第四章 核酸分离纯化
核酸分离纯化的原则
磁珠法核酸纯化技术采用了纳米级磁珠微珠，这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团，能同核酸发生吸附反应。
硅磁（Magnet ic Silic a Partic le）就是指磁珠微珠表面包裹一层硅材料，来吸附核酸，其纯化原理类型于玻璃奶的纯化方式。
离心磁珠是指磁珠微珠表面包裹了一层可发生离心交换的材料（如DEAE，COO H）等，从而达到吸附核酸目的。
不同性质的磁珠微珠所对应的纯化原理是不一致。
使用磁珠法来纯化核酸的最大优点就是自动化。
磁珠在磁场条件下可以发生聚集或分散，从而可彻底摆脱离心等所需的手工操作流程。
Omega拥有全面的磁珠法核酸分离试剂盒，基于这种技术的试剂盒，名称前都有’Mag-Bind’。
核酸分离与纯化的原则核酸在细胞中总是与各种蛋白质结合在一起的。
核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开。
在分离核酸时应遵循以下原则:保证核酸分子一级结构的完整性;排除其他分子污染。
核酸分离与纯化的步骤大多数核酸分离与纯化的方法一般都包括了细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。
每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。
1. 细胞裂解:核酸必须从细胞或其他生物物质中释放出来。
细胞裂解可通过机械作用、化学作用、酶作用等方法实现。
(1) 机械作用:包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。
这些方法用机械力使细胞破碎,但机械力也可引起核酸链的断裂,因而不适用于高分子量长链核酸的分离。
有报道超声裂解法提取的核酸片段长度从< 500bp ～> 20kb 之间,而颗粒匀浆法提取的核酸一般< 10kb。
(2) 化学作用:在一定的p H 环境和变性条件下,细胞破裂,蛋白质变性沉淀,核酸被释放到水相。
上述变性条件可通过加热、加入表面活性剂(SDS、Triton X-100 、Tween 20 、NP-40 、CTAB、sar-cosyl 、Chelex-100 等) 或强离子剂(异硫氰酸胍、盐酸胍、肌酸胍) 而获得。
核酸的分离纯化技术
核酸的分离纯化技术从细胞中提取核酸后，仍混杂着蛋白质、多糖和各种大小分子核酸同类物。
除去这些“杂质”的过程，也就是核酸提纯过程。
在核酸的分离纯化时，为防止核酸大分子的变性降解，必须在0～4℃的低温条件下操作。
核酸酶的水解作用，是过去制备具有活性核酸大分子的严重障碍，现普遍采用加入去污剂或加入EDTA、8-羟基喹啉、柠檬酸钠以除去核酸酶的激活剂Mg2+，就可以抑制核酸酶的活性，保证在提纯过程中核酸大分子的完整。
关于核酸分离纯化阶段中除去多糖、蛋白质及不同类型核酸之间分离的一些方法，分别介绍如下：（1）肝糖元、淀粉及粘多糖，由于其物理化学性质与核酸有许多相似之处，常在提取液中残存下来。
除去的方法常有：①取材前尽量减少组织中多糖的含量，如先使动物饥饿数天然后杀死，可使细胞内肝糖元大大减少。
②加入淀粉酶，将大分子多糖分解为小分子，在以后纯化步骤中逐渐被除去。
③在浓磷酸盐存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液，使多糖溶于下层水相，核酸在上面有机层中。
④以钙盐沉淀DNA，再以草酸钾处理，使之形成DNA钾盐回收，然后用离子交换法吸附DNA，使之与多糖分离。
（2）蛋白质的除去：由于核酸在细胞内以核蛋白体形式存在，不论采用哪种方法提取核酸，蛋白质都不同程度地存在于体系中。
因此，除去蛋白质是核酸分离纯化不可避免的步骤。
常用方法有下列几种：①加入去污剂如硫酸十二脂钠，从提取到分离纯化各阶段均可反复使用此法。
去污剂与氯仿法或苯酚法结合使用，效果更加理想。
②氯仿-戊醇或辛醇对提取液摇荡抽提，蛋白质在氯仿-水界面形成凝胶，离心后除去，核酸留在水溶液中。
此法在分离纯化中也常反复使用。
③苯酚水溶液抽提，在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下，DNA或RNA都可以进入水相，蛋白质则沉淀于酚层，然后取水相加入乙醇或2-乙氧基乙醇沉淀RNA 或DNA，残余的酚可用葡聚糖凝胶G-10或G-25除去。
