性。
流式细胞术实验技巧 及数据分析
日期：
• 流式细胞术简介 • 流式细胞术实验技巧 • 流式细胞术数据分析 • 流式细胞术实验问题与解决 • 流式细胞术实验案例分享
目录
Part
01
流式细胞术简介
流式细胞术定义
流式细胞术是一种在液流中快速检测和分离单个细胞的生物技术。通过将细胞悬 浮在液流中，并使用激光束照射细胞，可以测量细胞的物理和化学特性，如细胞 大小、颗粒质量和荧光标记等。
物的群体结构、进化关系和生态分布等方面。
THANKS
感谢您的观看
仪器参数，如光电倍增管
电压、滤波器等。
数据采集
3 确保数据采集的完整性和
准确性，避免丢失或重复 采集数据。
Part
03
流式细胞术数据分析
流式细胞术数据分析
• 请输入您的内容
Part
04
流式细胞术实验问题与解决
荧光补偿设置问题
总结词
荧光补偿设置是流式细胞术实验中的 重要环节，用于消除不同荧光染料间 的光谱重叠。
细胞群体识别问题
总结词
细胞群体识别是流式细胞术实验的重要环节，直接影响实验 结果的分析和解读。
详细描述
在流式细胞术实验中，需要准确识别和区分不同的细胞群体 。通过优化抗体标记组合、采用多参数分析等方法，可以提 高细胞群体识别的准确性和可靠性，为后续的数据分析和解 读提供有力支持。
流式细胞仪的构造工作原理及数据分析
流式细胞仪的流动室和液流驱动系统
流式细胞仪的构造工作原理及数据分 析
流式细胞仪的构造工作原理及数据分 析
• (二)激光光源与光束形成系统
流式细胞仪的构造工作原理及数据分 析
• 目前台式机FCM，大多采用氩离子气体 激光器。激光(laser)是—种相干光源， 它能提供单波长、高强度及稳定性高的 光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想 光源。由于细胞快速流动，每个细胞经 过光照区的时间仅为1μs左右，每个细 胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号 强弱，与被照射的时间和激发光的强度 有关，因此细胞需要足够的光照强度。
流式细胞仪的构造工作原理及数据分 析
• (2)侧向角散射：侧向角散射是指 与激光束正交90°方向的散射光 信号，侧向散射光对细胞膜、胞质、 核膜的折射率更为敏感，可提供有 关细胞内精细结构和颗粒性质的信 息。
流式细胞仪的构造工作原理及数据分 析
2．荧光信号
激光的作用原理
流式细胞仪的构造工作原理及数据分 析
流式细胞仪的构造工作原理及数据分 析
• 前向角散射光（FSC, Forward Scatter）
细胞相对大小及其表面积
• 侧向角散射（SSC, Side Scatter）
•
细胞粒度及细胞内相对复杂性
流式细胞仪的构造工作原理及数据分 析
• (1)前向角散射：前向角散射与被测细 胞的大小有关，确切地说，它与细胞 直径的平方值密切相关。通常在FCM 应用中，选取FSC作阈值，来排除样 品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒， 以避免对被测细胞的干扰。
流式细胞仪的构造工作 原理及数据分析
2024/2/1
流式细胞仪的构造工作原理及数据分 析
流式细胞仪结果分析
流式细胞仪结果分析一、获取数据在进行流式细胞仪结果分析之前，首先需要获取实验数据。
流式细胞仪会输出每个样本细胞的荧光强度、散射性质等参数。
这些参数可以代表细胞的表型特征或者亚细胞结构。
根据实验的需要，可以选择一种或多种指标进行数据分析。
二、数据清洗和预处理由于实验过程中可能会受到一些随机因素的干扰，比如机器灵敏度、噪声等，得到的数据可能存在一些异常值。
因此，在进行数据分析之前，首先需要对数据进行清洗和预处理，以减少这些异常值的干扰。
数据清洗可以通过以下几种方法进行：1.去除非细胞事件：流式细胞仪在采集数据时可能会采集到一些非细胞事件，比如细胞碎片、空白颗粒等，可以通过设置或者后续数据处理来去除这些非细胞事件。
2.去除离群值：根据实验的需要和数据的分布情况，可以使用统计学方法或者软件工具来判断和去除离群值。
3.数据归一化：如果实验中使用了多个荧光探针，不同探针之间的信号强度可能有差异。
可以通过归一化处理来消除这种差异，以确保数据的可比性。
三、统计分析数据清洗和预处理之后，可以进行统计分析来描述和解析数据。
流式细胞仪的数据通常是多维的，可以使用多种统计分析方法来从不同角度揭示数据的特点和规律。
1.基本统计分析：包括均值、标准差、中位数等指标，可以帮助了解数据的集中趋势和离散程度。
2.相关性分析：通过计算各个参数之间的相关系数，可以研究不同指标之间的关系。
例如，可以使用皮尔逊相关系数来衡量两个参数之间的线性相关性。
3.差异分析：比较不同样本或不同组的数据之间的差异。
