新型均相Fura-2 钙流检测实验(Molecular Devices)
均相合成多重选择性的新型两亲性C22高效液相色谱固定相
第42 卷第 12 期2023 年12 月Vol.42 No.121580~1587分析测试学报FENXI CESHI XUEBAO（Journal of Instrumental Analysis）均相合成多重选择性的新型两亲性C22高效液相色谱固定相范二乐1，蒋星宇1，张加栋1*，张明亮2，韩海峰1，2，张大兵1，2，陈义1，3（1．淮阴工学院矿盐资源深度利用技术国家地方联合工程研究中心，高端矿盐功能材料智能制备国际合作联合实验室，江苏淮安223003；2．江苏汉邦科技股份有限公司，江苏淮安223000；3．中国科学院化学研究所活体分析化学科学院重点实验室，北京100190）摘要：为解决高效液相色谱（HPLC）固定相非均相合成中产物多变和重现性差等问题，该文采用均相合成新方法，制备了既含有二十二碳烷基（C22）、又嵌入脲（U）和/或酰胺（A）强极性基团的两种新型两亲性色谱固定相C22-A和C22-A/U。
通过元素分析、核磁等手段，证实制备的两种新型固定相含有碳、氮元素，且碳氮元素比例符合理论值，表明酰胺和脲基极性基团成功键合到硅胶上。
通过对多种样品进行色谱分离分析，对两种新型固定相的载体残余硅羟基屏蔽作用、疏水选择性、形状选择性和亲水性等多种性质进行了考察，证实两种新型固定相不但具备作为反相液相色谱（RPLC）的性能，同时也具备亲水相互作用色谱（HILIC）的性能。
相较于C18固定相，C22-A和C22-A/U具有更好的形状选择性，双重嵌入的极性基团极大地降低了固定相硅羟基活性。
将C22-A和C22-A/U两种固定相应用于几种碱性化合物、雌醇（酮）类化合物的分离，C22固定相在一定程度上解决了传统C18固定相上碱性化合物分离拖尾严重或保留不足的问题，成功实现了对雌醇（酮）类化合物的分离。
关键词：色谱固定相；两亲性；均相合成；药物分析；液相色谱中图分类号：O657.7；R914.1文献标识码：A 文章编号：1004-4957（2023）12-1580-08 Homogeneous Synthesis of Novel Amphiphilic C22 StationaryPhases with Multiple SelectivityFAN Er-le1，JIANG Xing-yu1，ZHANG Jia-dong1*，ZHANG Ming-liang2，HAN Hai-feng1，2，ZHANG Da-bing1，2，CHEN Yi1，3（1．International Cooperation Joint Laboratory for Intelligent Preparation of High-end Functional Mineral SaltMaterials，National & Local Joint Engineering Research Center for Mineral Salt Deep Utilization，Huaiyin Instituteof Technology，Huai’an 223003，China；2．Jiangsu Hanbon Science & Technology Co.Ltd.，Huai’an 223000，China；3．CAS Key Laboratory of Analytical Chemistry for Living Biosystems，Instituteof Chemistry，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100190，China）Abstract：In order to solve the variable and irreproducible issues of heterogeneously synthesized chromatographic stationary phases，a new method of homogeneous synthesis was established and used to prepare two newly designed amphiphilic stationary phases，C22-A and C22-A/U，where C22 denotes a long docosyl terminal while U and A denote the strong polar