流式细胞分析操作流程
CytoFLEX流式细胞分析仪快速入门
e
f
g
3. 验证 USB 配置密钥已连接至 USB 端口。
注意
可能会出现仪器损坏。从流体容器托架取下鞘液容器，并且远离仪器进行充 注，以防止鞘液溢出损坏仪器电路。
4. 从流体容器托架取下鞘液容器，并用提供的鞘液填充鞘液容器。 5. 如有必要，拆下右侧盖子，并填充带有 1 部分 Contrad 70 和 1 部分 DI 水混合的深度清
CytoFLEX 流式细胞分析仪快速入门 启动
2. 请确保所有管线和电缆根据颜色代码连接至仪器。
b
c
d 1. 废液液位传感。与废液传感器电 缆相连。 2. 流动室废液排出。与流动室废液 导管相连。 3. 鞘液液位传感。与鞘液传感器电 缆相连。 4. 废液排出。与废液导管相连。 5. 鞘液回流。与鞘液导管相连。 6. 鞘液流入。与鞘液导管相连。
洁溶液。
警告
漂白剂具有化学伤害危险。为避免接触漂白剂，请使用包括防护眼镜、手套和 适当的实验室服装在内的屏障保护。使用化学药品前，请参阅有关化学品暴露 的安全数据表以了解详细信息。
6. 如有必要，清空废液容器。将 400 mL 5% 至 6% 的漂白剂添加至废液容器。
仪器启动
1. 打开仪器后盖上的电源开关，它位于电源电缆正上方。
8. 使用“阈值”工具 ，或选择
9. 使用“标尺”和“增益”工具 至所需位置。
设置辨别以消除图上不需要的细胞群。
，或选择
以将图上显示的细胞群移动
5 / 16
CytoFLEX 流式细胞分析仪快速入门 调节设置和补偿
调节设置和补偿
“图表”、“门控”和“统计资料”管理
1. 若要修改图表、门控、统计表或细胞群层级属性，请选择该图表并右击以选择属性 选项。参见以下示例。 • 图表属性 （右击门控）
流式检测ros步骤
流式检测ros步骤流式检测ROS（Reactive Oxygen Species）是一种用于研究细胞中活性氧化物含量和活性的方法。
ROS在细胞代谢和信号传导中起着重要的调节作用，但过高的ROS水平可能导致细胞损伤和炎症反应。
了解ROS的产生、调节和检测方法对于研究细胞的生理和病理过程具有重要意义。
本文将介绍流式检测ROS的步骤。
一、实验准备在进行流式检测ROS之前，首先需要准备实验所需的材料和仪器。
主要的实验材料包括细胞悬液、ROS探针染色剂和细胞培养基。
实验仪器主要包括流式细胞仪和荧光显微镜。
确保实验室环境整洁，并进行必要的消毒操作，以防止细菌或其他污染物对实验结果产生影响。
二、样品处理1. 细胞培养和处理：培养细胞至对数生长期，并按照实验需求进行不同处理组的分组。
例如，可以设置对照组、药物处理组和其他实验条件组。
注意保证各组样品的处理时间和用量一致。
2. ROS探针染色：选择合适的ROS探针染色剂，如DCFH-DA （Dichlorodihydrofluorescein diacetate）或DHE（Dihydroethidium），并根据产品说明将其加入培养基中处理细胞样品。
染色后，细胞内的ROS会使染色剂发生荧光变化。
三、流式细胞仪检测1. 仪器准备：打开流式细胞仪，进行仪器预热和流体平衡操作。
检查仪器的各项参数设置，包括激发光源波长、荧光信号收集设置等。
确保仪器的正常工作和准确的数据获取。
2. 样品装载：将经处理和染色的细胞样品分装到合适的试管中，并用细胞培养基或缓冲液洗涤样品，以去除残留的染色剂和培养基。
避光操作是非常重要的，以防止染色剂受到光照引起的激活。
3. 流式细胞仪设置：设置细胞仪的相关参数，包括流速、激发光源强度、荧光信号收集通道等。
根据不同的染色剂选择合适的激发波长和荧光通道，以确保准确的荧光信号检测。
4. 数据获取：将样品试管依次插入流式细胞仪中，进行数据获取。
根据实验需要，可以选择连续获取或选取特定的细胞种群进行采集。
巨噬细胞流式分选操作步骤
巨噬细胞流式分选操作步骤
流式细胞术是一种常用的细胞分选技术，可以分离、分析和纯化复杂的细胞群体。
巨噬细胞是一类重要的免疫细胞，具有多种生物学功能，在研究免疫学、炎症和感染等方面具有重要应用价值。