常用的差异分析方法有t检验、方差分析等。
四、数据可视化为了更好地理解和传达数据的结果，可以使用数据可视化技术将数据以图表、图像等形式展示出来。
常用的数据可视化方法包括散点图、条形图、箱线图等。
通过数据可视化，可以帮助研究者直观地观察数据的分布情况、群体几何形状和特征变化趋势等。
五、结果解读在进行流式细胞仪结果分析时，需要根据实验目的和样本特性进行结果的解读。
流式细胞术实验技巧及数据分析
670
红色
能量传递染料：
用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一 起，在488nm波长激发光激发后产生的发射波长 激发另一荧光染料产生的荧光信号。
Laser
488nm
ECD 620
PE CY5 670
CY7 755
流式细胞术操作流程：
培养细胞 新鲜组织 石蜡包埋
单细胞悬液 制备
荧光抗体标记
上机检测
胸腺嘧啶掺入到细胞新合成的DNA分子中，成为S 期细胞的一种标记物。流式细胞术采用抗BrdUrd 单克隆抗体免疫荧光和PI双参数检测细胞，不仅 可检测一个细胞群体的动力学参数和DNA含量，同
时可以了解不同细胞的DNA合成能力高低。
BrdUrd与PI检测
BrdUrd与PI检测
BrdUrd与PI检测
细 胞 三 色 荧 光 检 测
细胞因子测定
*检测T细胞(CD69)活化
G6=R1*R5
*CD4抗原分子结构引起CD4荧光强度下调
细胞因子分析图
*过敏性鼻息肉与鼻息肉细胞因子比较
纯化单核细胞
调节性T细胞检测
G3=R1*R3 G4=R1*R4
凋亡细胞测定
凋亡细胞测定
细胞凋亡检测
阴性的设置
光
补
偿
FL2
FL1
利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻
荧光通道的信号加以扣除的方法称“荧光补偿”
荧光补偿
Mean值判断补偿
双或多参数荧光抗体的组合标记
荧光染料
激发波长（nm) 发射波长（nm)
颜色
FITC+PE
488
FITC+T red
488
568
FITC+PeCy5 488
流式细胞术实验技巧及数据分析
流式细胞术实验技巧及数据分析一、实验技巧1.细胞样本的准备在进行流式细胞术之前，首先需要准备好细胞样本。
对于悬浮细胞，可以通过离心分离获得单细胞悬浮液；对于贴壁细胞，需要利用胰酶等方法将细胞从培养皿上剥离。
样本的细胞浓度需要适当调整，以保证在实验过程中细胞数目在仪器检测范围内。
2.细胞标记与染色3.样本的处理与染色控制为了减少噪音和误差，需要进行相应的样本处理和染色控制。
常用的处理包括细胞固定、膜破裂和核酸溶解等。
另外，对照组的设置也非常重要，包括负对照、单标对照和血细胞淋巴细胞控制等，以校正仪器和标记的相关性。
4.流式细胞仪的设置与操作流式细胞仪是进行流式细胞术的关键仪器，需要正确设置和操作。
首先，要校准仪器的激发光源、滤光片和检测器等参数，以确保获得准确的荧光信号。
其次，要根据标记物的激发光和发射光波长选择合适的检测通道。
最后，通过检测标记物阳性细胞的信号强度和分布，调整仪器的敏感度和流速，以获得符合实验要求的数据。
二、数据分析1.数据获取与记录在流式细胞术实验结束后，需要用相应的软件（如FlowJo、CellQuest等）获取和记录仪器所产生的原始数据。
这些数据包括细胞整体的荧光信号和散点图等。
2.质量控制与后处理对于数据质量的控制，首先需要排除掉背景信号。
通过设置负对照，根据荧光信号的阈值来确定阳性细胞的比例。
另外，还需要剔除激活的、死亡的和颗粒干扰的细胞等。
3.数据可视化通过制作直方图、散点图和轮廓图等，可以直观地展示细胞的其中一种特定特征（如表达一些蛋白质、细胞周期等）在整个细胞群体中的分布情况。
从图形中可以得出相应的统计结果，并可以进一步比较不同样本之间的差异。
4.数据统计与分析对于一些研究问题，需要计算不同细胞亚群的百分比、中位数、平均值和标准差等。
此外，还可以利用双参数散点图，通过计算相关系数（如Pearson相关系数）来分析两个特征之间的相关性。
总结：流式细胞术作为一种快速、高通量和灵敏的细胞分析技术，对于研究细胞标记物的表达和功能等提供了有力的手段。
流式细胞术实验报告
一、实验目的本实验旨在通过流式细胞术技术，对细胞群体进行快速、精确的分析和定量测定，研究细胞的物理与化学性质，并对细胞进行分类和分选。
通过本次实验，掌握流式细胞仪的工作原理，了解其在细胞生物学研究中的应用。
二、实验原理流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒逐个进行快速定量分析和分选的技术。
其基本原理是将经过荧光标记的细胞或微粒，在流动系统中以高速通过，同时利用激光束照射细胞，通过光散射和荧光信号来获取细胞的大小、形态、表面标记物等信息。
