福际迈好成功第一步-核酸分离纯化
核酸提取纯化方法
核酸提取纯化方法核酸提取纯化是分子生物学研究中的基础步骤之一，该步骤的目的是从生物样本中提取出高质量、高纯度的核酸样本，以便进行后续实验。
在进行核酸提取纯化时，需要注意一些关键的因素，例如使用适当的酶、缓冲液和试剂，选择合适的提取方法和纯化方法等。
本文就核酸提取纯化方法做简要介绍。
核酸提取方法酚-氯仿法酚-氯仿法是一种常见的核酸提取方法，其原理是用酚和氯仿混合液溶解脂质膜，并分离出DNA或RNA。
该方法适用于多种细胞和组织样本的提取，且提取出的核酸质量高，且纯度高。
该方法的步骤如下：1.将组织或细胞打碎并加入含有盐和表面活性剂的缓冲液中。
2.将酚与氯仿以1:1的比例混合，加入细胞组织样本混合物，使其充分混合。
3.用离心机高速离心，分离上层酚相和下层水相。
4.将上层酚相转移到新的离心管中，再加入等体积的氯仿和去离子水混合液，混合均匀。
5.用离心机高速离心，分离上层酚相和下层水相，上层酚相即为提取的核酸。
硅胶柱法硅胶柱法是一种常用的核酸纯化方法，通常用于DNA或RNA的纯化和浓缩。
该方法会将提取的核酸样本与硅胶粒子混合，经离心去除杂质，然后将核酸吸附在硅胶柱中，最后用适当的缓冲液洗脱所需的核酸。
该方法的步骤如下：1.将提取得到的核酸样本与硅胶颗粒混合。
2.用离心机离心，分离硅胶与其他细胞成分和杂质。
3.将硅胶样本均匀放入硅胶柱中，用称量纸封端，并加入洗脱缓冲液，使其顺着硅胶柱流经。
4.加入适量的洗脱缓冲液冲洗硅胶柱，以去除杂质。
所需的核酸会留在硅胶柱上。
5.加入洗脱缓冲液，洗脱硅胶柱中的核酸。
结论在进行核酸提取纯化时，选择合适的提取方法和纯化方法非常重要。
酚-氯仿法和硅胶柱法是两种常见的核酸提取纯化方法，它们各自具有适用的范围和特点。
为了提高核酸提取纯化的效果，通常会进行PCR扩增检测，以保证提取的核酸质量和纯度达到要求。
核酸的分离纯化技术
核酸的分离纯化技术从细胞中提取核酸后，仍混杂着蛋白质、多糖和各种大小分子核酸同类物。
除去这些“杂质”的过程，也就是核酸提纯过程。
在核酸的分离纯化时，为防止核酸大分子的变性降解，必须在0～4℃的低温条件下操作。
核酸酶的水解作用，是过去制备具有活性核酸大分子的严重障碍，现普遍采用加入去污剂或加入EDTA、8-羟基喹啉、柠檬酸钠以除去核酸酶的激活剂Mg2+，就可以抑制核酸酶的活性，保证在提纯过程中核酸大分子的完整。
关于核酸分离纯化阶段中除去多糖、蛋白质及不同类型核酸之间分离的一些方法，分别介绍如下：（1）肝糖元、淀粉及粘多糖，由于其物理化学性质与核酸有许多相似之处，常在提取液中残存下来。
除去的方法常有：①取材前尽量减少组织中多糖的含量，如先使动物饥饿数天然后杀死，可使细胞内肝糖元大大减少。
②加入淀粉酶，将大分子多糖分解为小分子，在以后纯化步骤中逐渐被除去。
③在浓磷酸盐存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液，使多糖溶于下层水相，核酸在上面有机层中。
④以钙盐沉淀DNA，再以草酸钾处理，使之形成DNA钾盐回收，然后用离子交换法吸附DNA，使之与多糖分离。
（2）蛋白质的除去：由于核酸在细胞内以核蛋白体形式存在，不论采用哪种方法提取核酸，蛋白质都不同程度地存在于体系中。
因此，除去蛋白质是核酸分离纯化不可避免的步骤。
常用方法有下列几种：①加入去污剂如硫酸十二脂钠，从提取到分离纯化各阶段均可反复使用此法。
去污剂与氯仿法或苯酚法结合使用，效果更加理想。
②氯仿-戊醇或辛醇对提取液摇荡抽提，蛋白质在氯仿-水界面形成凝胶，离心后除去，核酸留在水溶液中。
此法在分离纯化中也常反复使用。
③苯酚水溶液抽提，在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下，DNA或RNA都可以进入水相，蛋白质则沉淀于酚层，然后取水相加入乙醇或2-乙氧基乙醇沉淀RNA 或DNA，残余的酚可用葡聚糖凝胶G-10或G-25除去。
