Protocol蛋白质纯化步骤
蛋白质一般的纯化流程(共15张PPT)
蛋白質一般的純化流程
純化流程
Cell or organ lysis salting out 、 dialysis
protein concentration of quantitation enzyme activity test
Purification(純化)
Chromatography
(gel filtration、ion exchanger、affinity chromatography etc. HPLC)
取出沉澱物，並標示鹽析濃度
上清液重複上述步驟， 作ammonium sulfate
至飽和度100%
分別取出其沉澱物準備透析
透析
沉澱物以buffer溶解
將溶液置於透析管中
在0.01M 、pH=7的phosphate buffer中
進行4℃透析隔夜
溶解：溶質均勻分佈在水溶液中
鹽析（Salting Out)
利用鹽類與水的交互作用大於水與蛋白質 的交互作用將蛋白質沈降出來
Ammonium Sulfate
Ammonium Sulfate Fraction Ammonium Sulfate % Saturation (p. 31)
透析膜透析
• 透析管：Sectra / Por memebrance
蛋白质纯化步骤
蛋白质纯化步骤蛋白质纯化，这可是个有趣又重要的事儿啊！就好像从一堆乱糟糟的杂物里找出你最宝贝的那个小物件一样。
首先呢，得准备好你的原料，这就好比要踏上旅程，得先有个出发地呀。
这原料可以是各种生物样本，比如细胞啦、组织啦等等。
然后呢，就是把这些原料进行破碎处理，让里面的蛋白质能跑出来，就像是打开一个神秘的盒子，让宝贝有机会现身。
接下来，就到了关键的一步啦，选择合适的方法来分离这些蛋白质。
这就好像在一个大集市里，要把你想要的东西挑出来。
可以用盐析法呀，就像是用一把特殊的筛子，把蛋白质筛出来；还有层析法，就如同让蛋白质们排队，按照它们的特点依次通过不同的关卡。
哎呀，这过程可不简单呢！每一步都需要精心操作，稍有不慎，可能就把珍贵的蛋白质弄丢啦。
就好像走钢丝一样，得小心翼翼的。
在纯化的过程中，还得注意各种条件哦。
温度啦、酸碱度啦，这些都像是蛋白质的小脾气，得顺着它们来。
不然它们一不高兴，可就不乖乖听话啦。
然后呢，经过一轮又一轮的筛选和分离，慢慢的，我们就能得到纯度比较高的蛋白质啦。
这感觉，就像是经过千辛万苦，终于找到了那传说中的宝藏一样令人兴奋！你想想看，从一开始那乱糟糟的一堆，到最后得到纯净的蛋白质，这是多么神奇的过程呀！这就好比把一块粗糙的石头，经过精心打磨，变成了一颗闪闪发光的宝石。
而且啊，蛋白质纯化的意义可重大啦！它可以帮助我们更好地了解蛋白质的性质和功能，为医学研究、药物开发等提供重要的支持。
这不就像是给我们打开了一扇通往未知世界的大门吗？总之呢，蛋白质纯化可不是一件容易的事儿，但只要我们用心去做，就一定能收获满满呀！就像那句话说的，世上无难事，只怕有心人嘛！让我们一起加油，去探索蛋白质纯化的奇妙世界吧！。
动物固体组织蛋白提取-Protocol
动物固体组织蛋白提取1、前夜将磁珠及匀浆管洗净置入75%乙醇中浸泡。
早晨取出磁珠和匀浆管，自然晾干；也可放入烤箱中，速度较快。
2、裂解液配制：：100：1，现配现用。
（100010）。
置入4℃冰上。
3、抽蛋白（应冰上进行）：a、适量组织（最好放入液氮中反复研磨成粉状）加入裂解液中。
一般10管体系中加入：7-8粒磁珠、100组织、110、1 。
b、匀浆。
手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8分钟），充分研碎，使组织匀浆化。
机器匀浆：用组织捣碎机10000～15000上下研磨制成10％组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3～5次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。
超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用40安培，5秒/次，间隙10秒反复3～5次。
反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶3次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复3次左右），但有部分酶活力会受影响。
c、将组织匀浆转入1.5的管中（管、离心管）。
12000 4°C 离心15。
d、离心后管中液体分三层，提取中间无色液相，移入新的管中。
可-80℃保存。
4、蛋白浓度测定。
a、配工作液：溶液A：溶液50：1（200：4）。
*200；2*（1+1）*4。
需测试复孔。
标本X，则需Ac、复孔，取蛋白6加入0.6管，再加入542O，混匀。
即10倍稀释。
d、取20-25 10倍稀释蛋白样本加入96孔板平底板内，再加入200工作液，混匀振荡后，37℃30。
注：应现加蛋白样本，再加工作液。
蛋白纯化protocol
诱导表达1、挑取含重组质粒的单菌落至５ml LB〔含抗性〕培养基中37℃过夜培养。
2、按1∶100比例稀释过夜菌，一般将５０µl菌接种到含５mlLB〔含抗性〕培养基的5 ml试管中, 37℃震荡培养至OD600≌0.4－0.8〔最好0.6，单抗大约需２－２.5 hr，双抗大约需３－３.５hr〕。