insertions of urea and am⁃ide groups at the initial end，respectively. By the means of elemental analysis and nuclear magnetic spectrum，the two new stationary phases contain nitrogen elements，and the ratio of carbon and nitro⁃gen elements accords with the theoretical value，indicating that the amide and urea-based polar groups are successfully bonded to silica gel. Through the chromatographic separation and analysis of the standard sample and the real sample，the shielding effect on upported silicon hydroxyl，hydro⁃phobic selectivity，shape selectivity and hydrophilicity of the two new stationary phases were investi⁃gated.It is confirmed that the two new stationary phases have amphiphilic properties as reversed-phase liquid chromatography（RPLC）and hydrophilic interaction chromatography（HILIC）.Com⁃pared with C18 stationary phases，C22-A and C22-A/U own better shape selectivity，and the dou⁃doi：10.19969/j.fxcsxb.23072402收稿日期：2023－07－24；修回日期：2023－09－15基金项目：国家自然科学基金重点项目（22134007）∗通讯作者：张加栋，博士，副教授，研究方向：化学与生物传感、色谱分离分析等，E-mail：jiadongzhang@1581第 12 期范二乐等：均相合成多重选择性的新型两亲性C22高效液相色谱固定相ble embedded polar groups greatly reduce the silica hydroxyl activity of the stationary phase. C22-A and C22-A/U were used for the separation of several alkaline compounds and estrone（ketone） com⁃pounds. The C22 stationary phase solved the problem of serious tailing or insufficient retention of al⁃kaline compounds in the traditional C18 alkyl stationary phase，and successfully realized the separa⁃tion of estrone（ketone） compounds.Key words：chromatographic stationary phase；amphiphilicity；homogeneous synthesis；drug analysis；liquid chromatography色谱固定相的性质决定了保留机理、分离效率以及适合的分离对象［1-2］。
FLIPR 钙6 检测试剂盒(Molecular Devices)
优势：
图 1. 含或不含屏蔽成分的 FLIPR 钙 6 分析实验的灵活特性
Calcium 6
一步操作，显著降低背景荧光
Calcium 6-QF
不含有屏蔽组分，适用于对淬灭
剂敏感靶标或多通道应用试验
在FLIPR 或FlexStation®微孔读板机中使用钙离子敏感染料指示剂检测胞浆内 Ca2+浓度的增加
图4. 实验就绪的冻存细胞和FlexStation 3 系统
图5. 丙磺舒敏感实验
