从全血中抽提白细胞
全血基因组DNA的提取
分子生物学检验技术
分子生物学
研究对象
分子水平
探讨生命现象
2021/11/2
DNA及RNA
其表达产物蛋白质 功能 遗传 关系、作用
以超乎想象的速度飞速发展，渗透到医学每一个领域。
与临床检验诊断学关系
使疾病诊断深入到基因水平
基因诊断
可以毫不夸张的说，如果没有分子生物学的应用， 人类探索生命活动的行为将会寸步难行。
GenTLE solution Ⅰ： 破坏血细胞同时，与核酸形成电中性的复合体。 GenTLE solution Ⅱ： 复合体离心收集后清洗，洗涤作用。
GenTLE solution Ⅲ： 将DNA从核蛋白中解离出来。
异丙醇：将DNA沉淀回收。
70%酒精：利用DNA不溶于酒精的特性，去除DNA沉淀中 残留的盐类分子。
2021/11/2
5. 电泳系统的变化会影响DNA的迁移，加入DNA标准参照 物进行判定是必要的。 6. DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品 应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。 7. DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状 及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA 分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶 的浓度。小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以 提高分辨率。
1.缓冲系统：注意缓冲液的使用是否正确。 2.凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一 致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。 倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电泳结果。 3.样品加入量：加样量的多少依据加样孔的大小及DNA 中片段的数量和大小而定，过多的量会造成加样孔超载， 从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。
实验样品采集运输保存方法
实验样品采集运输保存方法1. RNA实验样品采集、保存方法1.1 使用范围及样品量类别：Microarray Service；Sequencing Service; PCR Array& PCR Service样本量：样本样本量动物组织样品50-100mg哺乳动物培养细胞样品（悬浮细胞）1*107个哺乳动物培养细胞样品（贴壁细胞）15cm2植物组织样品100mg-1g，根据植物不同部位的组织决定组织需要量，尽可能多些，但不必超过1g1.2 动物组织样品1.2.1 新鲜组织样品A. 使用RNAlater试剂取新鲜组织（注：动物死亡后尽快在10min内取材），组织块以PBS或生理盐水清洗干净，所用组织必须切至厚度在0.5cm一下，然后放入装有5倍体积RNAlater的离心管（或冻存管）中。
4度孵育过夜，此时样品管需要横臵以便组织块充分接触到RNAlater，然后转入-20中保存，样品在-20不会冻结，但溶液中可能会有一些晶体出现，这并不影响后续的RNA抽提。
