蛋白质作业

蛋白质的分离和纯化（细胞生物学专业王文军 D201002021）摘要：近年来随着科学技术的进步，蛋白的分离纯化技术得到了很大的发展。

与传统的分离纯化技术相比，现在一些蛋白质的分离纯化技术更趋向于精细化，但是仅仅是单一的方法并不能获得高纯度的蛋白质，所以蛋白质的分离纯化需要多种技术的综合运用以获得高纯度高产量的蛋白。

本文主要讲述了蛋白质分离纯化常用的主要技术，比如离心法、沉淀法、电泳法、层析法、萃取法等。

关键词：蛋白质；提取；分离；纯化正文：蛋白质是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质，是生命的物质基础，可以说没有蛋白质就没有生命。

具有生理活性的蛋白质类物质在维持现代人类健康方面已必不可少，在医疗和食品等领域已逐渐得到应用，正是由于蛋白质与人类生活密切相关，所以对其质量和纯度要求也越来越高。

蛋白质通常存在于复杂的混合体系中，要把蛋白质从复杂的体系中分离出来，同时又要防止其组成结构的改变和生物活性的丧失，显然需要一个复杂的过程。

目前蛋白质的分离纯化技术的发展趋向于精细化和多样化技术的综合运用，但是与传统的蛋白质分离纯化技术一样，都是在了解蛋白质的基本性质（分子的大小和形状、等电点、溶解性、稳定性、配体亲和性等）的基础上制定出的分离纯化方法。

下面主要讲述如何从组织中提取蛋白并对蛋白质分离纯化的方法做一个综述。

1.蛋白质的预处理我们要分离纯化某一种蛋白质，首先是要将它从组织中释放出来，并且要保持蛋白质原有的理化性质和生物活性。

根据分离纯化的原料不同,要采取不同的方法进行预处理，通常，动物材料要去掉结缔和脂肪组织,植物组织和细菌要将细胞壁进行破碎。

常用的使细胞破碎的方法有：（1）机械的方法主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。

常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间隔只有十分之几毫米，对细胞破碎程度较高速捣碎机高，机械切力对分子破坏较小。

小量的也可用乳钵与适当的缓冲剂磨碎提取，也可加氧化铝、石英砂及玻璃粉磨细。

但在磨细时局部往往生热导致变性或 pH显著变化，尤其用玻璃粉和氧化铝时。

（2）物理方法主要通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。

Ⅰ反复冻融法：于冷藏库或干冰反复于零下15～20℃使之冻固，然后缓慢地融解，如此反复操作，使大部分细胞及细胞内颗粒破坏。

由于渗透压的变化，使结合水冻结产生组织的变性，冰片将细胞膜破碎，使蛋白质可溶化，成为粘稠的浓溶液，但脂蛋白冻结变性。

Ⅱ冷热变替法：将材料投入沸水中，于 90℃左右维持数分钟，立即置于冰浴中使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏。

Ⅲ超声波法：暴露于9～10千周声波或 10～500千周超声波所产生的机械振动，只要有设备该法方便且效果也好，但一次处理量较小。

应用超声波处理时应注意避免溶液中气泡的存在。

处理一些超声波敏感的蛋白质酶时宜慎重。

Ⅳ加压破碎法：加一定气压或水压也可使细胞破碎。

（3）化学及生物化学方法Ⅰ有机溶剂法：粉碎后的新鲜材料在 0℃以下加入 5～10 倍量的丙酮，迅速搅拌均匀，可破碎细胞膜，破坏蛋白质与脂质的结合。

蛋白质一般不变性，被脱脂和脱水成为干燥粉末。

用少量乙醚洗，经滤纸干燥即可。

Ⅱ自溶法：将待破碎的鲜材料在一定 pH和适当的温度下，利用自身的蛋白酶将细胞破坏，使细胞内含物释放出来。

比较稳定，变性较难，蛋白质不被分解而可溶化。

利用该法可从胰脏制取羧肽酶。

自体融解时需要时间，需加少量甲苯、氯仿等。

应防止细菌污染。

于温室 30℃左右较早溶化。

自体融解过程中PH 显著变化，随时要调节PH。

自溶温度选在0～4℃，因自溶时间较长，不易控制，所以制备活性蛋白质时较少用。

Ⅲ酶法：与前述的自体溶法同理，用胰蛋白酶等蛋白酶除去变性蛋白质。

但值得提出的是用溶菌酶处理时，它能水解构成枯草菌等菌体膜的多糖类。

能溶解菌的酶分布很广。

除溶菌酶外，蜗牛酶及纤维素酶也常被选为破坏细菌及植物细胞用。

Ⅳ表面活性剂处理：较常用的有十二烷基磺酸钠、氯化十二烷基吡啶及去氧胆酸钠等。

此外一些细胞膜较脆弱的细胞，可把它们置于水或低渗缓冲剂中透析将细胞胀破。

2.蛋白质的分离纯化从破碎材料或细胞器提出的蛋白质是不纯的，需进一步纯化。

分离纯化蛋白质的方法很多,对于不同的目标产物,分离纯化方法不同。

2.1粗提通常是将蛋白质提取液中的其它的杂蛋白、多糖、脂类、核酸及肽类等除去。

常用的方法是沉淀法。

2.1.1 盐析沉淀法蛋白质的盐溶和盐析是中性盐显著影响球状蛋白质溶解度的现象。

其中,加入中性盐能降低蛋白质溶解度的现象称盐析，反之，为盐溶。

盐析沉淀法是根据不同蛋白质在一定浓度盐溶液中溶解度降低程度不同达到彼此分离的方法。

蛋白质易溶于水，因为其分子的-COOH、-NH2和-OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成 1～100 nm 大小的亲水胶体，从而削弱了蛋白质分子之间的作用力。