（3）不同类型核酸的分离：两种类型核酸的制备过程中，DNA制品中混杂着少量RNA或RNA制品中混杂着少量DNA是经常发生的。
核酸的分离纯化及鉴定技术生化分析描述
核酸的分离纯化及鉴定技术生化分析描述一、核酸的分离纯化技术1.超声破碎法超声破碎法是一种通过超声波的振动作用破碎细胞膜，释放细胞内的核酸分子的方法。
该方法操作简便，效果较好。
2.酚-氯仿提取法酚-氯仿提取法是一种经典的核酸提取方法，通过酚和氯仿相间重复萃取的方法，将细胞或组织中的核酸分子提取到有机相中，然后用酒精沉淀。
3.离心沉淀法离心沉淀法是利用不同物质在不同离心力下沉降速度的不同，将核酸从其他组分中分离出来的方法。
可通过高速离心使核酸沉淀到底部，将上清液中的其他杂质倒掉，最后用缓冲液重悬核酸。
4.配对离心法配对离心法是利用核酸的碱基配对性质，在特定的条件下使目标DNA 与特异性探针配对，然后通过离心将核酸-探针复合物从其他杂质中分离出来。
这种方法常用于核酸的富集和寡核苷酸修饰位点的分析。
二、核酸的鉴定技术1. 紫外-可见分光光度法（UV-Vis）紫外-可见分光光度法是通过核酸分子在紫外光或可见光波长范围内的吸收特性来确定其存在和浓度的方法。
根据核酸中含有的吸收波长为260 nm处的碱基特征吸光峰，可以判断核酸的纯度和浓度。
2.电泳分析法电泳分析法是通过核酸分子在电场中的迁移速率和特定条件下的尺寸分离效应来分析核酸的方法。
主要包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种方法。
核酸经电泳后可以观察到DNA或RNA在凝胶中的特征性带状图案，确定其分子大小、纯度和带电性。
3.PCR（聚合酶链式反应）PCR是一种常用的核酸鉴定技术，通过特定引物和聚合酶的作用，在体外进行核酸的扩增以达到检测目的。
PCR可用于快速检测目标DNA的存在与否，以及定性和定量分析。
4.基因测序技术基因测序技术是指利用测序反应将核酸序列信息转化为比特（通常指二进制），然后通过计算机软件分析的方法对核酸序列进行鉴定。
常用的基因测序技术有dideoxy测序和串联反应测序。
三、应用核酸的分离纯化及鉴定技术广泛应用于生物医学研究、遗传学、分子生物学、基因工程和疾病诊断等领域。
核酸的纯化主要方法
分离纯化核酸时的注意事项：防止物理因素的降解：1.尽量简化操作步骤，缩短提取时间，以减少变性机会。
2.防止热变性，避免高温。
一般0-4℃。
3.防止机械剪切作用动作轻缓；搅拌温和；加山梨醇等增加渗透压。
防止化学因素的降解：1.避免强酸强碱作用，抽提液pH要保持在4-10之间。
2.保持提取液一定的离子强度，以调节核酸的溶解度和保持二级结构的稳定性。
防止核酸酶的降解防止DNA酶的降解：通常加入酶的抑制剂、蛋白质的变性剂和去垢剂来实现。
1.加入金属离子螯合剂抑制DNA酶2.去垢剂及某些RNase抑制剂，对DNA酶也有一定抑制作用。
防止RNA酶的降解：RNase很难抑制，且无处不在，汗液、唾液中均有。
很耐热，80℃处理15分钟不能灭活。
操作注意事项：1.带一次性手套、口罩；2.器皿试剂高压灭菌或用DEPC（乙二基焦炭酸）处理。
但含有Tris的试剂不宜用，因DEPC可与胺类迅速发生化学反应。
3.尽早除去蛋白质（含RNase）,并加抑制剂。
常用的抑制RNase活性的方法有：1.核糖核酸酶阻抑蛋白（RNasin,人胎盘中分离的一种蛋白）优点：效果好，不干扰反转录或mRNA在无细胞体系中的翻译。
使用注意事项：（1）置于含5mmol/L二硫苏糖醇（DDT）的50%甘油中，-20℃储存。
（2）最大活性的发挥要求有巯基试剂。
（3）冻融数次后应弃之不用。
（4）在变性裂解哺乳动物细胞提取RNA的初始步骤中不宜使用，在其后RNA纯化步骤中应用。
用酚抽提可除去蛋白质抑制剂，故纯化过程中应补加。
2．糖核苷复合物（vanadyl-ribinucleaside complex）由氧钒（IV）离子和4种核糖中的任意一种形成的复合物，是一种过渡态类似物，它能与多种RNase结合并几乎能百分百地抑制RNA酶的活性。