CHO M1 细胞需要添加阴离子再摄取抑制剂丙磺舒以确保 常用的钙离子指示染料，诸如Fluo-3和Fluo-4维持在细胞内。 FLIPR 钙 5 试剂盒染料在缺少丙磺舒时也会被排出细胞 并检测不到任何效应。FLIPR 钙 6 试剂盒染料荧光团的设 计更利于维持在细胞内部。图5展示了FLIPR钙6试剂在没有 丙磺舒的条件下记录到一个较小的信号，然而实验结果仍然 得到了超过2倍且EC80时Z因子值为0.86的信号窗口。
结果
通过检测来自ATCC的CHO M1WT3细胞表达的毒蕈碱受体 的激动效应观察FLIPR钙6试剂和其它钙指示剂的比较（图 2）。每种染料的最佳孵育时间按照各自的厂家指导说明进 行操作。 Fluo-4 wash (Fluo-4W) 染料由于其操作更为复杂以及细胞 外荧光背景导致得到的信号窗口最小。FLIPR钙6和钙6-QF 表现出更高的信号窗口，Δf/f分别是4和4.2。EC50值保存在 每个实验结果中且FLIPR钙6试剂在激动剂检测试验中得到 的Z@EC80值为0.88。
加载了FLIPR钙流检测染料或Fluo-4 Direct 染料的细胞板 中无需再用缓冲液冲洗。而加载了Fluo-4染料的细胞板需要 再用HBSS缓冲液冲洗三次。
用于均相FRET检测的纳米稀土荧光生物标记材料的研制项目通过评审
在 国家 ９ ３项 目、国家 自然科 学 ７ 基金委重大研究计划 、中科 院 “ 引进 海
外 杰 出 人 才 ” 百 人 计 划 等 项 目的 支 持
下， 由合肥物质科 学研 究院智能所刘 锦 淮研 究员和 黄行 九研究 员领 导的课 题
组 首 次 制 备 了 具 有 蛋 形 水 母 状 的
土 荧光生物 标记材 料 的制备 、表面修
饰 、 物 偶 联 、 谱 性 质 以及 生ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 应 用 生 光
将原本三 维 （ Ｄ）或二维 （Ｄ）无序 ３ ２ 的导 电聚合物 结构降 为一 维 （ Ｄ）有 １
检测等方面 的研究 ， 取得 了系列创新性
研究成果 ： （ ） 制 了一 类 新 颖 的稀 土 发 光 Ｉ研 纳米材料 ， 巧妙 地 将 时 间分 辨 技 术 和 荧
具 有 简 单 器 件 工 艺 的 高 性 能 双 侧 栅 晶
体 、 比优化聚合环境 ， 功实现 了吡 参 成 咯 单体在 含纳米 孔 的金 属有机 框架 中 的高度有序聚合 。 该 小组在世界上 率先使用含有 仅
ｌｍ 大 小 一 维 孔 道 的金 属 有 机 框 架 为 ｎ
用 水 中，只 要微量 浓度 即产生 毒性 效
读者 服 务 卡 编 号 ０ ２ １ ２ １ －
件、 纳米传感器 、分子机器 等器件 中获
得应用 。
读者服务卡编 号 ０３ ２ 口
ｙＡＩ Ｏ 勃姆石） ｉ ／ｅＯ４ － Ｏ Ｈ（ ＠ＳＯ２ ３ 空心 磁 Ｆ
性 微 球 ，能 够 高 效 地 去 除水 中 的 Ｐ ２、 ｂ＋
ｃｕ２ 、 Ｈｇ２ ＋ ＋
元研究员主持完成 。 审委 员会 一致认 评
为 ， 项 目研 究 处 于 国 际前 沿 领 域 ， 该 项
浙江理工大学生命科学院研究生有关钙流实验
浙江理工大学生命科学院研究生有关钙流实验“折腾了半年多的难题，就这么解决了!”张腾飞兴奋地对记者说。
张腾飞是浙江理工大学生命科学院的研究生，最近在做钙流实验。
“实验一直用酶标仪做，可效果不理想。
后来我在学校仪器设备共享平台上发现了‘激光共聚焦显微镜’，通过预约使用，顺利地完成了实验。
”张腾飞说的仪器共享平台，正是浙江理工大学推进大型仪器设备共享工作取得的成果之一。
近年来，浙江理工大学不断加大科研设备的资金投入，截至2014年12月，学校拥有教学科研仪器设备4.09万台，总价值5.49亿元，其中10万元以上的大型仪器设备有729台。
该校在深度调研的基础上，创新仪器设备管理体制，从“虚”“实”两个维度推进改革。
在“虚”的方面，学校构建了大型仪器共享平台，整合全校分析测试类大型仪器，实现分散设备的“虚拟”集中管理;在“实”的方面，学校成立校级测试中心，各学院成立科研中心或实验中心等专门机构，集中存放大型仪器设备。
“大型仪器设备共享平台不仅限于校内，对其他高校、科研院所、企业同样开放。
目前，共享平台实现了信息发布、计费制定、用前预约、安全准入、实时扣费、绩效统计等多元化、自动化的管理，建立了清晰的仪器设备共享管理体系。
”该校实验室与设备管理处处长张瑞林说，学生纳入教学计划内的实验一律免费，教学计划外的实验按收费标准的四分之一执行。
共享平台推出才几个月，就有2490多个校内用户和40多家校外用户使用。