（3）不同类型核酸的分离：两种类型核酸的制备过程中，DNA制品中混杂着少量RNA或RNA制品中混杂着少量DNA是经常发生的。
医学课件-核酸的分离与纯化
课程背景
化学组成
核酸是由核苷酸构成的，包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）两种。
结构特征
DNA的双螺旋结构以及RNA的单链结构是核酸的典型结构特征。
核酸简介
获得高纯度核酸
提高核酸检测灵敏度
研究和开发需求
分离与纯化的目的
02
核酸的分离
将生物样品处理成匀浆或细胞裂解液，以便释放其中的核酸。
要点一
要点二
自动化和智能化
未来的核酸分离和纯化技术将更加注重自动化和智能化，能够实现自动化操作、减少人为误差和增加批量化生产的能力。
应用领域的拓展
随着生命科学和医学的不断发展和进步，核酸分离和纯化技术的应用领域也将不断拓展，将会有更多的应用场景和用途被发现和应用。
要点三
谢谢您的观看
THANKS
xx年xx月xx日
医学课件-核酸的分离与纯化
CATALOGUE
目录
引言核酸的分离核酸的纯化核酸的鉴定实验方案设计总结与展望
01
引言
核酸是生物体内的重要遗传物质，对于研究基因组、基因表达、基因功能等生物学核心问题具有重要意义。
生物学研究需求
随着生物学和生物技术学的不断发展，不断有新的核酸分离与纯化方法和技术出现，推动了医学和生物医学领域的发展。
步骤
将细胞裂解后，加入酚氯仿混合液，充分混匀，离心，取上清液，再加入氯仿充分混匀，离心，取上清液，最后加入异戊醇沉淀核酸。
实验方案设计一：酚氯仿抽提法
原理
乙醇沉淀法是一种利用乙醇沉淀核酸的方法。
步骤
将细胞裂解后，加入乙醇，充分混匀，离心，弃去上清液，再加入乙醇洗涤沉淀，离心，弃去上清液，最后干燥沉淀得到核酸。
简述核酸分离纯化的主要步骤
简述核酸分离纯化的主要步骤核酸分离纯化的主要步骤其实就是一场与基因的“亲密接触”。
我们就像是在进行一场精密的科学“约会”，只不过对象是DNA或RNA，而不是人。
好啦，咱们来看看这个过程如何进行的吧。
1. 材料准备
1.1 样品收集
首先，你得找点样品，可能是植物、动物，甚至是细菌。
想象一下，就像挑选食材一样，你需要挑选新鲜的“原料”。
1.2 细胞裂解
接下来，咱们要“破壳”了！通过加入一些裂解缓冲液，把细胞膜弄开，释放出里面的核酸。
这个过程就像是打开一个“宝箱”，哇，里面可真丰富！
2. 去除杂质
2.1 去除蛋白质
这一步，你得用一些蛋白酶，把细胞里的蛋白质都搞定。
想象一下，就像是把不需要的东西清理出去，只留下最闪亮的宝物。
2.2 沉淀核酸
然后，咱们需要加入酒精，通常是乙醇。
核酸会跟酒精“亲密接触”，沉淀下来。
这个时候你会发现，核酸就像是被请出舞池的主角，闪闪发光！
3. 洗涤与重溶
3.1 洗涤
在沉淀后的核酸上，加点洗涤液，就像给它洗个澡，把残留的杂质都冲走。
你得小心翼翼，别让它“滑了”！。
3.2 重溶
最后一步，是把洗净的核酸重新溶解在缓冲液中。
这个过程就像是给核酸穿上新衣服，焕然一新，准备出门见客！
完成这些步骤后，你的核酸就“出炉”啦！感觉就像是一场成功的约会，满载而归。
希望这个过程能让你对核酸分离纯化有个更轻松的了解。
就这样，你成功地和基因建立了“深厚的友谊”，为后续的实验打下了良好的基础！。
15052 医学分子生物学4核酸分离纯化课件共59页
细菌裂解方法的选择
取决于３个因素 质粒的大小 菌株种类 裂解后纯化质粒DNA的技术
大于15kb的质粒易受损，应采用温和裂解法，如 SDS裂解法，将细菌悬浮于10％蔗糖溶液中可减轻裂 解时对DNA造成的机械剪切力。
碱裂解法:
利用质粒DNA和染色体DNA的变性与复性的差异达到分离 目的
强碱破坏碱基配对，使线状染色体DNA解链，但闭环
质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条
件恢复正常时，质粒DNA链迅速得到准确配对，重新形成
完全天然的超螺旋分子。
碱裂解法:
在NaOH（pH12.0－12.6）下，用EDTA 和SDS破坏细胞壁 和裂解细胞，并使细胞的蛋白质与DNA发生变性，释放出质粒 DNA。
基因组DNA片段的纯化
DNA粗制品实际上是分子量大小不等 的DNA片段的混合物，难免还混有少 量的RNA、蛋白质和一些小分子杂质。
某些实验，如限制性内切求较高，这就要求对粗制品进一步纯 化。
基因组DNA片段的纯化