缺点：强烈抑制mRNA在无细胞体系中的翻译。
可用0.1%羟基喹啉的苯酚（用0.01mol/L E(pH>7.8)平衡）多次抽提除去。
核酸的纯化主要方法
分离纯化核酸时的注意事项：防止物理因素的降解：1.尽量简化操作步骤，缩短提取时间，以减少变性机会。
2.防止热变性，避免高温。
一般0-4℃。
3.防止机械剪切作用动作轻缓；搅拌温和；加山梨醇等增加渗透压。
防止化学因素的降解：1.避免强酸强碱作用，抽提液pH要保持在4-10之间。
2.保持提取液一定的离子强度，以调节核酸的溶解度和保持二级结构的稳定性。
防止核酸酶的降解防止DNA酶的降解：通常加入酶的抑制剂、蛋白质的变性剂和去垢剂来实现。
1.加入金属离子螯合剂抑制DNA酶2.去垢剂及某些RNase抑制剂，对DNA酶也有一定抑制作用。
防止RNA酶的降解：RNase很难抑制，且无处不在，汗液、唾液中均有。
很耐热，80℃处理15分钟不能灭活。
操作注意事项：1.带一次性手套、口罩；2.器皿试剂高压灭菌或用DEPC（乙二基焦炭酸）处理。
但含有Tris的试剂不宜用，因DEPC可与胺类迅速发生化学反应。
3.尽早除去蛋白质（含RNase）,并加抑制剂。
常用的抑制RNase活性的方法有：1.核糖核酸酶阻抑蛋白（RNasin,人胎盘中分离的一种蛋白）优点：效果好，不干扰反转录或mRNA在无细胞体系中的翻译。
使用注意事项：（1）置于含5mmol/L二硫苏糖醇（DDT）的50%甘油中，-20℃储存。
（2）最大活性的发挥要求有巯基试剂。
（3）冻融数次后应弃之不用。
（4）在变性裂解哺乳动物细胞提取RNA的初始步骤中不宜使用，在其后RNA纯化步骤中应用。
用酚抽提可除去蛋白质抑制剂，故纯化过程中应补加。
2．糖核苷复合物（vanadyl-ribinucleaside complex）由氧钒（IV）离子和4种核糖中的任意一种形成的复合物，是一种过渡态类似物，它能与多种RNase结合并几乎能百分百地抑制RNA酶的活性。
缺点：强烈抑制mRNA在无细胞体系中的翻译。
可用0.1%羟基喹啉的苯酚（用0.01mol/L E(pH>7.8)平衡）多次抽提除去。
简述核酸分离纯化的主要步骤
简述核酸分离纯化的主要步骤核酸分离纯化的主要步骤其实就是一场与基因的“亲密接触”。
我们就像是在进行一场精密的科学“约会”，只不过对象是DNA或RNA，而不是人。
好啦，咱们来看看这个过程如何进行的吧。
1. 材料准备
1.1 样品收集
首先，你得找点样品，可能是植物、动物，甚至是细菌。
想象一下，就像挑选食材一样，你需要挑选新鲜的“原料”。
1.2 细胞裂解
接下来，咱们要“破壳”了！通过加入一些裂解缓冲液，把细胞膜弄开，释放出里面的核酸。
这个过程就像是打开一个“宝箱”，哇，里面可真丰富！
2. 去除杂质
2.1 去除蛋白质
这一步，你得用一些蛋白酶，把细胞里的蛋白质都搞定。
想象一下，就像是把不需要的东西清理出去，只留下最闪亮的宝物。
2.2 沉淀核酸
然后，咱们需要加入酒精，通常是乙醇。
核酸会跟酒精“亲密接触”，沉淀下来。
这个时候你会发现，核酸就像是被请出舞池的主角，闪闪发光！
3. 洗涤与重溶
3.1 洗涤
在沉淀后的核酸上，加点洗涤液，就像给它洗个澡，把残留的杂质都冲走。
你得小心翼翼，别让它“滑了”！。
3.2 重溶
最后一步，是把洗净的核酸重新溶解在缓冲液中。
这个过程就像是给核酸穿上新衣服，焕然一新，准备出门见客！
完成这些步骤后，你的核酸就“出炉”啦！感觉就像是一场成功的约会，满载而归。
希望这个过程能让你对核酸分离纯化有个更轻松的了解。
就这样，你成功地和基因建立了“深厚的友谊”，为后续的实验打下了良好的基础！。
核酸分离与纯化的技术路线与原则
核酸分离与纯化的技术路线与原则核酸包括DNA 、RNA两类分子，在细胞内均与蛋白质结合成核蛋白。
真核生物基因组中，95%DNA 为双链线性分子，存在于细胞核中，5%为双链环状分子，存在于细胞器中；原核生物DNA 及质粒DNA 为双链或单链环状分子；RNA 为单链线性分子，主要存在于细胞质中。
