流式细胞术实验指南
组织做流式细胞术实验步骤
组织做流式细胞术实验步骤流式细胞术，这名字听上去有点高大上，其实就是一种检测细胞的小工具，能帮我们数一数细胞的数量、类型，甚至能看看细胞里发生了什么“八卦”。
今天，我就给大家轻松聊聊怎么做这个实验，别担心，不会让你觉得像是在读教科书！1. 实验准备1.1 材料准备首先，咱们得准备好所有的材料，像做饭一样，先把菜都切好了。
你需要的有：流式细胞仪、细胞悬液、抗体、PBS（磷酸盐缓冲液）和一些其他的小玩意儿。
话说回来，细胞悬液就像是咱们的主菜，抗体呢，就像是调料，能帮我们把细胞“调”出不同的口味。
记得提前检查一下，别到时候缺了盐（抗体），结果菜就没法做了！1.2 设备调试设备调试这事儿，虽然听上去有点麻烦，但其实就像给车子加油一样。
把流式细胞仪打开，检查一下它的设置，看看有没有故障。
你可不能指望它像“超人”一样自动工作，得稍微照顾一下。
调整好激光和光电探测器，这可是流式细胞术的“面子工程”，咱们要让它看起来专业一点嘛！2. 实验步骤2.1 细胞制备准备好了材料后，就可以开始“烹饪”了。
首先，将细胞悬液取出，轻轻摇晃，让细胞均匀分布。
记得别用力过猛，像对待婴儿一样轻柔，不然细胞就容易“受伤”。
接下来，加入适量的抗体，确保每个细胞都能得到“调料”的滋润。
这一步就像是在给细胞穿衣服，让它们打扮得漂漂亮亮的。
2.2 孵育与洗涤完成了“穿衣”，咱们得给它们一点时间孵化，就像煮汤一样，让它们入味。
把细胞悬液放在37摄氏度的温箱里，大概30分钟到1小时，耐心点，别急！这时候可以做点其他的准备，省得等得无聊。
时间到了，记得把细胞拿出来，加入PBS洗涤，洗去多余的“调料”。
再用离心机把细胞沉淀下来，这个步骤可得小心翼翼，别让细胞“跑”了。
3. 数据采集3.1 设置流式细胞仪现在，我们终于可以进入大戏的最后一幕了！将洗涤好的细胞悬液放入流式细胞仪中，设置好参数。
这一步就像是给细胞上场前的最后准备，调好焦距，亮度，确保它们在仪器面前能“光芒四射”。
流式细胞术操作规程
流式细胞术操作规程
《流式细胞术操作规程》
流式细胞术是一种用于研究细胞表型和功能的重要技术。
在进行流式细胞术时，操作规程的严谨性和标准化是非常重要的。
以下是流式细胞术操作规程的一般步骤：
1. 样品准备：首先，需要准备好待测的细胞样品。
这包括细胞的培养和收集，以及必要的处理和染色。
2. 仪器准备：在进行流式细胞术之前，需要确保流式细胞术仪器的正常运行。
这包括检查流式细胞仪和细胞分选仪的通电和冷却系统，以及其它相关设备的准备。
3. 校准仪器：在进行流式细胞术之前，需要对流式细胞仪进行校准，以确保其准确测量样品中细胞的特定参数。
4. 样品测量：将准备好的细胞样品加入流式细胞仪，并进行测量。
测量完毕后，需要对数据进行分析和记录。
5. 数据分析：对测量得到的数据进行分析，包括确定细胞的表型和功能，以及对其它相关参数进行分析和比较。
6. 结果解释：根据数据分析的结果，进行结果的解释和报道，并对相关实验现象进行讨论和总结。
在进行流式细胞术时，需要严格遵守操作规程，以确保实验结果的准确性和可靠性。
此外，对于一些特殊的实验操作，可能
还需要根据具体情况进行相应的调整和改进。
流式细胞术的操作规程是一个很重要的研究工具，它可以帮助研究人员进行高效、准确的实验，从而为科学研究和医学诊断提供更为可靠的数据和方法。
流式细胞术活细胞实验步骤
流式细胞术活细胞实验步骤A. 溶液与试剂注：利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。
011X 磷酸盐缓冲盐水（PBS）：配制 1 L 的 1X PBS：添加 100 ml 10X PBS至 900 ml 水，然后将其混合。
02抗体稀释缓冲液：购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液，或在100 ml 1x PBS 中溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA)来制备 0.5% BSA PBS 缓冲液。
4°C 保存。
03推荐的二抗：要检测未偶联的抗体，请选择与一抗（例如兔）的宿主物种匹配的二抗。
注：在您的实验中加入荧光细胞染料（包括活性染料、DNA 染料等）时，请参考所添加的染料产品页，了解建议的实验步骤。
B. 免疫染色注：使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。
注：如果使用全血，则需在免疫染色之前裂解红细胞并通过离心分离来洗涤。
注：为防止人 Fc 受体与兔 IgG 或小鼠 Fc 受体与兔或小鼠 IgG 结合，在免疫染色前用 Fc 块预孵育活细胞。
注：理想的离心条件根据细胞类型和试剂容量有所不同。