B. 使用Trizol试剂取新鲜组织（1min以内），组织块以PBS或生理盐水清洗干净，每50-100mg组织加入1ml Trizol溶液匀浆裂解组织样品，最好冰上进行操作。
匀浆的裂解液4度短期保存（1month），-20或者-70度长期保存。
1.2.2 冻存组织生物体死亡后尽快（10min以内）切取新鲜组织，并以PBS或生理盐水清洗干净切成小块；培养液倒入离心管中，离心沉淀细胞，弃去上清液。
细胞沉淀（1*107个）中加入1ml Trizol裂解液反复吸打几次后，目视可见细胞层溶液完全-70保存1.3 贴壁细胞从培养容器中吸出并弃去培养液培养瓶直接加入Trizol试剂，Trizol用量与细胞贴壁面积有关，15cm2细胞贴壁面积加入1mlTrizol。
反复吸打几次后，目视可见细胞层溶解完全。
-70度保存。
1.4 植物组织样品准确取得所需新鲜组织后，如有必要可用PBS清洗干净，将所用组织切碎，装入冻存管中或者用锡箔包裹好。
去白细胞血的临床应用推荐
（二）阻止或延缓HLA同种免疫
1、白细胞抗原的同种免疫发生率为39%（20%～71%）； 2、诱发HLA同种免疫的白细胞阈值为5x106/单位血； 3、HLA同种免疫是血小板输注无效的主要原因； 4、去除白细胞可显著降低HLA同种免疫发生率（多次 妊娠者效果差）。
*目前“去白”输血已成为减少同种免疫和 预防血小板输注无效的标准输血方法。
因子。
*相对于去除白细胞的优点，缺点微 不足道。
27
七、质量评估
（一）要求：既能有效地清除白细胞，又能保证有效成分足 够回收；
（二）过滤条件标准化并进行有效质控； （三）准确计数残留白细胞至关重要：
1、当WBC<100/μ1时，血细胞计数仪无法检测；
2、血涂片间接计数更不可靠； 3、Nageotte计数板，流式细胞仪、PCR计数法较可靠； 4、Nageotte计数板（大容量计数板，腔体容积50µl）可准确
*目前国际上仅使用（五）和（六）两法。
9
※表6 去除红细胞中白细胞方法比较
方法
白细胞去除率（%） 红细胞回收率（%）
离心法
65-88
83-92
冰冻融化法
90-98
80-90
洗涤法 过滤法
80-90 >99
70-80 90-96
10
※表7 去除血小板中白细胞方法比较
新型血细胞分离机制备法
过滤法
血小板损失
3
※表1 血液及血液成分中白细胞含量*
血液成分
新鲜全血 浓缩红细胞 去白膜红细胞 洗涤红细胞 冰冻去甘油红细胞 手工采血小板 机采血小板 新鲜冰冻血浆
*400ml为1U
白细胞含量（个/U*）
109 108-109
全血、去白细胞全血和去白细胞悬浮红细胞储存期末溶血率比较
全血、去白细胞全血和去白细胞悬浮红细胞储存期末溶血率的比较【摘要】目的比较全血、去白全血和去白细胞悬浮红细胞储存期末溶血率。
方法选择60袋400ml全血，随机分为a、b﹑c三组，每组各20袋，a组为全血，b组为去白全血，c组为去白细胞悬浮红细胞。
轻轻混匀通过无菌结合机，分别取样本﹙4±2﹚℃保存至储存期末，检测存期末的总血红蛋白浓度，血细胞比容和上清游离血红蛋白的浓度，计算储存期末溶血率。
结果储存期末溶血率，c组高于a﹑b两组，差异具有统计学意义（p<0.05）；a、b两组比较，差异无统计学意义。
结论血液在制备过程中，过滤和离心使红细胞的脆性增加和去除血浆后内环境的改变，在一定程度上都会影响红细胞储存期末溶血率。
【关键词】全血；去白细胞全血；去白细胞悬浮红细胞；储存期末溶血率溶血是红细胞膜的完整性受到破损或裂解释放血红蛋白引起血浆颜色改变，储存期末红细胞制品的溶血程度是评价保存红细胞质量的重要参数，常用溶血率来表示。
虽然已有多种措施能提高红细胞在血液制备、保存和运输过程中的稳定性，但红细胞离体后仍将增加溶血的危险，其溶血率并随保存期的延长而明显升高。
