酶测定、方法
生物化学检验中酶的测定综述
定时法
通常是酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、
蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内 底物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应 的平均速度。
定时法中酶促反应的过程
注意事项
用定时法测定酶活性浓度， 必须了解不同酶促反应速率和时间的关系， 应先做预试验找出酶促反应速率恒定的时期，
CK-MB
这些方法适用于临床自动化分析，具有测定时
间短（最快仅需7min）、灵敏性高（最低检测 限<µg/L）和准确性好的特点，明显优于其他 分析测定CK-MB的方法，1990年后逐渐被广泛 接受。 为使CK-MB质量分析标准化，AACC成立了专门 的标准化委员会，最近已研制成功采用重组基 因技术的CK-MB参考材料（Rck-2）。
由于同工酶（及其亚型同工型）一级结构的不
同，导致其在理化性质、催化性质、生物学等 方面有明显的性质差异，这些差异为同工酶的 分析和鉴定提供了理论基础。 临床同工酶的分析大致可分为两步，即首先精 确地分离出某酶的各同工酶组分，然后测定酶 的总活性和各同工酶组分的活性。
电泳法
在研究同工酶的所有方法中，电泳法的使用最
CK-MB
是诊断AMI、测定心肌梗塞面积的重要指标。 近年来，国外对AMI诊断效率评价时多采用测
定CK-MB质量，即测定CK-MB的酶蛋白质量浓度 （Mass）的方法。 CK-MB质量的测定通常是制备抗CK-M抗体和抗 CK-B抗体或采用CK-MB抗体，用CLIA、ELISA、 FEIA等方法测定。
同一种属中由不同基因或等位基因所编码的多
肽链单体、纯聚体或杂化体，具有相同的催化 作用，但其分子构成、空间构像、理化性质、 生物学性质以及器官分布或细胞内定位不同的 一组酶称为同工酶。 凡酶蛋白结构不同的同工酶称为原级同工酶， 而将经加工或修饰后的同工酶称为次级同工酶 或酶的多种形式。
各种酶活性测定方法
抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定过氧化氢酶（CAT）活性测定过氧化物酶（POD）测定方法超氧化物歧化酶（SOD）活性测定小组第一次讨论结果：一、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定1.原理APX 是植物体内重要的抗氧化酶, 主要功能是分解H2O2, 此过程通过抗坏血酸- 谷胱甘肽循环来完成。
此外, 它还直接参与抗坏血酸的氧化还原代谢, 而抗坏血酸能有效地清除多种活性氧自由基。
因此，APX被认为与果实的抗热性直接相关。
2.所用方法（1）采用碘液滴定法:称取新鲜材料1 g，剪碎置研钵中，加少量石英砂及pH值6.0 的磷酸盐缓冲液，迅速研磨成浆，20 ℃下浸提30 min，中间摇动数次，3000 r /min 离心后保留上清液即为酶液。
反应底物为抗坏血酸，加入酶液2 mL，20 ℃下反应10 min 后，立即加入偏磷酸1 mL，终止酶的活动，抗坏血酸被消耗的量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来进行测定，加淀粉溶液几滴作指示剂，以碘液滴定出现浅蓝色为止，记录滴定值，用底物被消耗的量来表示APX 的活性。
每个处理设3 个重复。
（2）紫外吸收法：称取1g芥蓝叶片组织，加入1.6 mL预冷的磷酸缓冲液（PBS-K）（pH 7.8）提取液（含1 mmol·L-1 AsA，3 mmol·L-1β-巯基乙醇，0.5 mmol·L-1PMSF，2% PVP，1 mM EDTA）。
用液氮研磨，提取液于4℃，12000×g离心20 min，上清液用于酶活性的测定。
取0.10 ml 酶液（可视情况调整），加入1.70 ml 含0.1 mM EDTA-Na的PBS（0.05 mol/L，pH7.0），再加入0.10 ml 5 mM的AsA，最后加入0.10 ml 220mM H2O2，立即在20℃下测定D290（紫外）值在一定时间内的变化，计算单位时间内AsA减少量，并求酶活性（室温下测定，缓冲液调零）。
酶样品测定方法
酶样品待测酶液制备方法磷酸缓冲液的制备中性蛋白酶（pH=7.5）准确称取磷酸氢二钠6.02g和磷酸二氢钠0.5g，加水定容至1000ml，配好后用pH计校正。
淀粉酶（pH=6）称取磷酸氢二钠45.23g，柠檬酸8.07g，用水溶解并定容于1000ml，配好后用pH计校正。
脂肪酶（pH=7.5）称取磷酸二氢钾1.96g，十二水磷酸氢二钠39.62g，用水溶解并定容于500ml，配好后用pH计校正。