一般，1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀下来。
01将所需数目的细胞分装入试管或小孔中。
（通常，每次检测用5x10^5至 1x10^6 个细胞）。
02通过离心使细胞沉淀下来，移除上清液。
03在100 µl 稀释的一抗中重悬细胞，这种一抗按建议的稀释度或如通过滴定所确定那样以抗体稀释缓冲液配制。
04在冰上孵育 30 分钟至 1 小时。
避光。
05在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中通过离心洗涤。
弃去上清液。
重复。
如果使用直接偶联抗体，则跳到步骤 9。
06在100 µl 稀释的荧光物质偶联的二抗（按建议稀释度用抗体稀释缓冲液制备）中重悬细胞。
07在冰上孵育 30 分钟。
避光。
08用抗体稀释缓冲液进行离心洗涤。
弃去上清液。
重复。
09在 200-500 μl 抗体稀释缓冲液中重悬细胞后用流式细胞分析仪进行分析。
流式细胞术实验方法
流式细胞术实验方法PI 染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。
2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。
3、加入2ml预冷的70%酒精，4℃固定30min，或是-20℃固定过夜。
4、离心，弃上清液。
5、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。
6、加入RNase A (工作浓度20ug/ml)于500ul 1×PBS中，37℃孵育30min，离心。
7、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。
8、加入PI(工作浓度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中，室温避光孵育30min。
9、混匀，过300目筛网，置流式管中， 4℃冰箱保存，待测。
GFP PI染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。
2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。
3、加入2ml预冷PFA，PFA的浓度根据细胞的特点进行调节，4℃固定30min。
以下步骤同PI 染色操作步骤的（4-9）细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。
2、以冷PBA 1ml，离心洗涤，弃上清液。
3、加入用PBA稀释的荧光素标记的抗体200ul。
用微量移液器轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min-1h。
4、离心弃上清液。
5、加入冷PBS1ml,离心洗涤2次，以除去未结合的多余抗体成分。
6、向细胞中加入冷PBS 500ul,吹打混匀，置流式管中，4℃避光保存，待测。
细胞表面间接免疫荧光染色操作步骤1-2、同细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤3、用PBA稀释的第一抗体200ul，对照管加入对应于一抗的正常实验动物IgG，轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育1、5-2h。
离心，弃上清。
4、 BS1ml离心洗涤1次，以去除多余的未结合的特异性抗体。
流式细胞术步骤
利用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡1. 细胞按每孔4 X105个的密度接种于60 mm细胞培养皿内，培养过夜后，用相应药物处理细胞。
（设置实验组和对照组，实验组依辛伐他汀浓度分为3组，2mol/L、5卩mol/L、10卩mol/L辛伐他汀组正常对照组（NC 组）：胰岛素终浓度0.058mg/LA组：辛伐他汀终浓度2 i mol/L+胰岛素终浓度0.058mg/L ;B组：辛伐他汀终浓度5 i mol/L+胰岛素终浓度0.058mg/L ;C组：辛伐他汀终浓度10 i mol/L+胰岛素终浓度0.058mg/L ;于37 C, 5%CO2培养箱中孵育48h）2. 胰酶消化收集细胞，并用1 mL PBS 缓冲液清洗剩余细胞一次，全部加入15ML 管中。
3. 800 rpm 离心5 分钟,去除上清,加5 mL PBS 缓冲液重悬细胞,再次离心弃上清,重复两次,最后重悬细胞于0.5mL PBS 中。
4. 用低速振荡器边震动边加入 5 mL预冷的70%乙醇，固定，4C过夜。