红细胞制品中游离血红蛋白含量过高，对于接受输血治疗的患者具有潜在的安全隐患[1]。
《全血及成分血质量要求（gb18469-2012）》中增加了红细胞储存期末溶血率标准，作者于2012年8～12月对全血﹑去白全血和去白细胞悬浮红细胞储存期末溶血率进行比较。
现报告如下。
1材料与方法1.1材料采血用由山东威高集团医用高分子有限公司提供的采血袋与白细胞过滤器一体的四联袋（血液保存液为cpd-a；红细胞保存液为map，含腺嘌呤、甘露醇﹑氯化钠﹑枸橼酸﹑枸橼酸钠、葡萄糖和磷酸二氢钠），大容量低温离心机（德国贺力士），低温操作台，分浆夹，热合机，无菌结合机，冰箱（4℃±2℃，日本sanyo 公司）。
3讨论由表ⅰ可以看出，三种不同血液制品储存期末溶血率均低于0.8%，符合《全血及成分血质量要求（gb18469-2012）》，但也发现储存期末溶血率c组与a﹑b两组比较差异都具有统计学意义（p<0.05），分析其原因可能为：①在滤除白细胞过程中，过滤前混匀时对血袋的摇晃或震荡会导致部分红细胞的脆性增加以及衰老红细胞的溶解[2]。
血液中去除白细胞技术方法的研究探讨
血液中去除白细胞技术方法的研究探讨目的通过探讨血液中去除白细胞的不同技术方法，掌握白细胞滤除率，确保临床用血有效性。
方法根据血液品种需要，采用不同血袋，分别采用成分制备后过滤法、采血6 h内、8 h后直接过滤后制备悬浮红细胞法，分析过滤后白细胞滤除率、红细胞回收率指标。
结果制备后过滤法可以制备各种血液成分，保障了血小板和新鲜冰冻血浆的质量。
制备后过滤法、6 h内直接过滤法与8 h 后直接过滤法白细胞残留量、血红蛋白含量、过滤时间差异有统计学意义。
采血8 h后直接过滤法适合用于乡镇或路程较远的县城采血、减少滤器堵塞情况。
结论三种过滤法制备的去白细胞悬浮红细胞均符合GB18469-2012《全血及成分血质量要求》要求。
血站可根据采血实际情况选择不同方法。
标签：去除白细胞采血时间制备方法去白细胞血液成分是现阶段国内外一致公认的既安全又高效的血液成分之一，国内文献报道输血反应率为0.32%～0.45%[1]，去白细胞血液输注在临床中已开始应用。
如何更有效去除血液中的白细胞，提高红细胞收集率，各地血站均在探讨。
本站于2012年科研立项开展血液去白细胞技术研究，通过不同方法了解分析去除白细胞数据，为不断提高临床用血安全、有效提供有力依据。
1资料与方法1.1一般资料2012～2013年在本站参加无偿献血者705人，献血量为200 mL、300 mL、400 mL，以采血时间将其分为三组。
1.2制備方法用含CPD方或ACD-B或CPDA方保养液的带白细胞过滤器的采血袋采集，在采血后直接成分制备后过滤、6 h后先过滤后成分制备、8 h 后先过滤后成分制备[2]。
成分制备后过滤法：在采血6 h内分离制备浓缩血小板、新鲜冰冻血浆、悬浮红细胞，30 min～2 h内接驳过滤；6 h内先过滤后成分制备：采用即采即滤型一次性去白细胞多联采血袋采集全血，在采血后6 h内直接过滤。
然后制成去白细胞悬浮红细胞。
8 h后直接过滤法：采用隔夜过滤型一次性去白细胞多联采血袋采集全血，在采血后8 h以上至48 h内直接过滤，制成去白细胞悬浮红细胞。
浅谈去白细胞输血对肿瘤患者免疫
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学 术 探 讨
Ａ ａ ｅ ｃ Ｓｕ ｙ ｃ ｄ ｍｉ ｔｄ
６１・
Ｃｈｎ ｓ ｏ ｒ ａ ｆＥｔ ｎ ｍｅ ｉｉｅ ａ பைடு நூலகம் Ｅｔ ｎ ｐ ｒ ｃ ｉｅｅ Ｊ ｕ ｎ ｌｏ ｈ ｏ ｄｃｎ ｎ ｈ ｏ ｈａｍａ ｙ