酶液的制备称取样品1.000g至10ml试管中，加入磷酸缓冲液5ml，置于高速匀浆机捣碎，然后连残渣一起倒入100ml容量瓶中定容，室温静置1h，期间反复震荡3次，然后取4ml在16000r/min下离心5分钟，取上清液4℃保存待测。
酶活测定淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶采用建成生物工程研究所试剂盒测定，中性蛋白酶采用福林酚法测定。
淀粉酶原理：淀粉酶能水解淀粉生成葡萄糖、麦芽糖及糊精，在底物浓度已知并且过量的情况下，加入碘液与未水解的淀粉结合生成蓝色复合物，根据蓝色的深浅可推算出水解的淀粉量，从而计算出淀粉酶的活力。
单位定义：在37℃、pH6.0下，与底物作用30分钟，水解10mg淀粉定义为1个淀粉酶活力单位。
分析方法：计算：酶活力（U/g）= (空白管吸光度-测定管吸光度)/空白管吸光度×(0.4×0.5/10) ×(30分钟/7.5分钟) ÷（取样量×酶液浓度）脂肪酶原理：甘油三酯和水制成乳化液，因其胶束对入射光的吸收及散射而具有乳浊性状，胶束中的甘油三酯在脂肪酶的作用下发生水解，使胶束分裂，散射光或浊度因而降低，降低的速率与脂肪酶活力有关。
单位定义：在37℃条件下，在反应体系中与底物反应1分钟，每消耗lμmol 底物为1个脂肪酶活力单位。
分析方法：1、将分光光度计在420nm处以Tris缓冲液调零。
2、将底物缓冲液在37℃预温5分钟。
3、在试管中加入0.025ml待测样本，再加入试剂四0.025ml，然后加入4ml预温的底物缓冲液，盖住管口，颠倒混合5次，在420nm处比浊，读取吸光度值A1。
测量酶方法
氮蓝四唑（NBT）法测定超氧物歧化酶（SOD）活力一、原理超氧物歧化酶（superoxidedismutase , SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。
本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生02,可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。
而SOD可清除02，从而抑制了甲腙的形成。
于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低,反之酶活性愈高。
据此可以计算出酶活性大小。
二、材料、仪器设备及试剂（一）材料；水稻或小麦叶片（二）仪器设备： 1.高速台式离心机； 2.分光光度计； 3.微量进样器； 4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）； 5.试管或指形管数支。
（三）试剂:1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）；2. 130mmol/L 甲硫氨酸（Met ）溶液：称1.9399gMet 用磷酸缓冲液定容至100ml（现用现配）；3.750卩mol/L氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml,（避光保存）；4. 100卩mol/L EDTA- Na2溶液：称取0.03721gEDTA— Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml ；5. 20卩mol/L核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml（避光保存）。
三、实验步骤1. 酶液提取取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。
取1.5〜2ml于1000rpm下离心20min，上清液即为SOD粗提液。
2. 显色反应取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下列加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）0.05mol/L磷酸缓冲液 1.5130mmol/L Met溶液0.313mmol/L 750 卩mol/L NBT 溶液0.375 卩mol/L 100 卩mol/L EDTA—Na2 液0.310 卩mol/L 20 卩mol/L核黄素0.320卩mol/L酶液0.052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.0 混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000LX日光下反应20min （要求各管受光情况一致,温度高时间缩短,低时延长）。
几种酶的测定方法
各种酶的测定方法:土壤脲酶测定方法（靛酚比色法）根据脉酶水解时生成的氨与苯酚钠及次氯酸钠反应，形成兰色靛酚这一原理。