5. 次日将固定好的细胞以1000 rpm的转速离心5分钟，弃上清，加入4 mL PBS清洗一次，用0.4 mL PBS重悬细胞。
6. 加入5 此RNaseA （10 mg/ml）37 C消化1小时，加入终浓度50 mg/mL 碘化丙啶（propidium iodide PI ）4C避光染色过夜（或者37C避光染色1小时），在EPICS XL流式细胞仪上分析。
利用流式细胞抗体检测检测细胞膜表面蛋白的变化1.细胞按每孔4 X105个的密度接种于60 mm细胞培养皿内，培养过夜后，用相应药物处理细胞。
2．胰酶消化收集细胞,并用1 mL PBS 缓冲液清洗剩余细胞一次,全部加入15ML 管中。
3.800 rpm离心5分钟，去除上清，加5 mL PBS缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复两次,最后重悬细胞于0.1mL PBS 中,并转移到1.5 mL 离心管中。
流式细胞术实验报告
一、实验目的本实验旨在通过流式细胞术技术，对细胞群体进行快速、精确的分析和定量测定，研究细胞的物理与化学性质，并对细胞进行分类和分选。
通过本次实验，掌握流式细胞仪的工作原理，了解其在细胞生物学研究中的应用。
二、实验原理流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒逐个进行快速定量分析和分选的技术。
其基本原理是将经过荧光标记的细胞或微粒，在流动系统中以高速通过，同时利用激光束照射细胞，通过光散射和荧光信号来获取细胞的大小、形态、表面标记物等信息。
最后，通过数据分析和可视化展示，对细胞进行计数、分类和分析。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 细胞样本：小鼠脾细胞、Jurkat细胞- 荧光标记抗体：CD45-FITC、CD3-PE、CD4-APC- 溶液：磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）、荧光染料（如PI）2. 实验仪器：- 流式细胞仪（如BD FACS Calibur）- 离心机- 恒温培养箱- 移液器四、实验步骤1. 细胞制备：- 收集小鼠脾细胞或Jurkat细胞，用PBS洗涤后，调整细胞浓度为1×10^6个/mL。
- 加入荧光标记抗体，室温下孵育30分钟。
- 用PBS洗涤细胞两次，去除未结合的抗体。
2. 流式细胞术分析：- 将处理好的细胞加入流式细胞仪，设置合适的参数进行检测。
- 收集数据，进行细胞分类和分析。
3. 数据分析：- 利用流式细胞术分析软件（如CellQuest、FlowJo）对数据进行分析，包括细胞计数、分类、DNA含量分析等。
五、实验结果与分析1. 细胞分类：- 通过流式细胞术，成功将小鼠脾细胞和Jurkat细胞分为不同的亚群，如T细胞、B细胞等。
2. DNA含量分析：- 通过PI染色，检测细胞的DNA含量，发现小鼠脾细胞和Jurkat细胞均处于G0/G1期。
3. 表面标记物分析：- 通过CD45-FITC、CD3-PE、CD4-APC抗体检测，发现Jurkat细胞为T细胞，小鼠脾细胞中含有B细胞和T细胞。
流式细胞术操作规程
流式细胞术操作规程流式细胞术是一种常用的细胞分析技术，它可以用来检测和分析细胞表面标记物、细胞数量、细胞分布等信息。
以下是一份流式细胞术操作规程，详细介绍了该技术的操作步骤和注意事项。
一、实验前准备1. 准备所需的实验材料，包括流式细胞仪、标记抗体、孵育培养基、样本组织、显微镜片等。
2. 检查流式细胞仪的功能是否正常，确认仪器能够正常运行。
3. 清洁实验台面，确保操作环境干净整洁。
4. 准备所需的试剂和溶液，如PBS缓冲液、抗体染色溶液等。
二、样本处理1. 准备样本组织，将其转移到离心管中，并添加适量的孵育培养基使其完全浸泡。
2. 使用离心机将样本离心，去除上清液。
3. 重悬样本，将其转移到离心管中，并加入足够的PBS缓冲液进行洗涤。
4. 重复洗涤过程，直到样本完全洗净。
三、标记抗体染色1. 取出经过洗涤的样本，将其转移到离心管中，并加入足够的标记抗体溶液。
2. 在黑暗条件下孵育样本，使其与标记抗体充分结合。
3. 静置反应15-30分钟，确保充分染色。
4. 在光线和温度适宜的条件下冰冻样本，避免抗体的结合。
5. 根据实验需求，可以选择单标记或多标记抗体。
四、样本准备1. 取出经过标记抗体染色的样本，将其转移到离心管中，并加入足够的PBS缓冲液进行洗涤。
2. 将样本离心并去除上清液。
3. 重悬样本，并根据实验需要加入适量的PBS缓冲液进行稀释。
4. 检查样本的细胞数目和活性是否符合实验要求，如有必要，可以使用显微镜进行观察和计数。
五、流式分析1. 打开流式细胞仪，并确认仪器的设置和参数是否符合实验要求。