质粒载体（plБайду номын сангаасsmid vector）
细菌中提纯质粒DNA的方法
3个步骤：
细菌培养物的生长(质粒扩增） 细菌的收获（离心）和裂解 质粒DNA的纯化
细菌培养
细菌培养至对数生长期（OD600） 时提取质粒DNA。 减少细菌量，降低后续操作中裂解物 的复杂性和粘稠度。
细菌裂解
可采用离心的方法来收集细菌，由于细菌生长中产生了大 量的代谢产物，为提高质粒DNA的纯度，细菌沉淀最好 用STE或生理盐水漂洗1～2次。
纯化方法有透析、层析、电泳及选 择性沉淀等。
核酸的分离纯化优秀课件
前言
核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者， 是基因表达的物质基础。
无论是进行核酸结构还是功能研究，首先 需要对核酸进行分离和纯化。
核酸样品质量将直接关系到实验的成败。
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核酸的分离纯化优秀课件
一、核酸分离、纯化原则
（一）保持核酸分子一级结构的完整性
1 意义
遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸 的—级结构还决定其高级结构的形式以及和其 他生物大分子结合的方式。
核酸的分离纯化优秀课件
General process of gene engineering
1. 从生物有机体基因组中， 分离出带有目的基因的DNA片 段。
2. 将带有目的基因的外源DNA片段连 接到能够自我复制的并具有选择记号 的载体分子上，形成重组DNA分子。
3. 将重组DNA分子转移到适当的受体 细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增 殖。 4. 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出 获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛 核酸的分离纯选化出优秀已课件经得到扩增的目的基因。
1952年Hershey和Chase证实噬菌体DNA 侵染细菌实验
核酸的分离纯化优秀课件
2. 50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交 替问题；
Rosalind Franklin拍出 了第一张 能反映DNA美丽双螺旋结构的X
射线照片
X-ray source
（3) 肝素 （4）复合硅酸盐（Macaloid) （5）RNase阻抑蛋白（RNasin） （6）氧钒核糖核苷复合物 (Vanadyl-
Ribonucleoside Complex, VRC)
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核酸的分离纯化优秀课件
核酸分离纯化方法
核酸分离纯化方法
核酸分离纯化方法包括以下几种常用方法：
1. 酚酸法（Phenol-Chloroform Extraction）：通过酚酸混合液溶解蛋白质，然后进行醚抽提，可分离出核酸。
该方法通常用于大量样品的纯化。
2. 高盐法（Salt Precipitation）：通过加入高浓度盐溶液，如氯化钠，使核酸在低温下形成沉淀，然后离心分离。
3. 硅胶柱法（Silica Column）：将核酸样品通过硅胶柱，利用硅胶对核酸的亲合性，使核酸固定在柱中，通过洗脱剂洗脱纯化的核酸。
4. 钠离子交换柱法（Sodium Ion Exchange Column）：利用柱内载体对核酸的亲合性，在一定的钠离子浓度下，核酸与载体结合，通过洗脱缓冲液洗脱纯化的核酸。
5. 凝胶电泳法（Gel Electrophoresis）：利用电场作用，将核酸样品在凝胶上进行分离和纯化。
根据核酸的大小，可选择琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳。
核酸分离纯化
2.4.2 溴乙锭荧光法测定核酸的含量
原理：DNA.RNA在荧光染料溴乙锭(EB)嵌入碱基平面之间后，DNA.RNA样品在紫外光激发 下，可发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使用一系列已知的不同浓度DNA 溶液作标准对照，可比较出被测DNA溶液浓度。