最后，通过数据分析和可视化展示，对细胞进行计数、分类和分析。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 细胞样本：小鼠脾细胞、Jurkat细胞- 荧光标记抗体：CD45-FITC、CD3-PE、CD4-APC- 溶液：磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）、荧光染料（如PI）2. 实验仪器：- 流式细胞仪（如BD FACS Calibur）- 离心机- 恒温培养箱- 移液器四、实验步骤1. 细胞制备：- 收集小鼠脾细胞或Jurkat细胞，用PBS洗涤后，调整细胞浓度为1×10^6个/mL。
- 加入荧光标记抗体，室温下孵育30分钟。
- 用PBS洗涤细胞两次，去除未结合的抗体。
2. 流式细胞术分析：- 将处理好的细胞加入流式细胞仪，设置合适的参数进行检测。
- 收集数据，进行细胞分类和分析。
3. 数据分析：- 利用流式细胞术分析软件（如CellQuest、FlowJo）对数据进行分析，包括细胞计数、分类、DNA含量分析等。
五、实验结果与分析1. 细胞分类：- 通过流式细胞术，成功将小鼠脾细胞和Jurkat细胞分为不同的亚群，如T细胞、B细胞等。
2. DNA含量分析：- 通过PI染色，检测细胞的DNA含量，发现小鼠脾细胞和Jurkat细胞均处于G0/G1期。
3. 表面标记物分析：- 通过CD45-FITC、CD3-PE、CD4-APC抗体检测，发现Jurkat细胞为T细胞，小鼠脾细胞中含有B细胞和T细胞。
流式细胞仪实验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除流式细胞仪实验报告篇一：流式细胞术实验报告流式细胞术实验目的掌握流式细胞仪的工作原理掌握用流式细胞仪测量细胞群体DnA含量分布的方法了解流式细胞术在细胞生物学研究中的应用实验原理流式细胞仪的工作原理是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。
在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。
通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其体积、内部结构、Dn(:流式细胞仪实验报告)A、RnA、蛋白质、抗原等物理及化学特征。
细胞内的DnA含量随细胞周期进程发生周期性变化，如g0/g1期的DnA含量为2c，而g2期的DnA含量是4c。
利用pI标记的方法，通过流式细胞仪对细胞内DnA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。
仪器、材料与试剂仪器：流式细胞仪、离心机。
材料：hela细胞样品、试管、离心管、封口膜、微量移液器、Tip头、eppendorf管。
试剂：70％乙醇（保存于4℃），Rnase（-20℃保存），pI染液（避光保存于-20℃），pbs(ph7.4，保存于4℃)实验步骤样品细胞由老师于课前收集并置于70%(预冷)乙醇中4℃下固定过夜。
2000rpm15min收集固定细胞，pbs洗2次。
用100μLpbs重悬细胞并转至试管中轻轻吹打（防止细胞破碎）。
加pI染液50μL和Rnase约2μL室温放置15min。
上机检测。
样品测定并使用modFitLT软件分析结果。
实验结果与讨论:所测样品中各周期时相的百分比：g1期68.48%g2/m期16.63%s期14.89%g2：g1=1:1.77cV12.16提示结果可能不可靠或存在多倍体细胞。
流式细胞术是一种对悬液中细胞、微生物或细胞器等进行单个快速识别、分析和分离的技术。
用以分析细胞大小、细胞周期、DnA含量、细胞表面分子以及进行细胞分选等。
这种技术具有以下特点1.测量速度快；2.可进行多参数测量；3.是一门综合性的高科技方法（Fcm综合了光学，电子学，流体力学，细胞化学，免疫学，激光和计算机等多门学科和技术）；4.既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
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时可以了解不同细胞的DNA合成能力高低。
精品课件
精品课件
BrdUrd与PI检测
精品课件
BrdUrd与PI检测
SSC
SSC信号的强弱与细胞内颗粒多少相关
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细胞散色光信号
精品课件
细胞荧光测量
细胞的自发荧光 未经染色的样品细胞
在激发光的照射下可测到有微弱的荧 光信号.
