流式细胞术实验方法及应用
组织做流式细胞术实验步骤
组织做流式细胞术实验步骤流式细胞术，这名字听上去有点高大上，其实就是一种检测细胞的小工具，能帮我们数一数细胞的数量、类型，甚至能看看细胞里发生了什么“八卦”。
今天，我就给大家轻松聊聊怎么做这个实验，别担心，不会让你觉得像是在读教科书！1. 实验准备1.1 材料准备首先，咱们得准备好所有的材料，像做饭一样，先把菜都切好了。
你需要的有：流式细胞仪、细胞悬液、抗体、PBS（磷酸盐缓冲液）和一些其他的小玩意儿。
话说回来，细胞悬液就像是咱们的主菜，抗体呢，就像是调料，能帮我们把细胞“调”出不同的口味。
记得提前检查一下，别到时候缺了盐（抗体），结果菜就没法做了！1.2 设备调试设备调试这事儿，虽然听上去有点麻烦，但其实就像给车子加油一样。
把流式细胞仪打开，检查一下它的设置，看看有没有故障。
你可不能指望它像“超人”一样自动工作，得稍微照顾一下。
调整好激光和光电探测器，这可是流式细胞术的“面子工程”，咱们要让它看起来专业一点嘛！2. 实验步骤2.1 细胞制备准备好了材料后，就可以开始“烹饪”了。
首先，将细胞悬液取出，轻轻摇晃，让细胞均匀分布。
记得别用力过猛，像对待婴儿一样轻柔，不然细胞就容易“受伤”。
接下来，加入适量的抗体，确保每个细胞都能得到“调料”的滋润。
这一步就像是在给细胞穿衣服，让它们打扮得漂漂亮亮的。
2.2 孵育与洗涤完成了“穿衣”，咱们得给它们一点时间孵化，就像煮汤一样，让它们入味。
把细胞悬液放在37摄氏度的温箱里，大概30分钟到1小时，耐心点，别急！这时候可以做点其他的准备，省得等得无聊。
时间到了，记得把细胞拿出来，加入PBS洗涤，洗去多余的“调料”。
再用离心机把细胞沉淀下来，这个步骤可得小心翼翼，别让细胞“跑”了。
3. 数据采集3.1 设置流式细胞仪现在，我们终于可以进入大戏的最后一幕了！将洗涤好的细胞悬液放入流式细胞仪中，设置好参数。
这一步就像是给细胞上场前的最后准备，调好焦距，亮度，确保它们在仪器面前能“光芒四射”。
FCM(流式细胞术检测)原理及临床应用
流式细胞术(flow cytometry FCM)是利用流式细 胞仪对单个生物颗粒(红细胞、白细胞、各类组织细 胞、血小板、微生物等)以及人工合成微球的物理和 生物学特性进行多参数定量分析，并能对特定细胞 群体加以分选的分析技术。
FCM的工作原理
流式细胞仪组成：
1.液流系统 2.光学系统 3.数据处理系统
双标记或多标记分析：目前使用的流式细胞仪 能用一个激光束激发检测三色甚至四色荧光信 号。检测时需注意荧光补偿。
常用免疫荧光染料组合
荧光染料 FITC+PE
激发波长 （nm）
488
发射波长（nm） 525、575
颜色 绿色、橙色
FITC+PeCy5
488
525、675
绿色、红色
FITC+ECD
488
实体瘤以多倍体居多；
G0 期：DNA 合成静止期 G1 期：DNA 合成前期 S 期： DNA 合成期 G2 期：DNA 合成后期 M 期： 细胞分裂期
DNA 倍体 2N 2N
2N-4N 4N 4N
DNA非2倍体出现是鉴别良性与恶性肿瘤的特异性指 标:
良性肿瘤和正常组织良性增生不出现DNA非2倍体细 胞而恶性肿瘤常可出现异倍体细胞；
过去认为 FCM测定残存白血病细胞不可靠， 因为现用的 McAb不能鉴别正常血细胞与白血 病细胞。虽然至今尚未发现白血病细胞特异抗 原，但近来有人提出根据白血病细胞的以下特 征， FCM检测的敏感度可明显提高
白血病细胞的某些抗原表达量明显高于相应 的正常血细胞
如小儿ALL，其CDl0+细胞的荧光强度可 高达3-4个对数值，而其 CD45则为弱阳性或 阴性。
525、625
流式细胞术实验技巧及数据分析讲解
荧 光
Uncompensated vs Compensated
补
偿
FL2
FL1
利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻
荧光通道的信号加以扣除的方法称“荧光补偿”
荧光补偿
Mean值判断补偿
双或多参数荧光抗体的组合标记
荧光染料
激发波长（nm) 发射波长（nm)
颜色
FITC+PE
488
FITC+T red
低速
高速
不同样本速率形成的样本流
激发光源与光束成形系统
光
束
聚焦距离
成
形
与 激光束
.