浅 谈 去 白细胞 输 血 对 肿 瘤 患者 免疫
自从 Ｌ ｎ ｓ ｅ ｎ ｒ ａ ｄ ｔ ｉｅ 发现 红 细 胞 Ａ ０ 型 系统 开始 ，输 血 逐 瘤生长 、转移 的作用 ，且该作用能被动的传递给未接受过血 Ｂ血 渐成 为了临床疾病 治疗 的一种有 效措施 。近 二十年 来，随着 制 品的动物 ，这种作用与异基 因血 中的 白细胞有关 。许多研 输血技术 日臻完善及多学科技术领域 的融入 ，使其得到 了划 究结果也表 明，异基 因输血有促进肿瘤生长、转移 的作用 。 白细胞 与感染 的相关性 。笔者通过对多例直肠癌手术病 时代 的发展 ，成为一 门由多学科交叉构成 的新 兴医学——输 血医学ｎ。 人进行研究 ，发现去 白细胞成分输注组术后腹腔脓肿、肺 炎 随着 输血 医学的发 展，输血 引起 的一些并发症 ，也逐渐 等感染率均较含 白细胞输注组明显降低；去 自细胞成 分输注 受到人们重视 和公认 。输血 引起 的免疫性和非免疫性副 减少 了输血免疫抑制反应，使术后感染率降低。另外 ，通过 作用 ，都可能对病人 的健康造成伤害 。特别是近些年输血 引 对心外科病人研究发现 ，去 白细胞成分输注 使术后感染率及 起 的受者免疫功能 的变化 ，尤其对肿瘤 患者 的免疫功 能及其 死亡率 明显降低。 预后影响倍受医学界关注 。有关研究指 出输血 引起 的免疫功 些学者对 同种 同系和 同种异系小 鼠的感染模型进行输 能障碍主要与 白细胞及其分解产物有关 ，其 中 白细胞表面抗 血与存活率 的关系分析后证实 ，同系小 鼠输 血后的存 活率明 原Ｍ Ｃ Ｉ及Ｂ 巴细胞表面抗原在诱发Ｈ Ａ Ｈ－ Ｉ 淋 Ｌ 同种 免疫 反应 中可 显高于异系小 鼠输血后的存活率，井认为输血后 由白细胞 携 能发挥着主要作用 。供血 中的白细胞在许 多输血不 良反应 中 带 的删 ｃ 原 的 提 呈 再 免 疫 调 节 和 细 菌 感 染 的 敏 感 性 上 起 相 抗 的作用得到重视 ，并有相 当部分研究得 出两者统计学意义上 当大的作用。 的相关性 。相关 的不 良输血反应 ，如 非溶血性 发热性输血反 ’ 汇 集近年６ 篇前瞻性 随机 临床研究结果 发现 ，肿瘤外科 应 同种免疫 、输血相关移植物抗宿主病 、成人 呼吸窘迫综合 围手术期输注异体血液后细菌感染明显增加，与输注 血制 品 洗 征、亲 自细胞性病毒传播及潜伏病毒激活 、输血相关免疫抑 的 种类 及 输 血 量有 关 。输 注 少 白细 胞 的压 积 红 细 胞／ 涤红 细 制等 。因此 ，通过物理 、化学方法减 除或灭活血液 中的白细 胞，感染率 明显低于输注全血。输注 自体压积红细胞感染率低 胞在 国内外 已成为预防输血副作用的最有效 手段 。 于输注异体洗涤红细胞／ 压积红细胞。输注 自体全血与洗涤 红 细胞／ 压积红细胞 的感染率无 明显差异 。而 输注少 白细胞贮 １ 去白细胞输血定义 即输血 前通 过物理 、化 学方法 减少或 灭活 血液 中的 白 存洗涤 红细胞／ 积红细胞感染 率明显低于输注 全血 ；但输 压 注新鲜 少 白细胞的压积 红细胞３ ４ — 单位 以上 ，则术后感染 率 细胞 的一种输血技术和方法 。主要方法有 ：离 心去 白膜法 、 洗涤法 、冰冻去甘油法 、过滤法 、血 细胞 分离机机采 少 白细 与输注全血无差别 。笔者认为感染率增加的原因与异体血 液 胞成分、紫外线照射血液或血液成分 、 丫射线照射血液或血 中自细胞成分及其分解产物引起受者免疫抑制有关 。 液成分 。