2. 调整仪器的流速和灵敏度，使其适应样本的特性。
3. 将样本转移至流式细胞仪的样本管中。
4. 开始流式细胞分析，记录并保存实验数据。
5. 根据实验需要，可以进行不同的数据分析和处理，包括细胞分布、细胞数量、表面标记物的表达等。
六、实验后处理1. 关闭仪器，清洁工作台和操作区域。
2. 处理和储存实验数据，可以使用相应的图像科学软件进行数据处理和结果分析。
流式细胞术实验报告
流式细胞术实验报告流式细胞术实验报告引言流式细胞术（Flow Cytometry）是一种广泛应用于生物学研究和临床诊断的技术。
它通过测量细胞在流动过程中的荧光信号，可以快速、准确地分析细胞的数量、大小、形态和功能等特征。
本实验旨在利用流式细胞术对细胞进行表型分析，并研究不同条件下细胞的变化。
材料与方法1. 细胞样本准备：从培养皿中取出细胞，用PBS洗涤，离心沉淀后，再用PBS 悬浮细胞，使其浓度达到所需的范围。
2. 细胞染色：将细胞悬浮液分装于离心管中，加入适量的荧光标记染料，轻轻摇匀，避免产生气泡。
3. 流式细胞术仪器设置：根据实验需要，调整流式细胞术仪器的参数，如激光功率、荧光信号检测通道等。
4. 样本检测：将细胞悬浮液注入流式细胞术仪器，开始检测。
记录细胞的散射信号和荧光信号，并设置相应的控制样本。
5. 数据分析：利用流式细胞术软件对获得的数据进行分析，包括细胞数量、比例、荧光强度等参数。
结果与讨论通过流式细胞术实验，我们成功地对细胞进行了表型分析，并观察到不同条件下细胞的变化。
以下是我们的结果和讨论。
1. 细胞数量和比例的变化我们首先对细胞数量和比例进行了分析。
结果显示，在不同处理条件下，细胞数量和比例存在显著差异。
例如，在处理A条件下，细胞数量明显增加，而在处理B条件下，细胞数量有所下降。
这表明不同条件对细胞生长和增殖有不同的影响。
2. 细胞大小和形态的变化我们进一步分析了细胞的大小和形态的变化。
通过测量细胞的散射信号，我们可以得到细胞的大小和形态信息。
结果显示，在处理A条件下，细胞的大小明显增加，形态变得更加圆润。
而在处理B条件下，细胞的大小和形态相对稳定。
这可能与处理A条件下的细胞分化和增殖有关。
3. 荧光信号的变化我们还对细胞中特定蛋白的表达进行了分析。
通过标记特定蛋白的荧光染料，我们可以测量细胞的荧光信号强度。
结果显示，在处理A条件下，特定蛋白的表达明显上调，而在处理B条件下，特定蛋白的表达下调。
最详细的流式细胞仪实验方法
最详细的流式细胞仪实验方法流式细胞仪实验方法一、实验准备1．标本制备：2．最小化非特异性结合：二、凋亡1．凋亡的检测方法：网站和其它2．PI染色法3．Annexin V 法4．TUNNEL法三、细胞因子1．激活的细胞因子2．CBA四、血小板1．活化2．活化检测3．网织血小板五、红细胞1．网织红细胞2．PNH3．胎儿红细胞六、肿瘤学1．DNA 细胞周期2．蛋白3．多药耐药4．微小残留白血病第一部分标本处理一、流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。
孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。
本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。
虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。
(二)间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。
本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。
但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。
所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。
另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。
二、最小化非特异性结合的方法1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。
2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。
流式细胞术操作步骤
流式细胞术检测脾脏CD4+、CD8+
一、准备实验：
1640、PBS缓冲液、铜网、小平皿、剪刀、镊子、离心管、红细胞裂解液、枪头、抗体、细胞计数板、杀鸡用大剪刀、1ml注射器
二、实验操作步骤：
1、取一小块雏鸡脾脏，放入装有1ml 1640的1.5ml离心管中
2、铜网+平皿中加入1ml 1640