本文介绍了巨噬细胞流式分选的操作步骤。
1. 细胞准备
首先需要从组织或培养物中收集巨噬细胞，一般采用胶原酶或丝裂霉素等酶类消化酶来分离细胞。
收集细胞后，需要进行胞外标记，以便在流式细胞仪中进行检测和分选。
可以使用荧光素、荧光素同工酶、抗体等标记物质。
2. 流式细胞检测
将标记后的细胞悬浮于缓冲液中，加入适当的抗体，进行流式细胞检测。
在流式细胞仪中，通过激光器激发标记物质，检测细胞的荧光信号，并进行细胞计数和分析。
3. 巨噬细胞分选
根据细胞检测结果，可以设置分选门限，选择特定的细胞群体进行分选。
巨噬细胞分选可以采用荧光激活细胞分选或者磁珠分选等技术。
在分选过程中，需要注意细胞的稳定性和纯度，以保证实验结果的准确性。
4. 分选后细胞的处理
分选后的巨噬细胞可以用于一系列的细胞学、免疫学、分子生物学等实验中，如细胞培养、基因表达分析、蛋白质分析等。
需要注意
的是，在使用分选后的细胞时，应该避免细胞的冻融和处理时间过长等因素对细胞的影响。
总之，巨噬细胞流式分选是一项重要的实验技术，它可以帮助研究者更深入地了解巨噬细胞的生物学功能和免疫调节机制。
在实验中，需要严格按照操作步骤进行，保证实验结果的准确性和可重复性。
最详细的流式细胞仪实验方法
流式细胞仪实验方法一、实验准备1．标本制备：2．最小化非特异性结合：二、凋亡1．凋亡的检测方法：网站和其它2．PI染色法3．Annexin V 法4．TUNNEL法三、细胞因子1．激活的细胞因子2．CBA四、血小板1．活化2．活化检测3．网织血小板五、红细胞1．网织红细胞2．PNH3．胎儿红细胞六、肿瘤学1．DNA 细胞周期2．蛋白3．多药耐药4．微小残留白血病第一部分标本处理一、流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。
孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。
本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。
虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。
(二)间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。
本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。
但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。
所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。
另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。
二、最小化非特异性结合的方法1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。
2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。
CytoFLEX流式细胞分析仪快速入门
1. 每隔一个月清洁一次流动室。 a. 机器待机时，选择“细胞分析仪”菜单中的深度 清洁，然后等待至过程结束。
注意
可能会出现仪器损坏。请勿将清洁溶液放置在流动室中超过 24 个小时。 b. 等待半个小时，然后选择充注以清除剩余清洁溶液。 c. 等待至充注循环完成，然后运行“日常清洁”。
14 / 16
显示并保存。
• 结果部分的绿色图标 • 结果部分的红色图标
表明通过。 表明失败。
6. 若 QC 失败，请充注仪器、初始化并重复操作 QC。
注释 若 QC 同一天连续失败两次，请联络 Beckman Coulter 代表。
3 / 16
CytoFLEX 流式细胞分析仪快速入门 数据采集
数据采集
创建实验
重要 对于每个新批次编号，下载对应的目标值文件，并参考步骤 2.