DNA 与RNA 性质的不同导致对其分离与纯化的条件也不相同。
一、核酸分离与纯化的原则(1)保证核酸一级结构的完整性。
生物的遗传信息全部贮存在核酸一级结构中，而且核酸的一级结构还决定其高级结构的形式及和其他大分子结合的方式。
所以，所提取的核酸一级结构的完整性直接影响着后续实验中对其结构与功能研究的质量。
因此，在制备核酸的过程中，要做到：尽量简化操作程序，缩短提取过程；避免过酸、过碱等化学因素对核酸链中磷酸二酯键的破坏，在pH 值4～10条件下进行操作；操作时动作要轻缓，提取的样品小包装保存，以免诸多的物理因素对核酸的降解；避免细胞内及环境中核酶对核酸的生物性降解。
(2)排除其他生物大分子的污染，如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应尽可能降低到最低程度，特别是提取DNA 分子时应除去RNA 分子，反之亦然。
(3)排除核酸样品中有机溶剂和过高浓度的金属离子。
二、分离与纯化的技术路线(一)核酸的释放通常情况下DNA 及RNA 均位于细胞内，因此核酸分离与纯化的第一步就是制备单个细胞，再破碎细胞，从而释放核酸。
破碎细胞的方法包括机械法与非机械法两大类。
机械法又可分为液体剪切法与固体剪切法；非机械法可分为干燥法与溶胞法。
由于溶胞法采用适宜的化学试剂与酶，能有效地裂解细胞，方法温和，能保证较高的核酸获得率，并能较好地保持核酸的完整性，从而得到广泛的应用。
(二)核酸的分离与纯化利用核酸与其他物质性质上的差异，可以分离与纯化核酸。
这种差异包括细胞定位与组织分布上的差异，物理、化学性质上的不同，以及各自独特的生物学特性。
操作过程中，既可以从复杂样品中抽提出核酸分子，也可以将样品中的非核酸成分(非核酸的生物大分子、非需要的核酸分子及在操作过程中加入的溶液与试剂)逐步清除。
简述核酸分离纯化的主要步骤。
简述核酸分离纯化的主要步骤。
在生物实验中，核酸分离纯化可谓是一个神奇的过程，像是把“混乱的书房”整理成一间“整洁的书房”，让我们能从一堆杂乱的物质中找出我们需要的那一部分。
要想搞清楚这个过程，我们得从头说起。
先别急，跟我来，我们一块儿来聊聊这些神奇的步骤。
1. 核酸提取的开篇首先，我们得“扒拉扒拉”样品。
也就是说，要从样本里提取出核酸。
这一步就像是把原料放到面粉筛里筛选一样，我们得把细胞破坏开，释放里面的核酸。
这里用的工具有点像“万用刀”，既可以是研磨机，也可以是液氮冷冻破碎机，总之就是要让细胞壁的“防线”彻底崩溃。
像打破冰层一样，把里面的核酸暴露出来。
1.1 细胞破碎：好比“猛兽入笼”细胞破碎的过程，听起来就像是猛兽入笼，猛烈而直接。
为了完成这个步骤，我们可以使用各种各样的试剂，比如说细胞裂解液。
这个液体就像是一把万能钥匙，能把细胞膜一举撬开，释放里面的核酸。
当然，有时候我们也可以用物理手段，比如说搅拌、超声波破碎等，像摇晃沙袋一样，把核酸搞出来。
1.2 去除杂质：清除“杂草”一旦细胞壁被破坏，里面的核酸和其他成分混杂在一起。
接下来，我们要做的就是清除那些“杂草”。
这时候我们会用到一些化学试剂，比如说酚/氯仿混合液。
这些试剂像是高效的“除草剂”，能够把蛋白质和其他杂质从核酸中分离出来。
我们会把样品离心分层，这样就能把核酸分离出来。
记得，离心就像洗衣机的脱水功能，快速旋转让东西分开。
2. 核酸纯化的妙招接下来是核酸纯化的部分了。
这个过程可以说是给核酸做一个“美容”，让它看起来干净又光鲜。
纯化的方式有很多，其中最常用的是柱子纯化。
我们把样品经过特制的柱子，就像是把泥土过滤掉，把精华留下来一样。
柱子的材料有一种特殊的性质，能吸附核酸，而把其他杂质排除在外。
2.1 柱子纯化：像“过滤咖啡”柱子纯化的过程其实就像是过滤咖啡。
你把咖啡粉放到过滤纸里，然后慢慢滴下清水，最终只剩下干净的咖啡液。
类似地，我们把核酸溶液通过柱子，里面的核酸会被柱子吸附，而其他的杂质会被洗掉。
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14