3、将脾放入铜网中，磨脾
4、吸取磨好的脾汁放入1.5ml离心管中，离心2000r,5min
5、弃去上清，向脾汁沉淀中加入500µl红细胞裂解液，混匀作
用3min,离心2000r 5min
6、若离心后得到沉淀不变白可重复上述操作
7、裂解完成，离心完成，弃去上清，向试管中加入1ml PBS混匀
8、向1.5ml离心管中加入490µLPBS，再加入10µL步骤7脾汁，
计数
9、取106个细胞加PBS定容至100µL，此处用1.5ml离心管
10、向细胞悬液内加入抗体，每只鸡两管细胞悬液，每管10µL
11、4℃避光保存45min
12、向细胞悬液中加入1mlPBS 2000r 5min
13、弃上清，向管中加入200µL PBS 上机。
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10 4
FL4 -->
%+ 48 peak 501 mcf 79
A CLASSIC CASE OF NON- SPECIFIC BINDING
RPCI LFC
WHAT IF IT IS OFF SCALE? DO I NEED TO DILUTE?
900
0 10
0 10
10 1
10 2
10 3
10 4
FL4 -->
%+ 70
mcf 82
10 1
10 2
10 3
10 4
FL4 -->
%+ 70
mcf 79
10 1
10 2
10 3
10 4
FL4 -->
%+ 70
mcf 65
10 1
10 2
10 3
10 4
FL4 -->
%+ 68
mcf 51
Resolution = 128
100
LESS THAN 1% BOUND
80
percent free
60
40
107
10-8
10-9
10-10
Affinity Constant (L/M)
VIRTUALLY ALL BOUND
10-11
ANTIBODY BINDING TO MEMBRANE ANTIGENS
1000 10
MEASURED BINDING
AMOUNT BOUND (ng/ml)
1 0.1 0.01 0.001
SPECIFIC BINDING Ka = 5 x 108
NON-SPECIFIC BINDING Ka = 5 x 104
0.0001
0.01
0.1
1
10
ANTIBODY (mg/ml)
100
1000
ANTIBODY BINDING TO INTRACELLULAR ANTIGENS
Non Specific:
binding is low affinity and not saturable
RPCI LFC
ANTIBODY PURITY
10000
1000
Figure A
Figure B
1000 100
100
10 10
MCF MCF
1 1
10
102
103
104
105
106
107
1 1
IgM IgG1
IgA
IgG2a
IgG2b
IgD IgG2c
IgE
IgG3
THE LAW OF MASS ACTION
Ab + Ep Kf AbEp Kd
RATE f = Kf x[Ab] [Ep] RATE d = Kdx[AbEp] Kf range is usually ~ 106 Kd range is usually ~ 10-3 Ka = Kf/Kd = 106/10-3 = 109
1000
ANTIBODY BINDING TO INTRACELLULAR ANTIGENS HIGH AFFINITY ANTIBODY
10 2
MEASURED BINDING
10
AMOUNT BOUND ( ng /ml)
1 0.1 0.01 0.001
SPECIFIC BINDING Ka = 5 x 10 9
170
150
130
Number
110
Number
Number
0 10 30 50 70 90 110 130 150 170 190 210 230 250
110 130 150 170 190 210
Number
90
70
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
90
70
50
50
30
30
Another reason to determine the titer is to verify that it does not exhibit a non-specific binding component at the suppliers recommended amount. Depending on the supplier, the recommended amount to use may be the wrong amount to use.