细
聚焦透镜
胞
这种椭圆形 20um 光斑的检测
受
区保证每个
照
64um
细胞分别受
方 式
强度
到光照且受 检时受到一 致的光照
FCM的单细
32um 0 32um
胞照明技术
荧 光 光 谱 重 叠
FITC和PE荧光光谱重叠
培养细胞 新鲜组织 石蜡包埋
单细胞悬液 制备
荧光抗体标记
上机检测
表型测定 细胞分选
统 计 学 分 析
FISH PCR
继 续 培 养
单 分 散 细 胞
FSC
FSC信号的强弱与细胞的大小和活力相关
SSC
SSC信号的强弱与细胞内颗粒多少相关
细胞散色光信号
细胞荧光测量
细胞的自发荧光 未经染色的样品细胞
在激发光的照射下可测到有微弱的荧 光信号.
细胞的特异性荧光 经过各种特异染色的
细胞在激发光的照射下可测到较强的荧光 信号.
自发荧光信号与特异染色的荧光信号分析图 自 发 荧 光 信 号
流式细胞术操作规程
流式细胞术操作规程流式细胞术是一种常用的细胞分析技术，它可以用来检测和分析细胞表面标记物、细胞数量、细胞分布等信息。
以下是一份流式细胞术操作规程，详细介绍了该技术的操作步骤和注意事项。
一、实验前准备1. 准备所需的实验材料，包括流式细胞仪、标记抗体、孵育培养基、样本组织、显微镜片等。
2. 检查流式细胞仪的功能是否正常，确认仪器能够正常运行。
3. 清洁实验台面，确保操作环境干净整洁。
4. 准备所需的试剂和溶液，如PBS缓冲液、抗体染色溶液等。
二、样本处理1. 准备样本组织，将其转移到离心管中，并添加适量的孵育培养基使其完全浸泡。
2. 使用离心机将样本离心，去除上清液。
3. 重悬样本，将其转移到离心管中，并加入足够的PBS缓冲液进行洗涤。
4. 重复洗涤过程，直到样本完全洗净。
三、标记抗体染色1. 取出经过洗涤的样本，将其转移到离心管中，并加入足够的标记抗体溶液。
2. 在黑暗条件下孵育样本，使其与标记抗体充分结合。
3. 静置反应15-30分钟，确保充分染色。
4. 在光线和温度适宜的条件下冰冻样本，避免抗体的结合。
5. 根据实验需求，可以选择单标记或多标记抗体。
四、样本准备1. 取出经过标记抗体染色的样本，将其转移到离心管中，并加入足够的PBS缓冲液进行洗涤。
2. 将样本离心并去除上清液。
3. 重悬样本，并根据实验需要加入适量的PBS缓冲液进行稀释。
4. 检查样本的细胞数目和活性是否符合实验要求，如有必要，可以使用显微镜进行观察和计数。
五、流式分析1. 打开流式细胞仪，并确认仪器的设置和参数是否符合实验要求。
2. 调整仪器的流速和灵敏度，使其适应样本的特性。
3. 将样本转移至流式细胞仪的样本管中。
4. 开始流式细胞分析，记录并保存实验数据。
5. 根据实验需要，可以进行不同的数据分析和处理，包括细胞分布、细胞数量、表面标记物的表达等。
六、实验后处理1. 关闭仪器，清洁工作台和操作区域。
2. 处理和储存实验数据，可以使用相应的图像科学软件进行数据处理和结果分析。
直接和间接流式细胞术实验方案
直接和间接流式细胞术实验方案请关注：↑Abcam 助您更快实现研究使命直接流式细胞术实验方案采用偶联一抗的流式细胞术的一般步骤。
收集、清洗细胞，并用冰冷的 PBS、10% FCS、1% 叠氮化钠调节细胞悬液浓度至 1-5 x 106 细胞/mL。
通常使用聚苯乙烯圆底 12 x 75 mm2 Falcon 管进行细胞染色。
但是，任何可用于离心的容器均可用于细胞染色，例如试管、eppendorf 管以及 96 孔圆底微量滴定板。
一般而言，细胞应进行充分离心，以除去上清液并保证细胞损失最小，同时细胞容易重悬。
我们建议使用冰冷的试剂/溶液进行染色，或在 4 °C 条件下操作，因为低温和叠氮化钠的存在可以防止表面抗原的调节和内化。
内化会导致荧光强度的损失。
添加 0.1-10 μg/mL 偶联一抗。
如有需要，可使用 3% BSA/PBS 稀释（也可在此时加入碘化丙啶以排除死细胞）。
在室温或 4°C 下避光培养 30 分钟。
此步骤需要进行优化。
