cyFBPase基因过表达提高转基因烟草的抗旱性_郭利娜

蔗糖磷酸合成酶可缓解细胞质过度缺水的状况。 在马铃薯转基因试验中证实当植物受到干旱胁迫而 失水时，SPS 的活性迅速上升，迅速合成蔗糖，并 促进淀粉水解［3］。蔗糖合成酶是植物重要的糖代谢 酶，也是蔗糖进入各个代谢途径所必需的关键酶。 Jha 和 Dubey［4］指出蔗糖合成酶通过向处于逆境胁 迫的植株提供足够的“碳”源而弥补植物的能量消耗， 是植物的一种保护性反馈机制。胞质果糖 -1，6-二磷 酸酶（FBPase）（EC3.13.11），催化 1，6-二磷酸果糖 分解为 6-磷酸果糖和无机磷酸，是细胞质蔗糖合成 途径的限速酶，其活性对于蔗糖合成效率和调节有 机物质的运输和分配有重要意义［5］。
节物质，其水溶性强，既能调节渗透势，又不会进 入蛋白质水化膜内破坏蛋白质的高级结构，有助于 保护和稳定细胞蛋白质，防止酶变性失活，因而可 帮助植物有效抵抗逆境胁迫［1］。
蔗糖是植物细胞中含量最多的可溶性糖，参与
收稿日期 ：2013-07-01 基金项目 ：国家转基因生物新品种培育重大专项（2011ZX08009-003-003） 作者简介 ：郭利娜，硕士研究生，研究方向 ：植物基因工程 ；E-mail ：goodluckna55@ 通讯作者 ：郭三堆，研究员，博士生导师，研究方向 ：棉花基因工程 ；E-mail ：gsdui@
本研究利用 cyFBPase 在植物蔗糖合成中的重要 作用，将甘蓝型油菜的 cyFBPase 基因转入烟草，研 究过表达 cyFBPase 基因的烟草植株不同器官蔗糖含 量的变化，观察转基因植株对干旱的耐受性，旨在 为植物抗旱基因工程研究提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料 1.1.1 受体材料 烟草 NC89 种子由本实验室保藏。 1.1.2 基因、载体和菌株 甘蓝型油菜 cyFBPase 基 因、植物表达载体 pBI121、农杆菌感受态 LBA4404 均由本实验室保存。 1.1.3 仪器与试剂 荧光定量 PCR 仪（Bio-Rad 公 司 chromo4）；TOYOBO 公司反转录试剂盒 ；Promaga 公司 SYBR Green 荧光定量 PCR 试剂盒 ；各化学试 剂均购自 Sigma 公司。
表 1 PCR 所用引物序列
引物名称
序列（5'-3'）
作用
FBP-F ATGGATCACGAAGCAGATGC
PCR 鉴定引物
FBP-R CTATTCGTCCGCAGCATACAG
RT-F
GGAATCTTCTTGTACCCGGC
RT-PCR 引物
RT-R
GAACGCTCATGGATCTTCTC
Actin-F TCCATGCTCAATGGGATACT Actin-R TTCAACCCCTTGTCTGTGAT
Kan+500 mg/L Carb）中进行培养，光照周期为 16 h 光照 /8 h 黑暗，2-3 周后将抗性芽切下并转入生根 培养基（MS+100 mg/L Kan+500 mg/L Carb）中诱导 生根，最终获得转基因烟草［6］。PCR 鉴定转化苗， 所用鉴定引物为油菜 cyFBPase 基因全长特异引物， 鉴定引物序列，见表 1。采用 Thermo 植物组织直接 PCR 试剂盒（Phire Plant Direct PCR Kit）。PCR 体系 20 μL，2×Buffer 10 μL、引物 F/R 各 1 μL、Taq 酶 0.4 μL，ddH2O 7.6 μL，用取样器取微量植物组织。PCR 程序 ：98℃ 5 min ；98℃ 5 s，60℃ 5 s，72℃ 30 s， 35 个循环 ；72℃ 5 min。
关键词 ： cyFBPase 基因 蔗糖合成 耐旱性
Overexpression of cyFBPase Gene Can Enhance the Drought Tolerance of Transgenic Tobacco
பைடு நூலகம்Guo Lina Zhang Rui Sun Guoqing Meng Zhigang Zhou Tao Guo Sandui
（Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）
Abstract: Osmotic adjustment is mainly functioned under drought stress in plant. Sucrose as one kind of important soluble sugar in plant cells, is a primary osmotic regulator in plants, and its synthesis is limited by some key enzymes, such as cyFBPase. In this work, the Brassica napus cyFBPase gene was transformed into tobacco, and the gene expression level and enzyme activity were detected. The cyFBPase gene expression and enzyme activity were increased significantly in transgenic plants, with 1.88 times and 1.55 times of the wild type controls respectively, and at the same time, the sucrose content in transgenic plants leaves was also significantly increased to 1.59 times than that of the wild type. Under the condition of drought, the transgenic tobacco plants showed high drought resistance, and the sucrose content and the distribution of sucrose in root and leaf organs changed significantly. In transgenic plants, the sucrose content in the root and leaves increased by 2.49 times and 9.41 times of the plants which were treated one day, and increased by 1.78 times and 2.71 times of wild type controls under the same drought treatment. In conclusion, overexpression of cyFBPase gene can improve the ability of sucrose biosynthesis of plants, promote the sucrose transportation from leaves to roots under drought stress, and enhance the tolerance of transgenic plants to drought.