“这项改革缩短了实验周期，提高了实验效率，节省了时间成本。
”生命科学院副院长孔祥东说，“2014年，学院全年立项科研项目58项;科研经费达到1124.65万元，创学院历史新高;发表论文105篇，其中SCI论文57篇……这些成绩的取得都有共享平台的功劳!”2014年12月8日，浙江理工大学又与杭州经济技术开发区签署合作协议，共建开发区大型仪器共享服务平台，首期向各企业推出开放使用的大型仪器设备清单共有287台，总价值2.8亿元，其中不少是昂贵先进的大型精密仪器。
大鼠心肌细胞内游离钙的Fura-2荧光测定(精)
大鼠心肌细胞内游离钙的Fura-2荧光测定[ 11-03-31 09:44:00 ] 作者：赵艳编辑：studa20【关键词】大鼠心肌细胞Fura-2的化学名为2-［6-双乙酸基-5-(2-双乙酸氨基)-5-甲苯氧乙氧基］-2-苯骈呋喃基-5-恶唑羧酸五钾盐。
属于第二代荧光指示剂，是测定细胞内游离钙的重要试剂［1］。
用Ca2+荧光指示剂Fura-2检测活细胞胞浆中［Ca2+］i是十几年来兴起的一门技术，已广泛应用于细胞生理、病理的研究，已有文献报道应用于测定细胞［2］、组织块［3］等内的游离钙。
应用本院的970CRT荧光分光光度计，根据本院的实验条件，本研究建立了用Fura-2双波长荧光法测定心肌细胞内游离钙的方法。
1 材料与方法1.1 仪器与试剂 970CRT荧光分光光度计（上海分析仪器总厂），IGO150型CO2培养箱（Thermo electron corporation），601超级恒温水浴孵箱（江苏省金坛市医疗仪器厂），TDZ5-WS小型离心机（北京光学仪器厂）。
Fura-2/AM、DMEM、1∶250胰蛋白酶购于SIGMA公司；TritonX-100、EDTA购于上海华美；小牛血清购于北京元亨圣马生物技术研究所；其它试剂均为国产分析纯。
1.2 实验方法1.2.1 实验原理 Fura-2具有较强的亲水性，不易透过细胞膜，但能与Ca2+特异性结合，在特定波长的紫外光激发下产生荧光，乙酰羧基甲基酯（Acetoxy-Methylester，AM）具有亲酯性，可透过细胞膜进入细胞。
细胞质中的酯酶可将Fura-2/AM水解为游离的Fura-2，Fura-2与细胞内游离的Ca2+结合形成Fura-2-Ca2+复合物，Fura-2及其与Ca2+结合的复合物其最大激发波长分别为380nm和340nm，其发射光的强度与Ca2+浓度呈比例，胞浆Ca2+浓度愈高，Fura-2与Ca2+形成的螯合物愈多，在340nm激发波长处产生的荧光（F340）愈强，而在380nm激发波长处产生的荧光（F380）愈弱，因此F340/F380可以反映胞浆Ca2+浓度。
细胞内游离钙浓度测定
细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)的测定按经典方法，以钙离子敏感的荧光探针Fura-2/AM或Fluo-3/AM来检测细胞内[Ca2+]i。
Fura-2的结构类似于四羧酸的Ca2+螯合剂EGTA，能以1：1的比例特异性地与Ca2+结合，与EGTA 不同的是Fura-2可发出荧光，并且结合Ca2+后荧光特性有改变，Fura-2及其与Ca2+结合后的复合物的最大激发波长分别为380 nm和340 nm，这种变化可指示Ca2+的存在及其浓度。
Fura-2为一极性很大的酸性化合物，不能进入细胞内，但在其负性基团部位结合上乙酰氧甲酯基后则成为Fura-2/AM。
后者脂溶性很强，又消除了负电荷，容易通过细胞膜，随后被细胞内的非特异性酯酶水解掉分子中的酯基后又变为Fura-2，与胞浆中的游离Ca2+结合后即可被特定波长的紫外光(340 nm)激发产生荧光。
并且，Fura-2与Ca2+解离容易，随着游离Ca2+的增加或减少，其荧光强度便随之变化。
因此，Fura-2的荧光强度与[Ca2+]i呈比例关系，据此可以测定[Ca2+]i及其变化(Malgaroli, A., et al., 1987)。
Fluo-3/AM是继Fura-2/AM等之后研制的新一代Ca2+ 荧光指示剂，与Fura-2/AM类似，Fluo-3/AM进入细胞后，酯基被水解掉，Fluo-3与细胞内游离Ca2+ 结合，因而其荧光强度可以反映细胞内游离Ca2+的浓度。
但优于Fura-2/AM的是，Fluo-3与Ca2+结合时的荧光强度较未结合Ca2+的游离形式高40 ~ 100倍，避免了自发荧光的干扰，因而直接在单波长激发光下检测其荧光强度即可反映[Ca2+]i的变化。
此外，Fluo-3与Ca2+亲和力低，易解离，适合测定细胞内Ca2+的快速、微量变化。