清洗细胞三次，并在 400 g 离心力下离心五分钟，然后重悬于 500 µL 至 1 mL 冰冷的 PBS、10% FCS 及 1% 叠氮化钠中。
将细胞避光保存于冰上，或放入 4°C 冰箱中，待使用时再取出用于分析。
为获得最佳结果，应尽快使用流式细胞仪分析细胞。
abcam 2018-07-05abcam 此为临时链接，仅用于预览，将在短期内失效。
我们建议当天进行分析。
细胞的所需保存时间较长（16 小时）或需要配合细胞仪的分析计划时，可此为临时链接，仅用于预览，将在短期内失效。
以使用 1% 多聚甲醛重悬细胞，以防坏死。
固定：如果等待时间超过 1 个小时，可在步骤 3 后固定细胞。
这样，细胞可以保存数天。
（这可以使光散射更加稳定，并使大多数生物性危害因子失活）。
对照物也需采用相同步骤进行固定。
如果需要保持细胞活力，则不要进行固定。
固定方法有很多种，具体可参见间接染色实验方案的固定部分。
tbnk流式细胞术 标准
tbnk流式细胞术标准
TBNK流式细胞术是一种用于检测外周血单个核细胞中T细胞、B细胞、NK细胞等免疫细胞的检测方法。
在进行TBNK流式细胞术时，需要遵循以下标准：
1.样本采集和处理：采集外周血样本，用肝素抗凝，分离外周血单
个核细胞，并用抗体标记。
2.抗体标记：选择相应的抗体标记物，包括CD3、CD4、CD8、CD19、
CD56等，以检测T细胞、B细胞、NK细胞等免疫细胞。
3.流式细胞仪检测：将标记好的细胞样本通过流式细胞仪进行检测，
获取每个细胞的表面抗原表达情况。
4.数据分析：通过数据分析软件对获取的数据进行处理和分析，计
算各种免疫细胞的百分比和数量。
在进行TBNK流式细胞术时，需要注意以下几点：
1.抗体标记物的选择：应根据具体的实验目的和要求选择相应的抗
体标记物，以确保检测结果的准确性和可靠性。
2.样本处理和细胞分离：应尽可能地保证样本的质量和细胞的完整
性，以确保检测结果的准确性。
3.数据分析：应对获取的数据进行准确的分析和处理，以得出正确
的结论。
总之，TBNK流式细胞术是一种非常有用的免疫学检测方法，可以用于检测外周血单个核细胞中T细胞、B细胞、NK细胞等免疫细胞的
数量和功能，对于疾病的诊断和治疗具有重要的意义。
trm细胞流式
trm细胞流式1. TRM细胞的定义和特征TRM细胞是一种富集在组织中的CD8+ T细胞亚型，其主要功能是提供对特定病原体的局部保护。
与循环中的T细胞不同，TRM细胞在感染或炎症后留在组织中，并具有长期“记忆”功能，可以快速应对再次感染。
TRM细胞的主要特征包括：- 表达CD69和CD103等细胞表面标志物，这些标志物有助于TRM细胞在组织中定居并识别特定抗原；- 具有较少的淋巴结极，这导致它们在组织中的富集并且更容易与局部抗原相互作用；- 具有细胞毒性效应，并能够在组织中清除感染的病原体。
2. TRM细胞流式细胞术的基本原理TRM细胞流式细胞术是一种通过利用荧光标记的抗体和细胞分选技术来分析和表征组织内TRM细胞的方法。
其基本原理是将组织细胞通过切碎和胶酶消化等方法分离开来，然后用荧光标记的抗体对细胞进行染色，最后通过流式细胞术来分析这些细胞的表型、浓度和功能。
在TRM细胞流式细胞术中，通常使用的荧光标记的抗体包括CD69、CD103、CD45RO等可以标记TRM细胞的特定抗体。
这些抗体会结合到TRM细胞表面的相应受体上，使得TRM细胞能够通过流式细胞仪进行检测和分析。
通过比较TRM细胞和其他T细胞的表型和功能差异，科学家们可以更好地理解TRM细胞在免疫反应中的作用。
3. TRM细胞流式细胞术的方法TRM细胞流式细胞术是一个多步骤的实验过程，需要精心设计和操作。
其主要步骤包括：- 组织取样：首先需要从动物或人体组织中取得所需的组织样本，例如皮肤、肠道等；- 细胞分离：将组织样本分解成单细胞悬液，可以通过胶酶消化等方法来分离细胞；- 细胞染色：使用荧光标记的抗体对细胞进行染色，以标记TRM细胞和其他细胞亚型；- 流式分选：将染色后的细胞放入流式细胞仪中进行分选，分析TRM细胞的表型和功能。