细胞的特异性荧光
经过各种特异染色的
细胞在激发光的照射下可测到较强的荧光
信号.
精品课件
自发荧光信号与特异染色的荧光信号分析图 自 发 荧 光 信 号
Laser
488nm
精品课件
ECD 620
PE
术操作流程：
培养细胞 新鲜组织 石蜡包埋
单细胞悬液 制备
荧光抗体标记
上机检测
精品课件
表型测定 细胞分选
统
继
FISH PCR
析
计 学
续 培
分
养
单 分 散 细 胞
精品课件
FSC
FSC信号的强弱与细胞的大小和活力相关
精品课件
流式细胞术实验技巧及数据分析
上海交通大学医学院 史桂英
精品课件
BD公司不同型号流式细胞仪
FACSCalibur
FACSCanto
FACSCount
LSRII
FACSAria
精品课件
FACSVantage&DiVa
一 流式细胞仪的基本原理
*稳定流动 *激发光斑 *荧光补偿 *荧光素选择
二 数据分析及开窗
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G3=R1*R3 G4=R1*R4
凋亡细胞测定
精品课件
凋亡细胞测定
精品课件
细胞凋亡检测
精品课件
阴性的设置
精品课件
血 小 板 检 测
精品课件
血 小 板 检 测
精品课件
血 小 板 检 测
精品课件
血小板检测
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谢谢
精品课件
液流驱动系统（示意图）
流速与压力的关系服从Bernoulli方程，即 P=(1/2)V2 (忽略高度的变化)。改变气精压品课,件就可获得不同的流速。
精品课件
低速
高速
不同样本速率形成的样本流
精品课件
激发光源与光束成形系统
精品课件
光
束
聚焦距离
成
形
与 激光束
.
细
聚焦透镜
胞
受
照
64um
方
强度
式
32um
精品课件
BrdUrd与PI检测
精品课件
细 胞 三 色 荧 光 检 测
精品课件
细胞因子测定
*检测T细胞(CD69)活化
精品课件
G6=R1*R5
精品课件
*CD4抗原分子结构精引品课起件 CD4荧光强度下调
细胞因子分析图
*过敏性鼻息肉与鼻息肉细胞因子比较
精品课件
纯化单核细胞
精品课件
调节性T细胞检测
精品课件
特 异 染 色 的 荧 光 信 号
精品课件
DNA分析比较
精品课件
排除双联体细胞
精品课件
细胞阻滞在G2M期
精品课件
双 克 隆 细 胞 周 期 分 析
精品课件
BrdUrd和DNA双标记染色
溴脱氧尿嘧啶核苷( Bromodeoxyuridine， BrdUrd )是胸苷的一种类似物。它可以替代
488
525 、575
488
525
568
488
525、 675
488
525、 625
488
525、575、675
488
525、575、675 绿、橙红
488
525 、 575
精品课件
633
能量传递染料：
用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一 起，在488nm波长激发光激发后产生的发射波长 激发另一荧光染料产生的荧光信号。
荧光通道的信号加以扣除的方法称“荧光补偿” 精品课件
荧光补偿
精品课件
Mean值判断补偿
精品课件
双或多参数荧光抗体的组合标记
荧光染料
激发波长（nm) 发射波长（nm)
颜色
FITC+PE FITC+T red
FITC+PeCy5 FITC+ ECD F+P +PeCy5 F+ ECD +PeCy5 F+P +PeCy5 +APC
0
精品课件
这种椭圆形 20um 光斑的检测
区保证每个 细胞分别受 到光照且受 检时受到一 致的光照
FCM的单细 32um 胞照明技术
精品课件
荧 光 光 谱 重 叠
FITC和PE荧光光谱重叠
精品课件
荧 光
Uncompensated vs Compensated
补
偿
FL2
FL1
利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻
精品课件
FCM原理示意图
精品课件
层流技术
层流是液体稳定流动的必要条件,管道中
层流 的形成要满足雷诺数
dρV
Re =
< 2300，
η
式中ρ、η分别为液体的密度和粘滞系数，d和
V分别为管道的直径和液体的平均流速。FCM利
用层流技术,使细胞流动稳定,并具有自聚焦作
用,为细胞分析分选提供技术保证.
精品课件