注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。
一般强调, 核酸沉淀在低温长时间下进行。 低温长时间沉淀, 易导致盐与DNA共沉淀, 影响以后的实验。一般使用0℃冰水, 1015min, DNA样品足可达到实验要求。
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2.4 核酸的浓度测定
2.4.1 紫外分光光度法测DNA和RNA的含量 前提: 核酸样品要较纯，无显著蛋白质、 酚、琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应 大于0.25 μg/ml 。 结论: 在波长260nm紫外光下，1 OD值的吸 光度相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链 DNA为37 μg/ml；RNA为40 ug/ml。
PEG沉淀一般需加0.5mol/L的NaCl或10 mmol/L 的MgCl2。
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（4）精胺
精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀 DNA。 原理是:
精胺与DNA结合后，使DNA在溶液中结构凝 缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质 杂质与DNA分开，达到纯化DNA的目的。
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2.3.3 核酸沉淀的温度和时间
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2.3 核酸的沉淀
• 重新调整核酸的浓度, 起到浓缩核酸的作用； • 去除溶液中某些盐离子与杂质； • 改变核酸的溶解缓冲液。
DNA纯化柱
核酸提取（离心柱型） 利用硅胶膜特异吸附核酸
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2.3.1 核酸沉淀的盐类及浓度
当核酸溶液的pH值大于4时, 核酸分子呈多聚阴离子 状态, 它与1价或2价阳离子形成的盐在许多有机溶剂中 不溶解, 也不会被有机溶剂变性。
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第四章核酸分离纯化
一、学习目标
掌握 DNA和RNA分离纯化的步骤、原则和常用方法。
熟悉常见临床分子生物学检验标本的种类、标本处理的一般原则。
二、重点和难点内容
（一）临床分子生物学检验标本的主要种类：
血液标本（全血、血清、血浆、外周血单个核细胞）、分泌物标本（鼻咽分泌物、生殖道分泌物、唾液、痰液、胃液等）、组织标本等。
（二）临床分子生物学检验标本的主要处理原则：
（1）适时、适量采集标本。
（2）低温运送与保存。
（三）核酸分离纯化的步骤：
（1）制备细胞及破碎细胞。
（2）消化蛋白质，去除与核酸结合的蛋白质、多糖及脂类等生物大分子。
（3）去除其它不需要的核酸分子。
（4）沉淀核酸，去除盐类、有机溶剂等杂质。
（四）核酸分离纯化的原则：
（1）维持完整度（抑制DNA酶或RNA酶对DNA或RNA 的降解活性）。
（2）确保高纯度。
（五）分离纯化后的理想DNA样品应具备的条件：
（1）不含对后续检测所用酶（如后续PCR检测所用酶：DNA聚合酶）的活性有抑制作用的有机溶剂和高浓度的金属离子。
（2）最大程度上避免蛋白质、多糖和脂类的污染。
（3）排除RNA分子的污染与干扰。
（六）核酸分离纯化的方法：
（1）基因组DNA 的分离纯化
酚抽提法
吸附柱法（原理：基于高盐缓冲系统下，DNA与硅基质的可逆结合来分离纯化DNA）
磁珠法（原理：基于磁珠表面修饰的对DNA有吸附作用的官能基团，通过其与DNA的可逆结合、磁场对磁珠的作用来分离纯化DNA）
（2）总RNA的分离纯化
Trizol (异硫氰酸胍&苯酚混合液)法
总RNA提取试剂盒(吸附柱法&磁珠法)
（3）mRNA的分离纯化
寡聚(dT)-纤维素柱层析法
寡聚(dT)-微珠法
寡聚(U)-琼脂糖柱层析法
原理：基于mRNA3’末端poly(A)尾结构，依据A与T 或A与U的碱基互补配对原则，来分离纯化mRNA。