流式细胞仪是一种专门用于分析单个细胞的仪器，通过流式细胞仪可以快速检测数百万个细胞的表型和功能。
在TRM细胞流式细胞术中，流式细胞仪可以帮助科学家们快速、准确地分析TRM细胞的数量、表面标志物表达水平和功能状态。
组织流式细胞术实验步骤
组织流式细胞术实验步骤流式细胞术，这个名字听上去挺高大上的，但其实说白了，就是通过一个个小细胞的“选秀”来分析它们的特性。
想象一下，你在一个音乐会上，乐队的每位成员都在独奏，你要仔细听出谁的音色最好，谁的节奏最稳。
这就是流式细胞术的工作原理！接下来，让我们一起揭开它的神秘面纱，看看如何在实验室里“开一场音乐会”。
1. 准备工作1.1 材料准备首先，咱得准备好材料，就像做菜前先把所有食材备齐一样。
你需要细胞样本，这可能是从组织中提取的，或者是培养的细胞。
再来就是流式细胞仪，简单来说，就是能让细胞“过一遍审”的高科技设备。
别忘了，荧光染料也很重要，想让细胞发光，吸引目光，得用上它们。
1.2 实验环境接下来，环境也不能忽视。
实验室里要保持干净整洁，像个“五星级饭店”那样，这样才能保证实验结果的可靠性。
穿上实验服，带上手套，就像去参加盛大的晚会，准备好接受每一个细胞的挑战。
2. 细胞准备2.1 细胞分离细胞准备是关键，想要精准的结果，细胞得分离得干干净净。
这一步可以使用酶消化或者机械分离的方法。
想象一下，你在挤一个果汁，得把果肉和汁分开，才能喝到清爽的饮品。
把细胞分开后，别忘了把它们洗干净，洗去多余的杂质，让它们以最好的状态“登台表演”。
2.2 染色处理然后就是染色，给细胞穿上漂亮的“衣服”。
选择合适的荧光染料，对照你的实验目标，像挑选晚会的礼服一样小心翼翼。
染色后，让细胞静置一会儿，充分吸收荧光剂。
这里的等待就像泡茶，得让茶香四溢，才能品出好滋味。
3. 流式细胞仪操作3.1 设定参数现在进入流式细胞仪的操作环节，咱们可得认真对待。
这就像开车，得先调好座椅、后视镜，设置好各种参数。
选择合适的激光波长和检测通道，确保能捕捉到细胞的“精彩瞬间”。
这时，仪器就像你的搭档，你们一起配合，向细胞们发起挑战。
3.2 数据采集与分析最后，启动流式细胞仪，细胞们开始在“舞台”上穿梭。
随着每个细胞通过激光，仪器会收集到它们的光散射信息。
流式细胞术原理及应用 ppt课件
– 荧光蛋白-如GFP、RFP、YFP、CFP、mCherry、DsRed等，自身发荧 光。
ppt课件
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常用荧光素
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常用荧光染料
• PI（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于 DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI 不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
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• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
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粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
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• 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信 号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的 死细胞。