试剂配制：1.甲苯（分析纯）2.10%尿素：尿素（分析纯）10克溶于100毫升蒸馏水中。
（当天做当天配）3.柠檬酸盐缓冲液：368克柠檬酸（分析纯）溶于600毫升蒸馏水中；295克氢氧化钾溶于水；将二种溶液合并，调pH至6.7，并用水稀释至2升。
4.苯酚钠溶液：A.62.5克苯酚溶于少量95%乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升。
B.27克氢氧化钠溶于100毫升水中。
将二溶液保存在冰箱里。
使用前，将溶液A、B各吸取20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。
5.次氯酸钠溶液：用蒸馏水稀释试剂，至活性氯浓度为0.9%。
（次氯酸钠活性氯浓度为5.2%）。
标准溶液：称0.4717克硫酸铵（105 °C烘干）溶于水，稀释至1升（1毫升含100微克氮）即100ppm。
将100ppm的标准溶液稀释为10ppm。
分别吸取0、0.5ml、1.5ml、2.5ml、3.5ml、4.5ml、5.5ml、6.5ml、7.5ml于50毫升容量瓶或刻度试管中，加入试剂，最后定容至50 毫升使溶液浓度为：0、0.1ppm、0.3ppm、0.5ppm、0.7ppm、0.9ppm、1.1ppm、1.3ppm、1.5ppm。
分析步骤：称2~5克过20目风十土于50毫升磨口三角瓶中，加5~10滴甲苯，盖好，15分钟后加10毫升10%尿素和20毫升pH6.7柠檬酸盐缓冲液，摇匀后，在30C 恒温箱中培养24小时，过滤。
取滤液1~3毫升（视样品浓度定）于50毫升刻度试管中，加入4毫升苯酚钠溶液和3毫升次氯酸钠溶液，边加边摇匀。
20分钟后定容，在分光光度计波长578nm处比色（1cm比色杯）。
反应生成的靛酚兰能在60分钟以内稳定。
每一土样设置用水代替基质（即尿素）的对照，以除掉土壤中氨态氮引起的误差。
酶的测定方法
酶的测定方法
酶是一种生物大分子，能够催化生物化学反应。
酶的测定方法有多种，如下：
1. 活性测定法
酶的活性是指每单位时间内酶所催化的反应物的转化量。
通过活性测定法可以测定酶的活性，常用的方法包括比色法、荧光法、放射性测定法等。
2. 蛋白含量测定法
酶是一种蛋白质，因此可以通过测定酶的蛋白含量来间接测定酶的含量。
常用的蛋白含量测定方法包括比色法、光度法等。
3. SDS-PAGE电泳法
该方法利用SDS-PAGE电泳将酶分离出来，然后通过染色等方法测定酶的含量。
4. 免疫学方法
该方法利用酶的抗原性质，通过抗体结合酶来测定酶的含量或活性。
常用的方法包括ELISA等。
总之，不同的酶测定方法适用于不同的酶以及不同的实验目的，选择合适的方法可以提高实验的准确性和可靠性。
- 1 -。
酶活性的检测方法
DNS 还原糖 显色反应
比色法
蔗糖转化酶的活性检测： 光谱学检测
蛋白酶活性的检测：
BBA - Proteins and Proteomics, 1864 (1), 2016, 130-142
酶活性的检测方法
（二） HPLC检测法
植酸酶的活性检测方法： （植酸酶催化的脱磷酸反应的探针）
Soil Biology & Biochemistry 41 (2009) 192-200
酶活性的检测方法
酶活性的检测方法
（五） 耦合反应法（可耦合脱氢酶反应） 脱氢酶以NADH/NADPH为辅酶
NADH/NADPH的转换可耦 合340nm吸光度变化：
酶活性的检测方法
葡萄糖激酶的活性检测：
3.反应条件应有利于指定反应方向的进行，可以移除生成 物，或接上耦合反应。
二、酶活性的检测方法
直接测定生成物
耦合反应法 （可耦合脱氢酶反应）
光谱学检测法 HPLC检测法 化学测定法 电极检测法
酶活性检测的具体方法
（一） 光谱学检测法
• 生成物有特定的紫外或荧光吸收
木聚糖酶、纤维素酶活性检测：
木聚糖 羧甲基纤维素
主要内容
酶催化反应原理 酵素产品部分酶活性的检测
一、酶催化反应原理
把催化反应转化成可测量的模式
Juang RH (2005) EPA
测量酶催化活性应注意的事项
酶活性的检测通常是指催化活性的检测，建立活性检测步 骤时，应注意：
1.测定生成物的产生量比测定反应物的消失量），回 馈抑制酶反应。
酶活性的检测方法
（三） 化学测定法
• 如果生成物不具有光谱学特性，可以通过化学反应使之转化成 具有特定光谱吸收的物质，进而进行测定。
酶活测定方法
、酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。
在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。
通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。