Fluo-3 在可见光光谱激发，激发波长为488 nm，可避免紫外光对细胞的损伤(Greimers, R., et al., 1996)。
骨骼肌中钙离子检测方法
骨骼肌中钙离子检测方法荧光钙指示剂荧光钙指示剂是一种广泛用于检测骨骼肌中钙离子浓度的技术。
这些指示剂与钙离子结合后会释放荧光，荧光强度与钙离子浓度成正比。
常用的荧光钙指示剂包括：Fluo-4：一种紫外激发的指示剂，具有快速的响应时间和高灵敏度。
Fura-2：一种双波长возбуждения指示剂，可以区分自由钙离子和结合钙离子。
Indo-1：一种紫外激发的指示剂，具有较长的波长发射，减少了自发荧光干扰。
电化学传感器电化学传感器可以检测钙离子的电位变化。
最常用的电化学传感器是钙离子选择性电极。
当电极浸入含有钙离子的溶液中时，电极表面会产生一个电位，该电位与钙离子浓度成对数关系。
显微镜成像技术显微镜成像技术可以提供骨骼肌中钙离子空间分布的信息。
常用的显微镜成像技术包括：共聚焦激光扫描显微镜 (CLSM)：使用聚焦激光束扫描样品，产生高分辨率的图像。
双光子显微镜：使用双光子激发，允许更深的组织穿透和减少光损伤。
荧光寿命成像显微镜 (FLIM)：测量荧光寿命，这可以提供钙离子浓度和环境信息。
光纤记录光纤记录技术使用光纤将荧光指示剂输送到骨骼肌中。
然后，使用光纤收集荧光信号，该信号与钙离子浓度成正比。
钙闪烁探针钙闪烁探针是由钙离子结合蛋白连接的化学发光基团组成。
当钙离子与蛋白结合时，化学发光基团会发出光，光强度与钙离子浓度成正比。
原子发射光谱法原子发射光谱法是一种分析技术，通过测量元素在激发后释放的光的波长和强度来确定元素的浓度。
对于钙离子检测，骨骼肌样本被激发，释放的钙离子光被检测和定量。
选择合适的方法选择合适的钙离子检测方法取决于具体的研究要求。
荧光钙指示剂最常用于测量骨骼肌中的钙离子，因为它们具有高灵敏度、快速响应时间和空间分辨率。
电化学传感器和显微镜成像技术也提供valuable information，特别是当需要空间信息或长时间记录时。
fura-2钙离子
fura-２是细胞内钙离子（Ca2+）的特异性荧光指示剂，由Grynkiewicz等于1985年合成．分子式见图！它能特异性地与Ca2+结合，结合比例为1：1同时Fura-2可发出荧光，结合Ca2+后的最大激发波长从结合前的380nm移向340nm，其发射荧光强度与结合Ca2+的浓度有定量关系。
由于Fura-2是极性大的酸性化合物，无法进入细胞内，为此在其负性基团上结合了乙酰氧甲酯，使其成为Fura-2/AM．既增加了酯溶性又消除了负电荷，使之容易进入细胞内，在细胞内，Fura-2/AM被酯酶水解成Fura-2后可与胞浆游离Ca2+可逆性结合．但Fura-2/AM在细胞外并不能与Ca2+结合，所以检测的340nm激发下的发射荧光强度可定量的确定[Ca2+]i及其动态变化。
Fura-2的特点a) 荧光强度大，敏感度高，且所用剂量小，对细胞内环境影响小；b) Fura-2与Ca结合后的激发光谱高峰有较大的漂移(从380nm移至340nm)，且Fura-2测定[Ca2+]i基本不受细胞密度及荧光剂浓度的影响，能校正胞浆的Ca2+浓度,易于识别与计算；c) 对钙，镁的选择性高；d) 自身荧光小；e) Fura-2与Ca结合的解离常数(Kd) 37℃为224,其标准曲线具有良好的线性，其对Ca2+的测定范围为10-5～10-82+mol.L-1，且能测定短暂而快速的Ca浓度的变化。
Fura-2的应用它主要应用于两个方面，一是将Fura-2直接注入单个细胞内，用荧光显微镜测定其Ca2+浓度，该方法准确可靠，还可观察到细胞内不同部位Ca2+浓度的变化，但需要昂贵的仪器设备；二是测定细胞悬液、组织块或贴壁细胞的细胞内Ca2+。
Fura 2对Quin 2的荧光特性做了改进。
1 μM Fura 2结合后的信号强度相当于30 μM 的Quin 2结合后的信号强度。
这样就保证在实验中可以使用比Quin 2的浓度低得多的Fura 2指示剂。
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FLIPR TETRA高通量实时荧光成像分析系统应用系列（3）
Fura-2QBT™钙流试剂盒: 新型均相Fura-2钙流检测实验
Fura-2染料一直以来被认为是在细胞成像、GPCR介导的细胞内钙流、以及离子通道激活等实验中检测钙动员的重要工具。
