钙离子载体对牛精子体外受精及胚胎发育的影响
牛磺酸对生殖的影响
牛磺酸对生殖的影响作者：杨志勇杨建成胡建民来源：《消费导刊·理论版》2008年第10期作者简介：杨志勇（1980-），男，硕士在读，动物生理与生殖内分泌；胡建民（1959-），男，教授，博士生导师，通讯作者。
牛磺酸，是一种β含硫非蛋白氨基酸，因1827年首次从牛胆汁中分离出来而得名。
1850年，其化学结构得以确定。
1975年，Hayes等报道了幼猫采食牛磺酸含量不足的食物可导致视力功能下降，甚至失明，牛磺酸的营养作用引起了人们的极大关注。
近年来的研究表明，牛磺酸具有广泛的生物学作用，而牛磺酸与生殖也有密切的关系。
一、牛磺酸对雌性生殖的影响（一）牛磺酸对雌性生殖活动的影响Flint报道，在哺乳动物的组织中，蛋氨酸与半胱氨酸代谢的中间产物半胱亚磺酸经半胱亚磺酸脱羧酶脱羧成亚牛磺酸，亚牛磺酸再氧化成牛磺酸。
牛磺酸是母猫正常妊娠、分娩、仔猫成活和正常发育所必需的营养物质，缺乏则表现为繁殖能力低、流产、死亡等症状且活仔的生长速度显著降低、发育异常（Staurman et al.，1986）。
但由于猫体内半胱亚磺酸脱羧酶活性非常低，因此，其机体牛磺酸的合成量远远不能够满足生理需求，必须通过饲粮补充足够的牛磺酸（Dela Rosa et al.，1985）。
PavIova等研究表明，饲料中缺乏牛磺酸时，可导致某些雌性动物生殖机能紊乱，如发情异常、死胎、胎吸收、流产等症状；幼仔表现为先天缺陷率增高，初生重、断奶重及成活率下降，有时还出现精神异常症状。
从中我们可以看出，牛磺酸是雌性动物正常妊娠、分娩的重要营养物质，对保证某些雌性动物生殖机能正常具有重要作用。
Naismith（1987）研究发现，妊娠期和泌乳期母体牛磺酸代谢物减少，妊娠早期的母体即开始贮存牛磺酸满足胎儿的营养需要。
这表明，牛磺酸对胎儿发育有一定的影响。
而且，牛磺酸能够影响雌性生殖系统的发育。
肖世平等（1997）报道，饲料中添加适量牛磺酸(0.45%)能够促进母鸡卵巢组织形态的发育和雌激素分泌。
胚胎工程技术在动物育种中的应用
胚胎工程技术在动物育种中的应用彭露【摘要】随着社会不断进步,传统的动物育种手段已经不能完全满足人们对动物育种的需求,胚胎工程技术作为动物育种的新兴技术,已经在动物育种中得到广泛应用.文章简要介绍了胚胎工程技术中的体外受精技术、胚胎分割技术、胚胎移植技术和胚胎性别鉴定技术,以期为胚胎工程技术在动物育种中更好的应用提供理论依据.【期刊名称】《湖南畜牧兽医》【年(卷),期】2018(000)001【总页数】4页(P48-51)【关键词】胚胎工程;动物;育种;繁殖【作者】彭露【作者单位】湖南省永州市零陵区畜牧水产局,湖南永州425000【正文语种】中文【中图分类】S814.8随着人们对胚胎工程技术研究的不断深入，体外受精、胚胎移植、胚胎分割、胚胎性别鉴定等技术在商业化市场上已到了普遍的应用，其对生产效益的提升也受到了相关人员广泛的关注。
除了在生产上，胚胎工程技术对于提高动物的繁殖水平，缩短育种年限，保存优良遗传资源等方面的效果已日益凸显，因此胚胎工程技术也已成为了动物育种的主要技术手段。
1 体外受精体外受精技术是指在动物体外特定的环境中进行的精卵结合的受精过程。
目前为止，国内外对于动物体外受精技术的研究已经有一百余年的发展历史，最初的体外受精尝试是在1878年由美国的Scherk利用豚鼠和家兔进行的，此后，经过更多科学家对体外受精的研究与尝试，终由美国科学家Brackett通过体外受精技术，培育出了世界上第一头体外受精牛。
随后，更多的家禽动物也通过此方式相继繁殖成功，目前，体外受精技术已在世界范围进行了商业应用，并获得了巨大的经济回报。