•横坐标：道数
•横坐标：某细胞参数
•纵坐标：细胞数
相对含量
•纵坐标：该细胞另一
参数含量
等高线图（Contour Plot）
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细胞分选系统
• 电荷式分选 超声振动器(15-100kHz) 液流充电系统 高压偏转板 收集装置(流式管、离心 管、培养板、载波片等)
MACS ®技术：Magetic Activated Cell Sorting 免疫学+细胞生物学+磁力学
RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
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三、如何设计流式实验
准备工作： •确定实验要检测的marker •选择合适的荧光素标记的抗体 •选择合适的同型对照抗体
小鼠脑细胞提取流式
小鼠脑细胞提取流式引言：流式细胞术是一种常用的实验技术，可以对细胞进行高通量的分析和筛选。
在神经科学研究中，对小鼠脑细胞进行提取和分析是非常重要的一步。
本文将从提取小鼠脑细胞的方法、相关实验步骤以及结果分析等方面进行介绍，以帮助读者更好地理解和应用流式细胞术。
一、方法1. 小鼠脑组织的收集：a. 使用无菌手术器械将小鼠的头部固定并取出脑组织。
b. 将脑组织置于含有冷离心缓冲液的离心管中，并尽快将其置于冰上冷却。
2. 细胞溶解：a. 将脑组织取出后，在无菌条件下将其切碎，加入含有酶解液的离心管中。
b. 将离心管置于37摄氏度的恒温水浴中，进行细胞酶解。
3. 细胞过滤：a. 使用细胞过滤网将酶解后的细胞悬液过滤。
b. 将过滤后的细胞悬液置于离心管中，进行离心。
4. 细胞洗涤：a. 将离心后得到的细胞沉淀加入含有冷离心缓冲液的离心管中。
b. 进行洗涤，去除残留的酶解液和细胞碎片。
5. 细胞计数：a. 使用细胞计数板或自动细胞计数仪对提取的小鼠脑细胞进行计数。
b. 记录细胞数目，以备后续实验使用。
二、实验步骤1. 样本准备：a. 准备正常小鼠脑组织样本。
b. 按照上述方法提取小鼠脑细胞。
2. 细胞标记：a. 准备适当的抗体，用于标记感兴趣的细胞亚群。
b. 将提取的小鼠脑细胞与抗体进行孵育，使其发生特异性结合。
3. 流式细胞仪检测：a. 将标记后的细胞悬液注入流式细胞仪。
b. 设置合适的仪器参数，进行细胞检测和数据采集。
4. 数据分析：a. 使用流式细胞仪分析软件对采集到的数据进行分析。
b. 根据细胞标记的结果，对不同细胞亚群进行定量和定性分析。
三、结果分析通过流式细胞仪的检测和数据分析，我们可以得到关于小鼠脑细胞的丰富信息。
例如，我们可以分析不同细胞亚群在脑组织中的比例，以及它们在不同条件下的变化。
此外，通过进一步的数据分析，我们还可以探究细胞间的相互作用和信号传导机制。
结论：提取小鼠脑细胞并进行流式细胞分析是神经科学研究中的重要一步。
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2. 细胞浆或核内抗原标记法 收集单细胞悬(1×106)+固定剂A 去固定液 破膜剂B及抗体
任意门、矩形门
线性门
四象门
多重逻辑门：当一种细胞有两种以上的参数需要被 分析时，常需要设多个门，各门之间由此出现逻 辑关系，此种设门技术称为多重逻辑门或联合门。
淋巴细胞
T淋巴细胞（CD3+）
CD3+CD8（CD4+）
IFN-r
IL-4
数据显示采用的图:散点图、直方图、密度图 和二维等高图等。最常用的为单参数直方图 和双参数散点图。
室温，15 min 室温，15 min
洗涤
PBS洗涤1次
上机分析（1% 多聚甲醛固定）。 3. 细胞表面和细胞内抗原同时标记 在流式分析中通常需要细胞膜表面和细胞 内同时标记，首先标记表面抗原，然后再对细胞 膜和核膜进行固定破膜后再标记胞内或核内抗原。 常见细胞破膜剂：