3、取局部液体作为未诱导的对照组,余下的参加诱导剂至终浓度作为实验组,两组继续在适宜温度下震荡培养４hr。
4、分别取菌体0.5 ml, 离心10000g× 1 min收获沉淀，用４０µl 蛋白loading buffer重悬，混匀，煮沸５min。
5、离心10000 g× 5 min，取上清作为样品,可做SDS-PAGE等分析。
蛋白质纯化亲和层析一、样品准备1) 准备细胞，接种，诱导表达。
对于实验室用的pET载体表达系列，在细胞OD600=0.4-0.8时，用IPTG诱导1-4小时，可以获得理想的表达效率。
收集细胞，置于-20 ℃或立即进展步骤2操作。
2) 用Binding Buffer重悬清洗细胞，混匀，离心收集菌体。
再参加1/20细胞生长体积的Binding Buffer，将菌体悬浮起来，混匀，冰上超声破碎细胞。
3) 10000 g，4℃离心20－30 min。
取上清，置于冰上备用或-20度保存。
二、层析1) 将处理好的NTA树脂装入适宜的层析柱，将样品加到NTA层析柱中，流速控制在0.5-1 ml/min左右，收集流出局部，用于SDS/PAGE 分析蛋白质的结合情况。
3) 用大约5倍柱体积的Binding Buffer洗，流速控制在0.5-1 ml/min左右，直到紫外监测数值根本无变化4) 分别用2－5倍柱体积的梯度Elution Buffer洗脱，咪唑浓度分别为40mM，60mM，80mM，100mM，120mM，500mM。
流速控制在0.5-1ml/min左右，收集洗脱液。
蛋白质分离纯化的一般程序
蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤:(一)材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时,首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态,不丧失活性。
所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。
常用的破碎组织细胞的方法有: 1. 机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用,使细胞破碎。
常用设备有,高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。
2. 渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。
3. 反复冻融法生物组织经冻结后,细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。
这种方法简单方便,但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。
4. 超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。
5. 酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。
(二) 蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。
抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。
如膜蛋白的抽提,抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂(十二烷基磺酸钠、tritonX-100等),使膜结构破坏,利于蛋白质与膜分离。
在抽提过程中,应注意温度,避免剧烈搅拌等,以防止蛋白质的变性。
(三)蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。
比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。
常用的有下列几种方法:1. 等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同,可用等电点沉淀法使它们相互分离。
2. 盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同,所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。
被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质,并能再度溶解而不变性。
3. 有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮,它们的介电常数比水低。
能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低,进而从溶液中沉淀出来,因此可用来沉淀蛋白质。
此外,有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层,促使蛋白质分子变得不稳定而析出。
由于有机溶剂会使蛋白质变性,使用该法时,要注意在低温下操作,选择合适的有机溶剂浓度。
蛋白质纯化实验流程