在动物育种中的优势主要体现在如下三个方面：首先就是充分发挥优良母畜的繁殖潜力，以奶牛为例，一头奶牛的卵巢中大约含有几万个生殖细胞，但是受到生育过程的限制，一头奶牛一生中只能繁育出十几头奶牛后代，这对于优质奶牛来说，无疑是资源的浪费，通过体外受精技术，可以充分利用优良母畜的优良基因，充分发挥优良母畜的生殖潜力。
体外受精和早期胚胎培养学习目标简述哺乳动物体外受精
体外受精和早期胚胎培养学习目标：1、简述哺乳动物体外受精技术的主要操作步骤。
2、简述哺乳动物胚胎的早期培养方法。
3、认同体外受精在家畜快速繁殖中的重要意义。
学习重点1、体外受精在家畜快速繁殖中的重要意义。
2、哺乳动物体外受精技术的主要操作步骤。
学习难点1、卵母细胞的采集和培养。
2、精子的采集和获能。
巩固练习：1．中科院动物所和福州大熊猫研究中心合作，通过将大熊猫细胞核植入去核后的兔子卵细胞中，在世界上最早克隆出一大批大熊猫早期胚胎，表明我国大熊猫人工繁殖研究再次走在世界前列。
下列描述与克隆无关的是( )A.“复制”B.无性繁殖C.组织培养D.人类基因组计划2．超数排卵的做法正确的是( )A．口服促性腺激素 B．注射促性腺激素C．口服或注射促性腺激素 D．以上方法均不正确3．胚胎早期培养需要用液体培养基，此培养液的成分是( )A．水、无机盐、维生素、激素、有机盐、氨基酸、核苷酸、血清等B．蔗糖、水、无机盐、维生素、激素C．蔗糖、水、无机盐、氨基酸、核苷酸、血清D．水、无机盐、维生素、有机盐、淀粉等4．下列关于屠宰场和“胚胎工厂”合建的说法正确的是( )①可保证屠宰场的肉是鲜肉，防止实验过长，肉变质②有利于生产大量的胚胎和胚胎工程所需要的原材料③不够卫生，不能合建④从屠宰场废弃的卵巢中可直接获取卵细胞A．①②④ B．②④ C．①② D．③5．下列关于培育试管婴儿的叙述，不正确的是( )A．培育试管婴儿要进行体外受精过程 B．试管婴儿的发育场所主要在试管内C．试管婴儿的发育场所主要在母体内 D．试管婴儿具有双亲的遗传特性6．卵母细胞的采集之前，用_____________处理雌性个体，使其排出更多的卵子，然后，从输卵管中冲取卵子，又叫______。
收集精子的方法有______法、______法和______法等。
答案：促性腺激素冲卵假阴道手握电刺激7．在体外受精前，要对精子进行获能处理。
通常采用的方法有__________、___________两种，其中后者是将精子放在一定浓度的____________中，用化学药物诱导精子获能。
第2章 细胞工程 期末复习知识点总结【新教材】人教版高中生物选择性必修三
第2章细胞工程植物细胞工程1、植物细胞工程的理论基础（原理）：细胞的全能性，即，具有某种生命全部遗传信息的任何一个细胞，都具有发育成完整生物体的潜能。
这也是为什么植物的一瓣花瓣就可培育出完整的植株的原因。
理论上，生物的任何一个细胞都具有发育成完整植株的潜力。
但是，在生物的生长发育过程中，细胞并不会表现出全能性，而是分化成各种组织和器官。
这是因为，在特定的时间和空间条件下，细胞中的基因会有选择性地表达出各种蛋白质，从而构成生物体的不同组织和器官。
全能性表达的难易程度：受精卵＞生殖细胞＞干细胞＞体细胞；植物细胞＞动物细胞2、植物细胞工程的基本技术：植物组织培养技术3、植物组织培养技术（1）概念：植物组织培养就是在无菌和人工控制条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。
（2）过程：离体的植物器官、组织或细胞―――→愈伤组织―――→试管苗――→植物体（3）用途：微型繁殖、作物脱毒、制造人工种子、单倍体育种、细胞产物的工厂化生产。