这种比值法检测染料通过计算结合和未结合两种状态之间的荧光强度比值，有助于纠正由于染料添加或细胞铺板造成的误差。
然而，传统的Fura-2染料必须要进行缓冲液清洗，从而对于每一个实验来说都提高孔间差异性并需要耗费更多时间且增加操作复杂性。
Molecular Devices®推出的Fura-2 QB T™钙流试剂盒是基于专利的信号湮灭技术，含有比值法检测的Fura-2钙离子指示剂，提供均相实验体系并减小细胞基础的差异性, 从而通过在检测前去除细胞清洗步骤间接增加通量。
另外, Fura-2 QB T™钙流试剂盒是在紫外光谱处激发，最大程度使得研究者可以减少488nm 激发的化合物荧光信号的干扰。
实验原理
Fura-2 AM是一种钙离子敏感染料，在340 nm和380 nm被激发，发射波长是510 nm。
染料结合了钙离子后其吸收波长从380nm转移到340nm。
图1显示了钙离子结合Fura-2后340/510nm发射的信号（绿）的增加，而380/510 nm发射的信号（橙）下降。
计算两种发射的信号比值（插图）来检测用于拟合量效曲线的最大值减去最小值后的信号效应。
Fura-2 QBT™钙流实验准备
本次实验中使用的是小规格的Fura-2 QB T™钙
流试剂盒（PN #R8197）。
染料重悬在含有20 mM
HEPES的Hank’s平衡盐溶液（HBSS）。
丙磺
舒（PBX）在需要时加入，用以抑制染料被转移
出细胞内。
贴别的CHO M1细胞或HeLa细胞实
验前过夜种在黑壁底透的384孔板中，在试验时
从培养箱中取出。
含有Fura-2 QBT染料或者其
它染料的25μL缓冲液加入到每个孔中，同时孔
中需含有25μL缓冲液或培养基。
加载了Fura-2
QB T™钙流试剂（PN #R8197）或BD比值法钙
流试剂（#644243）的细胞记录板在37°C、5%
CO2孵育一小时。
为便于对比，采用了传统的
Fura-2清洗方法。
特点
基于信号湮灭技
术，获得更大信号
窗口
免洗和比值法信号
检测使得实验差异
性降至最低
免洗步骤节省了时
间和实验成本
FURA-2 QBT钙流实验的比值法分析(图
1)
Conclusions 结论
相对于传统Fura-2实验，Fura-2 QB T™钙流试剂盒提供了均相的实验体系，通过使用Molecular Devices 公司基于信号湮灭的专利技术无需再对细胞进行冲洗。
因此将提高通量、减小细胞铺板或冲洗时细胞丢失等造成的实验差异性，并节省了实验成本（因为差异性而需要重复实验带来的缓冲液和耗材）。
相比于BD 比值法钙流试剂盒（#644243）传统的Fura-2细胞冲洗实验，Fura-2 QB T™钙流试剂盒可得到最大的信号窗口以及在EC 80或IC 80下最好的Z 值。
因为Fura-2燃料在紫外范围激发，从而避免了化合物488nm 激发的自发荧光的干扰。
Fura-2 QB T™钙流试剂盒在FLIPR Tetra 系统和FlexStation 3 微孔板检测平台上进行了充分的验证，提供了可重复、可量化操作的解决方案，适合于高通量的筛选工作。
按照此传统的Fura-2清洗方法，在加入50µL 的1X 染料缓冲液之前去除每个孔中的培养基，然后去其它试剂盒一样细胞记录版在同样的条件和时间下进行孵育。
在FlexStation®3微孔读板机或
FLIPR® Tetra 系统上开始记录前，所有记录板从
培养箱中取出并降温至室温10分钟。
采用了传统Fura-2清洗方法的记录板需要在开始记录前用HBSS 实验缓冲液清洗3次以去除多余的染料。
FlexStation 3 和FLIPR Tetra 系统上的比值法钙流检测实验
在384孔的聚丙烯化合物板中将5倍浓度的相应配体溶于含20mMHEPES 的HBSS 缓冲液中。
在FlexStation3（图2）或FLIPR Tetra 系统（图3）检测过程中加入激动剂，仪器参数进行了优化以适应于比值法检测实验。
染料的激发波长是340nm 和380nm 。
在510 nm 检测到发射信号，每个孔中两个激发波长下的相对荧光单位（RFU ）的记录持续大约90秒，包括加样前和加样后。
实验中每个采样时间点的计算后的输出结果是340nm 与380nm 波长信号的比值。
最大值减去最小值的计算来源自比值信号曲线。
量效曲线和EC 50/IC 50浓度统计计算所需的数据从ScreenWorks®或SoftMax ® Pro 软件中输出，然后用GraphPad Prism 进一步拟合和计算。
根据Zhang, et. al 发表的方法进行.Z 值的计算。
Results 结果。