1.2 方法 1.2.1 烟草转化及分子检测 构建好的表达载体 pGBI-fbp 通 过 电 激 法 转 化 农 杆 菌 LBA4404 感 受 态 细 胞。 将 鉴 定 为 阳 性 的 农 杆 菌 侵 染 无 菌 的 烟 草 叶 片，浸染过的叶片置于培养基（MS+0.2 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA）上进行共培养，3 d 后将其转移到筛选 培 养 基（MS+0.2 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA+100 mg/L
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin
2013年第11期
调节植物的细胞代谢、信号转导、物质合成等生物 学过程，对植物的生长发育有较大的影响［2］。在植 物细胞中，蔗糖的合成主要在细胞质中，其合成效 率受到多个酶的调节控制，研究较多的有蔗糖磷酸 合成酶、蔗糖合成酶、果糖 -1，6-二磷酸酶等。
·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
2013年第11期
cyFBPase 基因过表达提高转基因烟草的抗旱性
郭利娜 张锐 孙国清 孟志刚 周焘 郭三堆
（中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081）
摘 要 ： 渗透调节是植物应答干旱胁迫的主要方式，蔗糖是植物细胞中重要的可溶性糖，是主要的细胞渗透调节物质。细 胞质果糖 -1，6-二磷酸酶（cyFBPase）是植物蔗糖合成途径的关键酶之一，其活性可直接影响细胞蔗糖浓度。将甘蓝型油菜的 cyFBPase 基因转入烟草，在转基阳性植株中 cyFBPase 基因的表达量和酶活性均大幅度提高，两个转基因株系的基因表达量和酶活 性分别为野生型对照的 3.76 倍、4.03 倍和 1.53 倍、1.58 倍，与之相对应，叶片蔗糖含量也显著增加，两株系叶片平均蔗糖含量达 到野生型对照的 1.59 倍。在干旱条件下，转基因烟草植株表现出较好的耐受性，其蔗糖含量以及蔗糖在根、叶器官中的分配发生 显著变化 ：处理 20 d 后的转基因植株叶、根中的蔗糖含量分别是处理 1 d 的植株的 2.49 倍和 9.41 倍，是对应条件下的野生型植株 的 1.78 倍和 2.71 倍。说明过表达 cyFBPase 基因提高了转基因植株的蔗糖合成能力，同时促进了蔗糖向根部运输，提高了转基因 植株对干旱的耐受性。
内参基因 RT-PCR 引物
1.2.2 基因表达和酶活性的测定 共获得两个 T0 代 转基因株系，两个转基因株系各随机选取 3 株植株 进行基因表达和酶活性检测，分别编号为 line1-1， line1-2，line1-3 和 line2-1，line2-2，line2-3。 1.2.2.1 转基因烟草的基因表达量检测 荧光定量 PCR 仪上进行实时荧光定量 RT-PCR（SYBR Green 法）检测基因的表达量，提取野生型烟草和转基因 烟草叶片总 RNA 反转录成 cDNA 作为模板（参考 TOYOBO 公司反转录试剂盒说明书），内参对照选择 烟草 actin 基因，目的基因引物（RT-F，RT-R）设 计在 cyFBPase 基因的保守区域内，可以同时扩增烟 草内源基因和转入的外源基因的 mRNA 序列，长度 约 150 bp，GC 含量约 60%。本试验所用引物，见表 1。反应体系 20 μL ：SYBR green Ⅰ（2×）10.0 μL、 cDNA 1.0 μL、 正 反 向 引 物（10 pmol/L） 各 0.4 μL、 ddH2O 8.2 μL，每次试验设定 3 次重复。反应程序为： 95℃ 1 min ；95℃ 15 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，40 个 循环。统计每个反应的荧光强度达到阈值时对应的 循环数（Ct）。目的基因相对于内参基因的相对表达 量用 2- △△ Ct 法计算。