其 中过滤法为迄今最有效 、最 常用 的清 除 白细胞 的 ３ 白细胞 与病毒感染的相关性 临床研 究证 实，通过去 白细胞输血可有效地防止主要 寄 方法 ，其特点是清 除率 高、残 留 白细 胞少、有 效成 分回收率 高 、操作简单 、价格适宜，可有效预防Ｆ Ｈ Ｒ Ｌ 同种免疫 生于受感染 白细胞 中的亲 自细胞病毒。一些科学家将 潜伏 感 ＮＴＳ ＨＡ 及 亲 自细 胞 病 毒 的 传 播 。 染Ｈｖ Ｉ的淋 巴细胞 （Ｌ ） （ｃ 与红细胞血小板血浆一起混合培养时， 没有病毒活化的表现 ，而与 白细胞一起 孵育时，发现 培养 液 ２ 输血对肿瘤患者 免疫功 能的影响 Ｉ 抗原浓度升高 ，几天后有Ｈ Ｖ Ｉ 释放，而且释放量 大量动物实验和临床研究表 明：输血可导致肿瘤患者免 上清液 中Ｈ Ｖ 与 白细 胞剂量有关 ，释放 出的ｆ Ｖ ｔ 又感染先 前未感染 的培养 ｌ 疫抑制 ，进一步加重 了肿瘤 患者本 身的免疫功能障碍 ，从而 、 增加术后感染率及促进肿瘤 生长 、转 移及 术后复发，影响预 细 胞 。 以上研究表 明，输注异基 因全血可使受者免疫功能发生 后 ，降低 ５ 年存活率 。研究还表 明输血 的这 种副作用主要 与 抑制 ，从而 导致受者输血后感染率较未输血和输注去 自细胞 异 基 因 中的 自细 胞 有 关 。 白细胞与肿瘤 生长的相关性 。临床研究上用荷瘤小 鼠及 异基 因血及输注 同基 因全血者高，术后恶性肿瘤 的复发率和 荷瘤兔 ，分别为其输注 异基 因全血、 同基因全血及少 白细胞 转移率较未输血和输注去白细胞异基因血及输注 同基因全血者 的异基 因血 ，观察 不同种类 的血制品对肿瘤生长及肺转移结 高，且这些副作用主要与异基因全血中的白细胞密切相关。 节 的影响 。结果发现 ，输注 异基 因全 血的荷瘤小 鼠肺转移结 ４ 围手术期输血 与肿瘤关系的国内外研 究现状 节 数较 输 注 同基 因全 血 及 少 白细 胞 的异 基 因血 的荷 瘤 小 鼠肺 结 国内外学者对围手术期输血与肿瘤的关系均进行 了研究， 节数明显增加：接受同基因全血与少白细胞的异基因血输注的 围术期输血促进恶性肿瘤病人术后复发 的报道首先见于结肠 荷瘤小鼠肺转移结节数无 明显差异。将异基因全血、同基因全 癌，随后相 继报道 发生在肺癌 、乳腺癌及 肾癌等恶性肿瘤 。 些学者认 为围手术期输血可抑制肿瘤患者免疫功能 ，患者 血及少 白细胞 的异基因血分别输注给非荷瘤小鼠／ 非荷瘤 兔， 淋巴细胞亚 分 离其脾 细胞 ，再 分别输 注给 未接 受过 血制 品的荷 瘤小 鼠 预后不 良，但其具体机制有待进一步研究 。应用Ｔ ／ 荷瘤兔 ，比较后者的肺结节数发现，接受异基因全 血的非荷 群来检测肝癌患者机体免疫功能国内外已进行了大量的研究 。 淋 瘤小 鼠 乍 荷瘤兔 的脾细胞所致的肺结节数 明显高于接受 同基 有 的学者提 出是否可将Ｔ 巴细胞 亚群 检测作为肝癌 术后随 Ａ 己用于头颈部肿瘤 、 胃癌 、 因全血及少白细胞异基 因血的非荷瘤小 鼠／ 非荷瘤兔 的脾 细胞 访指标 ，用于 监测肝癌复发 Ｉ Ｐ 肾癌、肺癌以及卵巢癌等的辅助诊 断、监测 肿瘤 的复发和预 再输注所致 的肺 转移结节数 。作者认为异基 因输血有促进肿
去白细胞悬浮红细胞的制备
去白细胞悬浮红细胞的制备1.引言1.1 概述概述部分的内容可以如下所述：悬浮在血液中的白细胞和红细胞在医学研究和临床应用中扮演着重要的角色。
然而，由于它们的不同特性和功能，分离和纯化这两类细胞成为了许多研究者和临床医生共同面临的挑战。
本文旨在探讨一种用于制备去白细胞悬浮红细胞的方法，以解决这一问题。
白细胞是免疫系统中的重要组成部分，其主要功能是抵御外来病原体和维持机体内环境的稳定。