OSWE L
RP L ARK
Laboratory
Cancer Institute
of
Flow
Cytometry
IMMUNOPHENOTYPING
Los Alamos 2001
lab
OSWE L
RP L ARK
Laboratory
Cancer Institute
of
Flow
Cytometry
CC Stewart & SJ Stewart stewarts@
ANTIBODY BINDING TO CELLS
RPCI LFC
ANTIBODY STRUCTURE
Light Chain
Kappa or Lambda
s
Fab
s
s s
papain pepsin
Fc
s s
Fab
s
s
Heavy Chain
1000 EPITOPES/ANTIGEN 2 LIGHT CHAINS 9 HEAVY CHAINS 20,000 CLONES
CELLS IN A PROPERLY TITERED ANTIBODY
RPCI LFC
WHAT TITER DO YOU CHOOSE?
Recommended amount
R5
1/4 dilution
R5
1/16 dilution
R5
1/64 dilution
R5
110 130 150 170 190 210
WHAT TITER DO YOU USE?
Recommended
amount
R2
1/4 dilution
R2
190
1/16 dilution
R2
190
1/64 dilution
R2
170
170
150
150
110 130 150 170 190 210
110 130 150 170 190 210
RPCI LFC
Ka=1011
Ka=1010 Ka=109 Ka=108 Ka=107
1 x 10-11 1 x 10-10 1 x 10-9 1 x 10-8 1 x 10-7
EFFECT OF AFFINITY CONSTANT ON ANTIBODY BINDING AT 50% SATURATION
AT EQUILIBRIUM RATE f = RATE d = 0 and
[AE]=Ka[Ab][Ep]/(1+Ka[Ab])
WAYS ANTIBODIES BIND TO CELLS Specific:
Fab to epitope Fc to Fc receptor binding is high affinity and saturable
1000
100
MEASURED BINDING
AMOUNT BOUND (ng/ml)
10
1
SPECIFIC BINDING
Ka = 5 x 108
0.1
NON-SPECIFIC BINDING
Ka = 5 x 104
0.01
0.001
0.001
0.01
0.1
1
10
ANTIBODY (mg/ml)
100
10 3
10 4
FL1-Height -->
%+ 26 mcf 62
10 1
10 2
10 3
10 4
FL1-Height -->
%+ 17 mcf 66
10 1
10 2
10 3
10 4
FL1-Height -->
%+ 16 mcf 64
Resolution = 128
THE BEST ISOTYPE CONTROL IS THE NEGATIVE
R5
140
120
120
130
110
110
Number
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
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0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
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STORING OF ANTIBODIES :
Proteases destroy antibodies in: • ascitic fluid • serum • bacteria
Use sodium azide Use highly purified albumin or gelatin as carrier Purify antibodies immediately
Thus, the only time you would not have to titer the antibody is if it is being used as a single reagent or, if a combination, the supplier has provided appropriate documentation of its performance characteristics on relevant surrogate targets.