4. 使用屏幕左侧的批次编号-下拉列表 球对应的批次编号。
，选择与 QC 荧光微
5. 选择 始 QC。
，将已准备的 QC 样品试管插入样品试管托架，然后选择
以开
注释 QC 可能需要数分钟。QC 荧光微球的最低流速为 100 事件/秒。一旦完成，结果就会自动
4. 请熟悉工具栏。
图形 统计资
料 层级
5. 利用“图表”工具
门 缩放 标尺
增益 阈值 撤消/恢复
新建所需直方图或点状图。
4 / 16
CytoFLEX 流式细胞分析仪快速入门 数据采集
6. 设置所需样品流速，然后选择“采集”面板上的
，以起动激光器和流体。
7. 将样品管装入样品端口，然后选择
以开始采集和显示数据。
关闭
1. 从“文件”菜单打开任一实验，并初始化仪器。 2. 在“细胞分析仪”菜单中选择日常清洁。
流式细胞操作流程
流式细胞操作流程
流式细胞术是一种用于分析和分类细胞的生物学技术。
以下是典型的流式细胞操作流程：
1.细胞样本准备：
•收集要分析的细胞样本，可以是细胞悬液、组织细胞悬液或血液等。
•对样本进行必要的预处理，如裂解红细胞，去除细胞碎片等。
2.标记细胞：
•使用荧光标记物（荧光染料、抗体等）标记细胞中的特定分子，以便流式仪器能够检测到这些标记。
•标记的目标可以是表面抗原、细胞器、DNA或RNA等。
3.样本染色：
•添加染色剂（荧光标记物）到细胞样本中，使其能够在流式仪器中发光。
•染色通常通过孵育样本和染色剂混合物来实现。
4.细胞固定（可选）：
•如果需要保持细胞在染色后的状态，可以进行细胞固定步骤。
5.样本混合：
•将经过标记和染色的细胞混合均匀，以确保获得代表性的样本。
6.样本注射到流式细胞仪：
•将样本通过流式细胞仪的进样口注入，使其形成单个细胞的流动流。
7.激光激发和信号检测：
•使用激光激发样本中的荧光标记物。
•流式细胞仪会检测细胞产生的荧光信号，并记录下来。
8.数据分析：
•通过计算机软件对收集到的数据进行分析。
•分析可以包括对不同细胞亚群的鉴定、数量统计、染色物的表达水平等。
9.结果呈现：
•将分析结果呈现为图表、图像或表格，以便更好地理解和解释实验结果。
流式细胞术可以用于许多研究领域，如免疫学、细胞生物学、肿瘤学等，以研究和识别不同细胞类型、表达分子的水平等。
流式细胞仪操作规范流程-SOP
流式细胞仪操作规程目录1：淋巴细胞亚群测定及绝对计数2：活化淋巴细胞亚群、记忆T 及纯真T 的检测3：HLA-B27 测定4：CD55／CD59 测定5：干细胞检测和绝对计数6：白血病免疫分型测定7：淋巴细胞T 细胞亚群细胞内因子IFN- γ /IL-4 测定8：细胞周期分析9：活化血小板检测10：血小板抗体测定11：红细胞抗体测定12：粒细胞抗体测定淋巴细胞亚群测定（流式细胞仪）医院检验科操作规程文件号：200 年月日起实施第1 版（共3 页）本规程每2 年复审一次复审日期：年月日复审人：规程编写者：审批者：批准日期：年月日文件分发部门和／或个人院档案室保管者：检验科主任：检验科实验室：淋巴细胞亚群测定试剂品牌剂型 规格 贮存贝克曼库尔特成分1：单克隆抗体液体2—8℃(CD45/4/8/3 No.6607013 CD45/56/19/3No.6607073CD4/8/3 No.IM1650同型对照IgG1/IgG1/IgG1 No.IM1672CD3/19 No.IM1293CD3/16+56 No.IM2076 CD19-PC5No.IM2643Flow-Count 荧光微球No.7547053)2：全血溶血试剂 (Q-Prep) 液体 (No.7546946)A ：甲酸液体 70ML 室温B ：碳酸钠等液体 32ML 室温C ：多聚甲醛液体14ML室温(Optilyse C No.IM1401) 液体室温3：鞘液 (No.8546859) 液体 20L室温4：清洗液 (No.8546930)液体5L室温5：荧光微球 (No.6605359) 液体10ML2-8 ℃(Flow-Check)仪器BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra样本制备 ：参考值(百分数(绝对值) )CD3+ 60.8-75.4%(1141-1880) CD4+ 29.4-45.8%(478-1072) CD8+ 18.2-32.8%(393-742) NK 9.5-23.5% (175-567)Th/Ts 1.05-2.03周血 NK 细胞增加。
流式细胞仪操作步骤(FACSCalibur)
流式细胞仪操作步骤(FACSCalibur)一、开机程序：1.检查鞘液桶和废液桶。
确认鞘液充满状态（鞘液为鞘液桶体积的3/4位置，可以连续工作3个小时左右）、盖紧黑盖、管道畅通、废液桶有足够空间容纳本批标本排弃的废液。
如果要添加鞘液，要先释放鞘液桶中气压。
2.依次打开流式细胞仪FACSCalibur稳压器、主机开关、电脑开关，打印机。
3.气压阀置于加压位置，待流式细胞仪处于STANDBY状态，做Prime，以排除管路中气泡。
二、运行FACSComp软件、检查仪器状况1.制备三色标准微球样本。
一般情况向1ml鞘液（或过滤PBS）中加入1滴质控小微球，也可以根据实际情况调节浓度。
2.机器预热5 min，打开FACSComp软件，选择保持路径。
选择所需校正内容，如果使用的微球是新一批产品要输入微球的批号。
3.在软件界面左侧Assay Selection选项中选择质控类型，即实验过程中是否需要清洗样品。
4.上样品，微球溶液上样之前要充分混匀。
功能键设置在“RUN”。