植物材料
植物CTAB法流程图
裂解液
酒精沉淀
液氮研磨
抽提
离心洗涤
DNA溶液
细胞裂解
上层溶液
干燥溶解
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15
基因组DNA—SDS 法提取缓冲液配方
Tris-HCl
迈好成功第一步
—核酸分离提取新思维
福际生物技术有限公司专场技术讲座系列
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1
主要内容
❖公司概况 ❖核酸分离提取技术交流
中 国 福 际 World’s Foregene
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➢ 线粒体、叶绿体DNA的提取 • 差速离心结合SDS裂解法
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12
基因组DNA—CTAB 法提取缓冲液经典配方
组份
Tris-HCl EDTA （pH8.0） NaCl
（pH8.0）
终浓度
100 mM
20 mM
1.4M
CTAB
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10
DNA提取方法简介
基因组DNA的提取 ➢ CTAB法
➢ SDS法 ➢ 其他方法
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11
非基因组DNA的提取
➢ 质粒DNA的提取 • 碱裂解法 • 煮沸法
13
CTAB 法提取缓冲液改进配方
组
Tris-HCl
份 （pH8.0）
终
浓
100 mM
度
EDTA （pH8.0）
20 mM
NaCl
CTAB
1.4M 3%(W/V)
PVP40 β-巯基乙醇
5%(W/V)
2%（V/V） 使用前加
入
➢PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种 不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同 时它也能和多糖结合，有效去除多糖。
reversible gene regulation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102(34):
12189-93. (封面文章)
Xu Song, et al. (2004) Binding of mouse VL30 retrotransposon
宋旭
RNA to PSF protein induces genes repressed by PSF: Effects on
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8
前言
核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信 息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核 酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基 本的操作 。
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9
内容
DNA提取方法简介 DNA提取常见问题、原因分析及其对策 RNA提取方法简介 RNA提取及其RT-PCR常见问题、原因分析及其 对策 Foregene基因组DNA纯化方案 Foregene基因组DNA纯化实例 Foregene产品简介
β-巯基乙醇
2%(W/V)
0.1%（V/V） 使用前加入
➢ CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； ➢ β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐 变，使酚容易去除，当酚类物质被氧化后就会和核酸不可逆 的结合。