0.05%皂角素、0.1%曲拉通 (Triton X-100)、70%乙醇、 商品化固定破膜剂（A、B）。
100目钢筛网过滤 1000r/min，5min PBS 洗2次
300目尼龙网 单细胞悬
5. 脱落细胞单细胞悬液的制备
包括：
尿液脱落细胞
胸水、腹水脱落细胞 冲洗液脱落细胞
收集胸水、腹水、尿液、冲洗液 沉淀 取底部10-20ml 300目尼龙滤网过滤 收集方法、沉淀时间
臵 4℃ 冰箱中 PBS洗 3 次
四色分析：三色分析+ECD DNA含量分析： PI 凋亡与坏死分析： 凋亡用Annexin V-FITC/PI双染
四、标本的收集、单细胞悬液的制备
骨髓、外周血、细胞株、组织器官、 胸水、腹水、尿液脱落细胞等
1、骨髓及外周血细胞单细胞悬液的制备
骨髓及外周血都是天然的单个细胞，可直接标记， 再溶血。 单细胞的分离制备 分离液 离心 血液+生理盐水
体时，将DNA含量直
方图分为三部分，
G0/G1 (2C)
S (2C→4C)
即G0/G1、S、G2/M
三个细胞峰。
G2/M G2/M
(4C) (4C)
方法：
细胞悬液（1*106） 70%冰乙醇
4º ，24h C
离心去固定液
30min
PBS洗2次
PI
避光,30min
RNase
上机
PBS洗1次
采集10000细胞，MultiCycle软件进行细胞
流式细胞术实验方法及应用
何玉萍
科研型
分选功能 488nm激光
Our weapon：EPICS ALTRA Flow Cytosorter
四色荧光
(525、575、610
、675nm）
一、流式细胞术的原理
流式细胞仪的发展起源于细胞计数自动化的 研究。其原理是被荧光染色的单细胞或颗粒， 经过高速的液流系统形成细胞柱，排列成单细 胞依次通过流动室，在激光照射区域，携带荧 光素细胞受激发产生不同的荧光信号，这些荧 光信号可以反映细胞的生物特性。
周期分析
G0/G1 (2C)
S (2C→4C) G2/M (4C)
当人体癌变或者具有恶性潜能的癌前病变时， 在其发生、发展过程中可伴随有细胞DNA倍体及S期 的改变（异倍体） 恶性肿瘤细胞增殖周期的判断： S>10、G2/M>15或S>20、G2/M>5
2、 淋巴细胞亚群分析
白细胞分化抗原（CD分子）的命名：
藻红蛋白（PE）
碘化丙啶（PI） 藻红蛋白偶联物（PECY5） 藻红蛋白偶联物（PECY7） 别藻青蛋白（APC）
488
488 488 488 633
575（橙）
610（红） 667（红） 767（红外） 660（红）
别藻青蛋白偶联物 （APC-CY7）
633
767（ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ外）
2. 要有高的光子产量---提高信号强度。
PBS洗一次
抗体:
上机分析
CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE-CY5三标抗体
CD19-PE/CD3-FITC二标抗体 CD16+56-PE/CD3-FITC二标抗体
激光
前向散射
FALS Sensor
Freq
Fluorescence
侧向散射，荧光信号
FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
近30年来流式细胞术在我国得到很 快的发展，应用范围不断增大。目前， 流式细胞术作为一门生物检测技术广泛 应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞 遗传学、细胞生物学、生物化学等临床 医学和基础医学研究领域。
生理盐水
1000r/min，5min
300目尼龙网过滤
离心
研磨法
组织块洗去血液 单细胞悬液。 研磨器研至匀浆 离心 100目钢筛网 PBS洗2次 300目尼龙网过滤
1000r/min，5min
4. 石蜡包埋组织单细胞悬液的制备