然而，在某些疾病状态下，白细胞的数量和/或活性可能会过高，导致炎症反应或组织损伤。
因此，有时需要将白细胞与其他细胞类型分开，以便进一步研究或治疗。
与之相反，红细胞是负责氧气和二氧化碳的运输，以及维持机体血液酸碱平衡的关键细胞。
然而，在某些疾病情况下，如白血病或白细胞增多症，白细胞可能会大量存在于红细胞悬浮液中，影响血液功能和治疗效果。
因此，将红细胞从白细胞中分离出来具有重要的临床意义。
本文将重点介绍一种用于制备去白细胞悬浮红细胞的方法。
这种方法基于细胞的不同大小、形状和密度，利用离心、梯度离心和洗涤等步骤，来实现红细胞与白细胞的有效分离。
我们将详细描述每个步骤的操作方法和所需的实验条件。
最后，我们将通过实验结果和临床案例来评估该方法的可行性和应用前景。
我们希望这种方法能够为研究人员和临床医生提供一个可靠的工具，以便更好地理解和应对与白细胞和红细胞相关的疾病。
通过去除白细胞，我们可以更好地研究红细胞的功能和特性，为疾病的诊断和治疗提供新的思路和方法。
1.2 文章结构文章结构部分的内容可以按照以下方式编写：文章结构:本文主要分为引言、正文和结论三个部分。
1. 引言：在引言部分，我们将对制备去白细胞悬浮红细胞的重要性进行概述，并介绍本文的结构和目的。
2. 正文：正文部分将分为两个要点来详细介绍去白细胞悬浮红细胞的制备方法和技术。
2.1 第一个要点：在第一个要点中，我们将介绍传统的去白细胞悬浮红细胞的制备方法，包括离心法、沉降法等，并对其原理和步骤进行详细解释。
血液中白细胞分离 步骤
血液中白细胞分离步骤
白细胞分离是一种分离血液中白细胞的技术，其步骤如下：
1. 取血：先在病人的手臂上绑上绷带，用消毒棉球清洁静脉采血部位，然后采取一定量的血液。
2. 酸化：将采取的血液加入一种酸性溶液中，溶液中的酸性物质可以使白细胞脱离其他血液成分，以便进行进一步分离。
3. 离心：将混合后的血液在离心机中旋转几分钟，此时白细胞会被离心分离出来，并沉积在离心管的底部。
离心后，可以将上层液体倒掉。
4. 再次洗涤：将沉积在离心管底部的白细胞取出来，进行一次或多次的洗涤，以除去残留的细胞碎片和其他污染物。
5. 计数：最后，使用显微镜或自动计数器来计数分离出的白细胞数量。
以上就是白细胞分离的步骤。
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从全血中分离白细胞
操作过程：
1．用抗凝管收集全血，抗凝管需EDTA材质或者柠檬酸钠材质，不能用肝素钠材质。
2．全血白细胞分离：下列以3ml 抗凝血为例说明。
a．向一只15ml 离心管中加入3ml 抗凝血，而后加入9ml 红细胞裂解液。
盖紧管盖，温柔的颠倒混匀数下。
请不要剧烈振荡。
b．将离心管至于室温放置10 min（5-10 min，不要超过10 min）。
c．将离心管以2500 转离心5 min。
d．弃上清，尽可能将上清吸净，勿吸到管底白色班块细胞。
e．弃去上清后在管底出现可见的白色班块，此白色班块为富集的白细胞。
如果裂解不完全（白色班块里还有红色细胞），加入1ml PBS 缓冲液重悬，然后重复a－d
步骤。
f．充分裂解后，可用1ml PBS缓冲液清洗一次，2500 转离心5 min。
g．弃上清，可获得血液样品中全部白细胞的80％以上。
而后可加入适量Trizol （根据细胞数量而定5X106加1ml Trizol）后，用移液器充分吹打，混匀，直至出现清
亮不粘稠的液体，表示细胞充分裂解。
h．而后可以把以上的Trizol 试剂保存在生物冰中-70℃，最后用干冰运输寄于我们。