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1. 蛋白质样品，含有目标蛋白质的溶液，例如细胞裂解液、组织提取物或发酵液。
蛋白质分离纯化的方式
蛋白质分离纯化的方式分离纯化某一特定蛋白质的一般程序可以分为前处理、粗分级、细分级三步。
1.前处理：分离纯化某种蛋白质，首先要把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来并保持原来的天然状态（如果做不到呢？比如蛋白以包涵体形式存在），不丢失生物活性。
为此，动物材料应先提出结缔组织和脂肪组织，种子材料应先去壳甚至去种皮以免手单宁等物质的污染，油料种子最好先用低沸点（为什么呢）的有机溶剂如乙醚等脱脂。
然后根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。
动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆机破碎或用超声波处理破碎。
植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般需要用石英砂或玻璃粉和适当的提取液一起研磨的方法或用纤维素酶处理也能达到目的。
细菌细胞的破碎比较麻烦，因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一个借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。
破碎细菌细胞壁的常用方法有超声波破碎，与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理等。
组织和细胞破碎后，选择适当的缓冲液把所要的蛋白提取出来。
细胞碎片等不溶物用离心或过滤的方法除去。
如果所要的蛋白主要集中在某一细胞组分，如细胞核、染色体、核糖体或可溶性细胞质等，则可利用差速离心的方法将它们分开，收集该细胞组分作为下步纯化的材料。
如果碰上所要蛋白是与细胞膜或膜质细胞器结合的，则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚，然后用适当介质提取。
2.粗分级分离：当蛋白质提取液（有时还杂有核酸、多糖之类）获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白与其他杂蛋白分离开来。
一般这一步的分离用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。
这些方法的特点是简便、处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白溶液。
有些蛋白提取液体积较大，又不适于用沉淀或盐析法浓缩，则可采用超过滤、凝胶过滤、冷冻真空干燥或其他方法进行浓缩。
3.细分级分离：样品经粗分级分离以后，一般体积较小，杂蛋白大部分已被除去。
蛋白纯化protocol
诱导表达1、挑取含重组质粒的单菌落至５ml LB（含抗性）培养基中37℃过夜培养。
2、按1∶100比例稀释过夜菌，一般将５０µl菌接种到含５ml LB（含抗性）培养基的5 ml试管中, 37 ℃震荡培养至OD600≌0.4－0.8（最好0.6，单抗大约需２－２.5 hr，双抗大约需３－３.５hr）。
3、取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入诱导剂至终浓度作为实验组,两组继续在合适温度下震荡培养４hr。
4、分别取菌体0.5 ml, 离心10000 g × 1 min收获沉淀，用４０µl蛋白loading buffer重悬，混匀，煮沸５min。
5、离心10000 g × 5 min，取上清作为样品,可做SDS-PAGE等分析。
蛋白质纯化亲和层析一、样品准备1) 准备细胞，接种，诱导表达。
对于实验室用的pET载体表达系列，在细胞OD600=0.4-0.8时，用IPTG诱导1-4小时，可以获得理想的表达效率。
收集细胞，置于-20 ℃或立即进行步骤2操作。
2) 用Binding Buffer重悬清洗细胞，混匀，离心收集菌体。
再加入1/20细胞生长体积的Binding Buffer，将菌体悬浮起来，混匀，冰上超声破碎细胞。
3) 10000 g，4 ℃离心20－30 min。
取上清，置于冰上备用或-20度保存。
二、层析1) 将处理好的NTA树脂装入合适的层析柱，将样品加到NTA层析柱中，流速控制在0.5-1 ml/min左右，收集流出部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况。
3) 用大约5倍柱体积的Binding Buffer洗，流速控制在0.5-1 ml/min左右，直到紫外监测数值基本无变化4) 分别用2－5倍柱体积的梯度Elution Buffer洗脱，咪唑浓度分别为40mM，60mM，80mM，100mM，120mM，500mM。
流速控制在0.5-1ml/min左右，收集洗脱液。