5.仪器自动检查，并做电压、补偿等设置。
6.FACSComp软件运行完毕，显示结果通过测试。
7.做Set up。
8.打印校正结果，退出FACSComp程序。
备注：在质控过程中，如果提示收集细胞速度慢可以提高细胞收集速度，但是在调节灵敏度（Sens）时，一定要用“Low”的状态上样，保证仪器灵敏度的准确。
在使用仪器过程中要养成好的习惯，在上样品过程中，仪器保持在“Low”“Standby”状态。
三、样品分析软件：CellQuest Pro1.软件，选择“联机”。
Acq Connect（1）在弹出的界面中的选择数据存储路径（Directory 菜单）；（2） 对实验样本进行命名；（3） 对实验通道进行预设（FSC,SSC,FL1-FL4）。
备注：如果界面被关闭，重新调出步骤：2.调出质控模板。
3. 画图 选择画图工具（一般选择散点图），Inspect 界面会自动弹出，对几够选中图形），将 改为 ,更改横纵备注：第一个散点图横坐标为FSC ，纵坐标为SSC 。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
CONTENTS
Histogram Dot Plots Contour Pseudo 3D & 3D
Gating
Papers Cell cycle Apoptosis
Histogram
Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow
J. Clin. Invest. 2007;117:902–909
J. Clin. Invest. 2007;117:902–909
J. Clin. Invest. 2007;117:902–909
Monocyte retention in the bone marrow
J. Clin. Invest. 2007;117:902–909
Cancer Cell 2011；20：781–796
JEM 2007；204（5）：1037–1047 The Journal of Immunology, 2009, 182: 240–249
Dot Plot
Control of Regulatory T Cell Development by the Transcription Factor Foxp3
J. Clin. Invest. 2007;117:902–909
Distinct Populations of Cancer Stem Cells Determine Tumor Growth and Metastatic Activity in Human Pancreatic Cancer
Histogram
Cancer Cell 2011；20： 728–740
Dot Plot
Senescence surveillance of pre-malignant hepatocytes limits liver cancer development
Nature 2011；479:547-551
Science 2003;299:1057-1061
Contour
Imatinib potentiates antitumor T cell responses in gastrointestinal stromal tumor through the inhibition of Ido
Nature Medicine 2011；17（9）:1094-1100
Cell Death and Differentiation 2008;15:51–57
Prolonged Maturation and Enhanced Transduction of Dendritic Cells Migrated from Human Skin Explants After In Situ Delivery of CD40-Targeted Adenoviral Vectors
Histogram
CXCL12 and Vascular Endothelial Growth Factor Synergistically Induce Neoangiogenesis in Human Ovarian Cancers
Cancer Res 2005; 65(2): 465-72
Histogram
Cancer Res 2005; 65(8): 3437-46
Pretransplant CSF-1 therapy expands recipient macrophages and ameliorates GVHD after allogeneic hematopoietic cell transplantation
Combined Genetic Inactivation of b2-microglobulin and CD58 Reveals Frequent Escape from Immune Recognition in Diffuse Large B Cell Lymphoma
Cancer Cell 2011；20： 728–740
JEM 2011;208(5):1069-1082
Plasmacytoid dendritic cells sense self-DNA coupled with antimicrobial peptide
Nature 2007;449:564-569