A、植物繁殖的新途径：◆微型繁殖：可以高效快速地实现种苗的大量繁殖◆作物脱毒：采用茎尖组织培养来除去病毒（因为植物分生区附近的病毒极少或没有）◆人工种子：以植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽等为材料，经人工薄膜包装得到的种子。
优点：完全保持优良品种的遗传特性，不受季节的限制；方便储藏和运输B、作物新品种培育◆单倍体育种：●a过程：植株（AaBb）通过减数分裂得到花粉（AB、Ab、aB、ab四种类型）；对花粉进行花药离体培养（技术是植物组织培养）；得到单倍体植株；对其幼苗时期进行秋水仙素处理；得到了正常的纯合二倍体植株（AABB、AAbb、aaBB、aabb四种类型）。
●b优点：明显缩短育种年限◆突变体利用：在组织培养中会出现突变体，通过从有用的突变体中选育出新品种（如筛选抗病、抗盐、含高蛋白的突变体）◆细胞产物的生产：通过能够产生对人们有利的产物的细胞进行组织培养，从而让它们能够产生大量的细胞产物。
几种矿物质元素对奶牛繁殖力的影响
疾病 控 制 与诊 断 中心 ， 握 巴 音郭 楞蒙 Ａ治州 新
８ １０ ） ４ ００
繁殖 力直 接关 系到奶 牛生产 水 平的 高低 。奶 牛的繁殖 力受 遗传 、 营养 、 环境 和管理 等诸 多 因素
Ｎ Ｃ（０ １ 对 ６ ０ｋ Ｒ ２０ ） ５ ｇ体 重 的高产 奶 牛 （ 奶量 ４ 产 ０ ｋ ） 的推荐量 是 ｌ ． ｍ ／ ｇ日粮 干物质 。 ｇ铜 ５７ ｇ ｋ
子 宫炎 及 卵巢囊 肿升 高 ， 受胎 率低 ， 胎后 也不 能 受
正 常发 育 ， 易造成 流 产或死 胎 ， 活的犊 牛体 质 也 存 不健 康 。实 践证 明 ，冬春 季节 长期 缺乏 青绿 饲 料
时 ， 妊 娠后 期母 牛 和新生 犊 牛注射 亚 硒酸钠 ， 给 对
提 高母 牛 繁 殖 率和 犊 牛 成 活率 具 有 良好 的作 用 。
（０ １硒 的推 荐量 为 ０３ｍ ／ ｇ日粮 干物质 。 ２０ ） ． ｇｋ
５ 钴 对 奶 牛 繁 殖 力 的 影 响
钴 是形 成 Ｖ 结 构 的重 要 活 性组 成 部 分 ， 钴
在 动物 体 内能影 响红 细胞 的合 成 ， 并激 活部 分酶 ，
进 而影响相关 的繁殖 与生理 功 能。此外 ， 还 可以 钴
内 蒙 古 西 乌 珠 穆 沁 旗 草 原 是 闻 名 世 界 的 锡
林 郭 勒草 原 的 重要 组 成部 分 ， 目前 世 界上 温 带 是 草 原 中原 生 植被 保 存最 完 整 、草 地 类 型最 多 、 生
ห้องสมุดไป่ตู้
１ 西 乌 珠 穆 沁 旗 草 原 现 状
１１ 草 场 概 况 ．
场 、 山丘 陵干 草 原 草 场 、 状 高 平原 草 甸 草 场 、 低 波 山地 干 草 原 草 场 、 山 丘 陵 干 草 原 草 场 、 状 高 低 波 平 原 干 草 原 草 场 、 地 植 被 草 场 及 河 泛 地 、 盆 沙 湖 低 地 草甸 草 场 ， 中 以低 山 丘 陵 干草 原 草 场 和波 其
专题3 胚胎工程-2021年高考生物选修3知识点归纳(解析版)
专题 3 3 胚胎工程胚胎工程是指对动物_早期胚胎_或配子___所进行的多种显微操作和处理技术，如体外受精、胚胎移植、胚胎分割、胚胎干细胞培养等技术。
经过处理后获得的胚胎，还需移植到雌性动物体内生产后代，以满足人类的各种需求。
1890 年，英国剑桥大学的生物学家将纯种安哥拉兔的两个 4 细胞胚胎移入一只纯种比利时兔的输卵管内，成功地产下两只纯种安哥拉子兔。
这个实验首次证实_同种动物的胚胎在异体动物体内发育的可能性。