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Protocol蛋白质纯化方法（镍柱）柱前操作1.IPTG诱导后，收菌，8000rpm/min(r/m)离心10min;2.用Binding Buffer（BB）溶解（每100ml原菌液加BB 20ml),超声裂解30min（工作：5s,停止：5s)，1500r/m离心10min,去除杂质；3.取上清，12000r/m离心20min, 得包涵体；4.用含2M尿素的BB洗包涵体，12000r/m离心20min,(上清做电泳）；？？？5.用含6M尿素的BB溶解包涵体，12000r/m离心20min,(上清做电泳）；6.对照电泳结果，将上清或包涵体溶解液上柱；平衡柱子（柱体积：V）7. 3V（3倍柱体积）ddH2O(洗乙醇）；8. 5V Charge Buffer（CB); ？？？9. 3V BB;柱层析10.上样；11. 10V Washing Buffer（WB）；12. 6V Elute Buffer（EB);13.分管收集，每管1~2ml.各种缓冲液配方1. 8×BB: 4M NaCl, 160mM Tris-HCl, 40mM imidazole(咪唑），pH=7.91000mlNaCl: 58.44×4=233.76gTris-HCl: 121.14×160×10-3=19.3824gImidazole: 68.08×40×10-3=2.7232g2. 8×CB: 400mM NiSO41000mlNiSO4: 262.8×400×10-3=105.12g3. 8×WB: 4M NaCl, 160mM Tris-HCl, 480mM imidazole, pH=7.91000mlNaCl: 233.76g, Tris-HCl:19.3824g, Imidazole: 32.6784g4. 4×EB: 2M NaCl, 80mM Tris-HCl, 4M imidazole, pH=7.91000mlNaCl: 118.688g, Tris-HCl:9.6912g, Imidazole: 272.32g5. 6M 尿素1000ml尿素：60.06×6=360.36gNi柱纯化蛋白注意事项(2011-10-13 16:01:39)使用Ni柱纯化带有His标签的融合蛋白，是我们大家再熟悉不过的实验操作了。
我们对整个操作的流程及注意事项，很可能是师从兄师姐那里获得的。
这些经验都是大家智慧的结晶。
同时，这也有一定的不足之处，那就是我们学习到的是局部，还有一些我们不常用或者基本不会接触到的面儿，那些知识我们应该从哪里掌握呢？给大家推荐一个办法，那就是参考那些大公司的实验手册。
一般像GE、Qia gen等知名公司，都有Ni柱柱材料的产品，因此关于柱材料的各种性质参数，以及使用方法和注意事项都有详细的说明。
下面我就列举一些我从这些实验手册里总结出来的一部分Tips，仅供参考。
1. 避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团，比如：NH4，甘氨酸，精氨酸，Tris，等等；2. 各种缓冲液中不能有强螯合剂，如EDTA，EGTA，等等；3. 各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂，，比如DTT，防止二价Ni被还原；4. 不能含离子型的去垢剂，比如SDS，防止Ni流失；5.在破碎细胞的时候建议加入蛋白酶抑制剂，比如0.1-1mM的PMSF，防止目的蛋白被降解；6. 缓冲液里可以加入甘油，防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀，甘油浓度最高可达50%（v/v）7. 应避免含碳酸氢钠，柠檬酸等物质；8. 缓冲液里NaCl的浓度应在300mM到2M之间；9. 可加入变性剂促溶，盐酸胍（最高可6M），尿素（最高可8M）10.可加入非离子型去垢剂，如Triton，Tween，NP40等，最高2%，可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染；？？？Ni柱纯化His-tag蛋白质一非变性条件下抽提His-Tag蛋白质下列方法适用于从细菌中抽提通常含有连续6个组氨酸尾（His Tag Protein）的具有天然结构的可溶性重组蛋白质（NativeProtein）。
其他来源的蛋白质样品，如果目标蛋白质具有His-Tag结构，提供的层析方法可供参考。
1.样品准备1) 准备细胞，接种，诱导表达。
对于实验室用的pET载体表达系列，在细胞OD600=0.5-0.8时，用1mM IPTG诱导1-3小时，可以获得理想的表达效率。
收集细胞，置于-70度或立即进行步骤2操作。
2) 加入1/20细胞生长体积的NTA-0 Buffer（20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10% Glycerol）和PMSF。
PMSF用无水乙醇配制成200mM 储存液，-20度或4度保存；PMSF使用的工作浓度位1mM；注意：PMSF 见水分解，需要在使用前加入。
该步骤冰上操作。
3)将细胞悬浮起来，加入溶菌酶（工作浓度位0.2-0.4mg/ml，如果表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE，可以不加溶菌酶），混匀，冰上放置30分钟，超声或匀浆破碎细胞。
该步骤冰上操作。
4)加入10%Triton X-100, 使Triton的终浓度为0.05%，充分混匀，冰上放置15分钟，间或混匀）；冰上超声破碎细胞，同时降低粘稠度。
5)加入1M MgCl2，使MgCl2的终浓度为1mM，混匀。
加入DNase, 使DNase的终浓度为10mg/ml，混匀，室温放置10分钟。