Expansion of myeloid immune suppressor Gr+CD11b+cells in tumor-bearing host directly promotes tumor angiogenesis
Cancer Res 2006; 66(13): 6807-15
Flt-1, vascular endothelial growth factor receptor 1, is a novel cell surface marker for the lineage of monocyte-macrophages in humans Blood. 2001;97:785-791
Cell Stem Cell 2007;1:313–323
Cell Stem Cell 2007;1:313–323
Nature 2002；418:41-49
Histogram
Human dendritic cell mediated cytotoxicity against breast carcinoma cells in vitro
Journal of Leukocyte Biology 2002;72:312-320
Cell Stem Cell 2009;4:263–274
CD8 a+ Dendritic Cells Are the Critical Source of Interleukin-12 that Controls Acute Infection by Toxoplasma gondii Tachyzoites
Cancer Cell 2011; 20, 701–714
Engraftment and Reconstitution of Hematopoiesis Is Dependent on VEGFR2-Mediated Regeneration of Sinusoidal Endothelial Cells
Immunity 2011;35, 249–259
Identification and Functional Analysis of Tumor-Infiltrating Plasmacytoid Dendritic Cells in Head and Neck Cancer
Cancer Research 2003；63：6478–6487
Contour
Antiangiogenic and Antimetastatic Activity of JAK Inhibitor AZD1480
Cancer Res 2011; 71(21); 6601–10
Pseudo 3D & 3D
Gating
Peripheral blood
CD80 in Immune Suppression by Mouse Ovarian Carcinoma– Associated Gr-1+ CD11b+ Myeloid Cells
Dot Plot
Prevalence of Regulatory T Cells Is Increased in Peripheral Blood and Tumor Microenvironment of Patients with Pancreas or Breast Adenocarcinoma
Cancer cell 2004;6:409-421
Tumour hypoxia promotes tolerance and angiogenesis via CCL28 and Treg cells
Nature 2011；475:226-230
Nonmyelinating Schwann Cells Maintain Hematopoietic Stem Cell Hibernation in the Bone Marrow Niche
The Journal of Immunology, 2002, 169: 5ivo Elicited Tumor Infiltrating Macrophages and Dendritic Cells towards Tumor Rejection
Cancer Immunol Immunother 2007; 56:641–648
VCAM-1 Promotes Osteolytic Expansion of Indolent Bone Micrometastasis of Breast Cancer by Engaging a4b1PositiveOsteoclast Progenitors
Cell Stem Cell 2007;1:313–323
Cell Stem Cell 2007;1:313–323
Cell Stem Cell 2007;1:313–323
Cell Stem Cell 2007;1:313–323
Cell Stem Cell 2007;1:313–323
Cell Stem Cell 2007;1:313–323
Essential Role of Lung Plasmacytoid Dendritic Cells in Preventing Asthmatic Reactions to Harmless Inhaled Antigen
J. Exp. Med 2004;200(1):89-98
Metronomic cyclophosphamide regimen selectively depletes CD4+CD25+ regulatory T cells and restores T and NK effector functions in end stage cancer patients