手术获得的新鲜实体组织，常要送病理石蜡包 埋处理，这些标本也可用于流式细胞术的检测。
CD3+
CD3+CD8+ CD3+CD4+
NK+/CD3-
CD（16+56）+/CD3+ （T-cell）
NK细胞: CD(16+56)+/CD3-
CD19+/CD3-
CD19+/CD3+ （T-cell）
B淋巴细胞: CD19+/CD3-
外周血淋巴细胞亚群标记方法（表面标记）
50ul+10ul相应抗体 避光孵育15min 室温10min 加OptiLyes C溶血素250ul
FSC
SSC
九、流式细胞术的应用及标记方法
1、DNA含量分析 意义：肿瘤的早期诊断，肿瘤的良恶性判断，观察细胞的 增殖状态及细胞周期分布。 正常生物细胞，DNA含量随着细胞增殖周期时相而发 生变化。即G0/G1期（2C）、S期（2C→4C） G2/M期 （4C）。
2C→4C
2C
4C
FCM进行细胞周期DNA含量分析时，需要对 DNA进行染色，DNA染料（PI）与DNA结合具有特 异性，有一定量效关系，即DNA含量的多少与荧 光染料的结合量成正比，荧光强度与DNA吸收荧 光分子多少成正比。FCM分析一个 细胞群周期与DNA倍
流式细胞结合单克隆抗体技术能准确分类 计数淋巴细胞亚群，被认为是血液中淋巴细胞 免疫表型分析的标准方法。血液淋巴细胞是一 群特异性极强的细胞，根据淋巴细胞的功能及 膜表面标志，主要分为T淋巴细胞(CD3+)、B淋 巴细胞(CD19+)、NK细胞(CD16+56+/CD3-)三个 亚群。
T淋巴细胞（CD3+） 淋巴细胞 B淋巴细胞（CD19+） NK细胞（CD16+56）+
剪成小块 PBS 洗2次
剪至浆状
制备仪
2-3min
300目尼龙网过滤
离心
剪碎法
1000r/min，5min
单细胞悬液。
吸管轻轻吹打
组织块洗去血液
100目钢筛网过滤 300目尼龙网过滤 离心 1000r/min，5min PBS 洗2次 单细胞悬液。
网搓法
组织块洗去血液 收集滤液 PBS 洗2次 100目钢筛网轻搓 单细胞悬液。
醇乙脱水： 70％→80%→90％→ 95% →100%醇乙→二甲苯→石 蜡包埋 脱蜡水化： 二甲苯脱蜡→ 100％醇乙 →90%→80%→70％→50％ →蒸馏水
石蜡包埋组织制备 单细胞悬液
石蜡包埋组织切片
乙醇，蒸馏水
二甲苯脱蜡 胰蛋白酶
1-2天
水化
组织器官
37℃，15-30min
冰PBS 过滤 离心 液
1982年世界卫生组织和国际免疫学会联合会， 将所有抗体根据白细胞分化抗原反应性的类型划 分为25群，把每一群抗体称为一个分化抗体群 (Cluster of Differentiation，CD)，进行编号、 命名，即为单克隆抗体的国际命名法。由CD抗体 群识别的分化抗原就称为CD分子。目前已有339个 分化抗体群被鉴定并命名
六、荧光染色对照设臵(空白对照
同型对照 )
、阳性对照、阴性对照、
1、空白对照
用缓冲液（PBS）代替单克隆抗体进行实验
2、阳性染色对照 用现有试剂和方法检测已知表达某种特 异性抗原的细胞即为阳性细胞。如检测血小板CD62P时， 可用被ADP诱导活化血小板作为CD62P检测的阳性对照细 胞。
3.阴性染色对照已知不表达某种抗原的细胞即为阴 性细胞群，如CD3/CD19双染检测健康人血液淋巴 细胞亚群时，应有一群不表达这两种抗原的双阴 性细胞群（主要是NK细胞），可作阴性对照。 4. 同型对照 与染色的单克隆抗体特异性无关的免 疫球蛋白亚型，如IgG-FITC、IgG-PE
2500r/min，20-30min
单个核细胞
单核细胞: 利用单核细胞在短时培养贴壁快 的特性（30-40min），可采用短时培 养获得较纯的单核细胞.
2、培养细胞样品的制备(贴壁细胞)
培养板
胰蛋白酶
吸去培养液
37℃，室温，3-5min
PBS洗2次
含血清的培养基
吹打
PBS洗2次
单细胞悬液。
3. 组织器官单细胞悬液的制备
抗与待测标本反应后，洗去未结合抗体再加