？？6)5000转/分（20,000xg以上），4度离心15分钟以上。
取上清，置于冰上备用或-20度保存。
2．层析1) 将NTA树脂装入合适的层析柱，层析用10倍NTA体积的NTA-0 Buffer洗。
2)将样品（步骤2（6））加到NTA层析柱中，流速控制在15ml/小时左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况。
3)层析用5倍NTA体积的NTA-0 Buffer洗，流速控制在30ml/小时左右。
4)分别用5倍NTA体积的NTA-20，NTA-40，NTA-60，NTA-80，NTA-100，NTA-200，NTA-1000 Buffer洗脱，流速控制在15ml/小时左右，收集洗脱液，每管收集一个NTA体积。
5)确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。
最为有效的方式是SDS/PAGE分析。
也可以用BBST的Bradford 蛋白质测定试剂盒，快速确定蛋白质的含量，然后用SDS/PAGE分析蛋白质的分布。
6)目标蛋白质需要进一步纯化需要根据蛋白质的用途确定。
纯化的目标蛋白质的保存条件需要根据蛋白质的性质和用途确定。
附溶液配方：NTA-0 Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol,NTA-20 Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 20mM Imidazole(咪唑)NTA-40 Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 40mM Imidazole(咪唑)NTA-60Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 60mM Imidazole(咪唑)NTA-80Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 80mM Imidazole(咪唑)NTA-100Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 100mM Imidazole(咪唑)NTA-200Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 200mM Imidazole(咪唑)NTA-1000 Buffer:20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 10% Glycerol, 1000mM Imidazole (咪唑)二变性条件下从包涵体中纯化His-Tag的蛋白质有些蛋白质细菌或其他细胞中表达效率很高，但溶解性很差，通常形成包涵体。
这些蛋白质的溶解通常需要用盐酸胍或尿素。
与MBP和GST的亲和层析材料相比，NTA树脂可以在6M的盐酸胍存在的情况下与具有His Tag的蛋白质结合。
整个层析过程都是在有盐酸胍的条件下进行。
纯化后的蛋白质需要进行复性，正确复性的蛋白质才具有生物学活性。
下列方法（步骤4-5）用于从细菌中抽提含His-Tag位于包涵体变性蛋白质。
1．样品准备1)准备细胞，接种，诱导表达。
对于实验室用的pET载体表达系列，在细胞OD600=0.5-0.8时，用1mM IPTG诱导1-3小时，可以获得理想的表达效率。
收集细胞，置于-70度或立即进行步骤2操作。
2)加入1/20细胞生长体积的GuNTA-0 Buffer（20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10% Glycerol, 6M Guanidium HCl ）和PMSF。
PMSF用无水乙醇配制成200mM储存液，-20度或4度保存；PMSF使用的工作浓度位1mM；注意：PMSF见水分解，需要在使用前加入。
3)将细胞悬浮起来，冰上超声破碎细胞，降低粘稠度。
4)室温放置30分钟，间或混匀或用磁力搅拌。
5)15000转/分（20,000xg以上），4度离心15分钟以上。
取上清，置于冰上备用或-20度保存。
2．层析1)将NTA树脂装入合适的层析柱，层析用10倍NTA体积的GuNTA-0 Buffer洗。
2) 将样品（步骤2（5））加到NTA层析柱中，流速控制在15ml/小时左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况。
3)层析用5倍NTA体积的GuNTA-0 Buffer洗，流速控制在30ml/小时左右。
4)分别用5倍NTA体积GuNTA-20，GuNTA-40，GuNTA-60，GuNTA-100，GuNTA-500洗脱，流速控制在15ml/小时左右，收集洗脱液，每管收集一个NTA体积。
5)确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。
最为有效的方式是SDS/PAGE分析。
也可以用BBST的Bradford 蛋白质测定试剂盒，快速确定蛋白质的含量，然后用SDS/PAGE分析蛋白质的分布。
6)目标蛋白质需要进一步纯化需要根据蛋白质的用途确定。
7)纯化的目标蛋白质需要复性，复性常用的手段可以参考有关手册确定的原则，根据蛋白质的特性来摸索具体的方案。