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组份
EDTA （pH 8.0 ） NaCl
SDS
（pH8.0）
终浓度
10 mM
20 mM
0.4M
2%
•SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能 裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； •提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质 及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；
CONTACT US 规模，预计到2014年将达到100人以上，其中85%以上具有硕士或博士学位。
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4
公司首席技术官。四川大学博导，A级岗位二级教授，
国家自然科学基金生命科学部基因表达调控与表观遗传学
评审专家。主要从事长非编码RNA及抗肿瘤药物研究。
发表文章：
Xu Song, et al. (2005) Roles of PSF protein and VL30 RNA in
世界一流的集研发、生产、销售、技 术支持、技术服务为一体的生物技术
服务中心
公司。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ研发中心（基础）
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3
人才优势
❖公司拥有一支实力雄厚的研发队伍，主要研发人员均具有多年海外名校工作经 验，在Science、Nature、Lancet、Molecular Cell、N.Engl J Med、PNAS等杂志发表 过数十篇论文，具有广阔的国际视野和较强的产品设计开发能力。 ❖技术顾问有来自哈佛、耶鲁等名校的美国国家科学院院士、教授等知名学者。 ❖现有研究人员30人，90%具有硕士及以上学历。未来公司将继续扩大研发团队
steroidogenesis and oncogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
101(2): 621-6
CONTACT US
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5
Alan Garen
公司高级顾问。耶鲁大学终身 教授、美国国家科学院院士、美国 国家艺术与科学院院士、四川大学 特聘教授。
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2
公司简介
成都福际生物技术有限公司坐落于成都高新孵化园内，由耶鲁大学留学
回国的知名学者创办, 主营方向为研发、生产和销售生命科学科研及临床所用
的试剂及试剂盒。现已推出各种DNA 纯化试剂盒及直接PCR系列产品。
未来，福际将进一步加大研发投
管理 行政中心
入，丰富产品种类，致力于发展成为
销售中心
率先发现蛋白质编码的三个终 止密码子，为现代分子生物学研究 的主要开拓人之一。现主要从事配 体靶向抗肿瘤药物研究及原癌基因 的发现与鉴定工作。
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6
生物学、医学实验室
服务对象
生物技术公司、科研机构
海关、质检部门
医院、疾控中心、血站
法医、刑侦
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更多行业
……
7
核酸分离提取技术交流
EXPERT IN NUCLEIC ACID EXTRACTION