色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。
该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。
粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。
木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。
基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。
这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。
免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。
用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。
在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。
蛋白酶活力测定法本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。
1 福林法1.1 试剂及溶液: 以下试剂都为分析纯1.1.1 福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。
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总蛋白酶活性测定用氨苯磺胺偶氮酪蛋白为底物测定。
偶氮酪蛋白以20 mg/L的浓度溶于0.15molL /NaCI溶液。
取该液0.3mL加人含中肠酶液的0.3mL PH7.2磷酸盐反应缓冲液中反应。
在30℃反应2h,加人0.6mL的2 0%(重量/体积)三氯乙酸终止反应。
反应混合物在11200 x g、4℃下离心15min后,取上清液,在366nm测光吸收值。
反应混合物1个吸收单位的变化定义为1个偶氮酪蛋白单位。
类胰蛋白酶活力测定采用两种专性底物:BAPN A和TAME。
BA PNA以2 0mgm /L溶于二甲基亚矾,取40ul 加入含中肠酶液的1.5mL PH7.2的磷酸盐L反应缓冲液中,反应20min后,加人0.5mL30%(体积/体积)乙酸终止反应,在405nm测光吸收值。
TAME以2mmol/L 溶于0.15mol/L NaCI溶液中。
反应缓冲液为pH 7.2的磷酸盐缓冲液，其余反应步骤同强碱性类胰蛋白酶活性测定，最后在248 nm测定吸光值.
淀粉酶活性的测定: 主要按照3，5- 二硝基水杨酸法(张桂芬等，2008)进行，具体的操作步骤为: 1) 标准曲线的制作: 配制浓度为1．0 mg/mL
的麦芽糖标准溶液10 mL，测定时分别稀释至0.2，0.4,0.5,0.6, 0.7，0.8 和1.0 mg/mL。
依次取上述溶液10 μL 分别移入0．2 mL PCR 管，每管加入10 μL 显色剂(3，5- 二硝基水杨酸试剂)，置沸水浴中煮沸5 min，冰浴冷却后加入蒸馏水80 μL。
以微量移液器取混合溶液90 μL 移入酶标板(美国Costor)，立即于490 nm 处读取OD 值，并确定OD值与麦芽糖含量之间的对应关系; 2) 样品酶液的测定: 取5 μL 浓度为1 % 的淀粉溶液移入0．2 mLPCR 管中，加入5 μL 待测样本酶液，混合均匀，于25℃温浴3 min 后加10 μL 显色剂(3，5- 二硝基水杨酸试剂)终止反应。
其他操作步骤及OD 值的测定方法同标
准曲线。
此时所测得的麦芽糖量为淀粉在淀粉酶的作用下所形成的麦芽糖。
淀粉酶活性以μg(麦芽糖) /mg pro·min 表示。
蛋白含量测定:参照Bradford(1976)考马斯亮蓝(G- 250)方法，采用3 mL 的反应体系。
对照缓冲液(pH 7.2)500 μL，考马斯亮蓝2．5 mL。
以牛血清白蛋白作标准曲线。
肪酶活性测定：依次加入p H 7.2 磷酸盐缓冲溶液 2.4 mL, 橄榄油1.0mL, 并于37水浴锅中磁力搅拌预热5 m in, 再加入中肠消化液0.16 mL, 磁力搅拌10min , 立即加入苯510 mL, 继续搅拌2 min ,终止反应,转移至离心管, 4 000 r min/L 离心10 m in ,取上层有机相4.0 mL于锥型瓶中, 加1.0 mL 显色剂( 5 % 醋酸铜溶液用吡啶调节至p H 6.1), 磁力搅拌3m in , 4000 r/m in- 1 离心10 m in , 取上层溶液于710 nm 处测定吸光度。
以pH 7.2磷酸缓冲溶液取代中肠消化液作为对照。
在上述实验条件下, 以每分钟水解橄榄油产生1 L/mol油酸所需的酶量定为1个酶活力单位。
每组设3个重复。