蛋白质分子表面亲水基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力就越大，因而溶解度也越大。

亲水胶体在水中的稳定因素有两个，即电荷和水膜。

当加入中性盐像MgCl2、(NH4)2SO4、NaCl时，它们的亲水性大于蛋白质分子的亲水性，这样盐离子与水分子就对蛋白质分子的极性基团产生影响，使蛋白质在水中溶解度增大，但盐浓度增加一定程度时，水的活度降低，蛋白质表面的电荷大量被中和，水化膜被破坏，于是蛋白质相互聚集而沉淀析出。

2.1.2 核酸沉淀法主要是除去蛋白质提取液中的核酸。

该法可用核酸沉淀剂和氯化锰、硫酸鱼精蛋白或链霉素等。

必要时也可用脱氧核糖核酸酶除去核酸。

即在粗匀浆中加入少量 DNase,于4℃保温30～60min，可使DNA降解为足够小的碎片，以致不影响以后的纯化。

2.1.3 等电点沉淀法每种蛋白质都有自己的等电点，而且蛋白质在等电点时的溶解度最低，相反有些蛋白质在一定PH值时很容易溶解，所以可以调节溶液的PH值来分离纯化蛋白质，称为等电点沉淀法。

蛋白质的等电点(pI)即蛋白质的净电荷为零时PH 值，由于等电点时的蛋白质净电荷为零，因而失去了水化膜和分子间的相斥作用，疏水性氨基酸残基暴露，蛋白质分子相互靠拢聚集，最后形成沉淀析出。

2.1.4 有机溶剂沉淀法有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度降低。

有机溶剂与水作用能破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质在一定浓度的有机溶剂中沉淀析出。

常用的有机溶剂是乙醇和丙酮，由于有机溶剂的加入易引起变性失活，尤其是乙醇和水混合释放热量，操作一般宜在低温下进行，且在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以免局部浓度过大。

用此法所析出的沉淀一般比盐析法易过滤或离心沉降，分离后的蛋白质沉淀应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂的浓度。

2.2 精提经过粗提取后，以基本获得了我们想要的目的蛋白，但是由于在粗提过程中引入了一些其它物质，像盐析时加入了中性盐，有机溶剂沉淀时加入乙醇和丙酮等，因此，我们需要对粗提物做进一步的分离纯化。

常用的方法有透析法、超滤法、离心法、层析法、电泳法、萃取法等。

2.2.1透析和超滤透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。

透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。

超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。

这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。

蛋白质经过盐析、盐溶处理后可用此方法除去中性盐离子。

2.2.2 离心法离心也是经常和其它方法联合使用的分离蛋白质的方法。

当蛋白质和杂质的溶解度不同时，我们可以选择用离心的方法将它们分开。

离心法包括速度区带离心和差速离心。

Ⅰ速度区带离心该方法是根据颗粒在介质中的沉降速度不同来分离样品的方法，将样品置于一密度梯度介质（如蔗糖、氯化铯等）顶层，在离心力的作用下样品中的各组分以不同的沉降速度沉降，当颗粒的沉降速度与密度的浮力相等时，颗粒就停留在该密度区域内，使各组分达到分离的目的，如果离心时间太长所有的物质都会沉淀下来，故需选择最佳分离时间。

Ⅱ差速离心主要采用逐步提高离心速率的方法分离不同大小的物质，起始时的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清中，收集沉淀，改用较高的离心速率离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。

差速离心一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒，进行差速离心时，首先要选择好颗粒沉降所需要的离心力和离心时间，离心力过大或离心时间过长，容易导致大部分或全部颗粒沉降及颗粒被挤压损伤。

2.2.3 层析法在众多的分离纯化技术中，层析是一门关键的技术,它通常在分离工序的后部,决定着产品的纯度和收率。

和其它分离技术相比,层析技术具有以下特点:1) 分离效率高；2)和电泳分离相比,层析过程易于放大,易于自动；3)层析技术适用性广。

层析分离是基于固定相对流动相中各组份阻滞能力的大小,各种层析方法,其阻滞机理不同。

根据固定相对物料组份阻滞机理的不同,层析可分为分子筛层析、离子交换层析、疏水作用层析、反相作用层析、亲和层析等。

Ⅰ分子筛层析也称凝胶过滤或凝胶层析，是根据蛋白质的分子大小不同分离蛋白质的最有效的方法之一。

其原理是，不同的蛋白质流经凝胶层析柱时，比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内的网状结构，而被排阻在凝胶珠之外，随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外；反之，比凝胶珠孔径小的分子进入凝胶网孔而受阻滞，流速缓慢，致使最后流出柱外。

由于物质在分离过程中的阻滞减速现象，有人也称之为阻滞扩散层析、排阻层析等。

目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。

Ⅱ离子交换层析（Ion exchange chromatography,IEC)IEC是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。

生物大分子与离子交换剂之间的相互作用主要是静电作用。

层析中,基质由带有电荷的树脂或纤维素组成。

阳离子交换剂如：羧甲基纤维素、CM-纤维素，阴离子交换剂如二乙氨基乙基纤维素。

离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化，当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH 或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来，用此法分离纯化蛋白质，不但可以保存分离物的活性，而且分辨率较高。

Ⅲ疏水作用层析和反相作用层析两者都是利用组份间疏水性的差异分离各组份，用于疏水作用层析、反相作用层析的固定相表面都带有疏水作用基团。