3.1 体内受精和早期胚胎发育精子的发生哺乳动物精子的发生是在睾丸内完成的。
雄性动物从_初情期__（相当于人的青春期）开始，直到生殖机能衰退，在睾丸的_曲细精管__内不断进行着生殖细胞的增殖，源源不断地产生精子。
各种家畜精子发生的过程大体可以分为三个阶段。
第一阶段，位于曲细精管管壁的精原细胞进行数次_有丝分裂__，产生大量的精原细胞，其中部分精原细胞经过染色体复制和其他物质的合成，进一步形成初级精母细胞。
第二阶段，初级精母细胞连续进行两次分裂（即减数分裂，包括 M Ⅰ和 MⅡ）；第一次分裂产生两个_初级精母细胞_，每个次级精母细胞再分裂一次产生两个含_单__倍染色体的_精子细胞______。
第三阶段，圆形的精子细胞经过变形，其中的细胞核变为_精子头的主要部分__，高尔基体发育为_头部顶体__，中心体演变为_精子的尾_，线粒体聚集在尾的基部形成_线粒体鞘___。
同时，细胞内的其他物质浓缩为球状，叫做原生质滴，随精子的成熟过程向后移动，直到最后脱落。
对于多数家畜来说，精子在睾丸内形成的时间为两个月左右。
卵子的发生卵子的发生是在雌性动物的卵巢内完成的。
动物的胚胎在_性别分化__以后，雌性胎儿卵巢内的卵原细胞，就通过_有丝分裂__的方式不断增加其数量，并进一步演变为初级卵母细胞，这时，它被_卵泡_____细胞包围，形成卵泡。
初级卵母细胞需经过减数分裂才能变为成熟的卵子。
减数第一次分裂是在雌性动物__排卵__完成的，其结果产生一个次级卵母细胞和第一极体，进入_输卵管__，准备与精子受精。
培养液中添加物对牛卵母细胞体外成熟、受精和胚胎早期发育的影响
Ｆ ｏ ｒ ｍａ ３ １ １型 。
１ ． ４ ． ２ 受精胚胎的早期发育 ：将体外受精胚胎分为三组 ， 以 基础培养液 Ｃ Ｒ ｌ ａ ａ液 ＋ １ Ｏ ％Ｆ Ｃ Ｓ为对 照组 ，以 Ｃ ＲＩ ａ ａ液
＋ １ ０ ％ Ｆ Ａ Ｆ — Ｂ Ｓ Ａ和 Ｃ Ｒ ｌ ａ ａ液 ＋ １ ０ ％Ｂ Ｓ Ａ ｆ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｖ 为 试 验
１ ． ２ 卵母 细胞获得 将收集卵巢置于 ２ ５～３ ５ ℃添 加 抗 菌 素 的 生 理 盐 水 中， 在３ ｈ内运 回实 验室 。将 手及 卵 巢 表 面 清洗 干 净 ， 用 注 射器 逐 一 吸取 卵 巢 表 面 ２～６ ａ ｒ ｍ 的 卵泡 ，放 入 含 ５ ％
组） ， 体外受精的对照组和试验组采用同样受精方法 ， 研究 添 加不 同激 素对卵母细胞 体外成熟 的影 响及对体外 受精后续
的影 响 。
啡因 、肝素 、 Ｆ Ａ Ｆ — Ｂ Ｓ Ａ和 Ｂ Ｓ Ａ ｆ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｖ 等从 Ｓ ｉ ｇ ｍａ 公 司购
进； Ｆ Ｓ Ｈ、 Ｐ ＭＳ Ｇ来 自宁波市激素有限公 司。实体显微镜 为美
Ｂ ｒ ａ ｃ ｋ ｅ Ｕ于 １ ９ ８ ２年 获得 世 界上 第一 头 试 管犊 牛 以来 ， Ｉ Ｖ Ｆ
１ ． ３ ． ３ 受精卵体外继续培养至囊胚期 （ Ｉ Ｖ Ｃ） 受精 ６ ｈ后的
卵子用含 １ ０ ％Ｆ Ｃ Ｓ 并 在培养箱 内平衡 ３ ０ ｍｉ ｎ的 Ｃ Ｒ ｌ ａ ａ培养 液洗涤 ３ 遍。 试验分三组 ， 相同条件为 ５ ％Ｃ ０ ， ３ ８ ． ５ ｑ Ｃ ， Ｃ Ｒｌ ａ ａ
2023年贵州省毕节市高考生物诊断试卷(二)+答案解析(附后)
2023年贵州省毕节市高考生物诊断试卷（二）1. 无机盐是生物体的组成成分，对维持生命活动有重要作用。
下列叙述错误的是（ ）A. 细胞中有以无机离子形式存在的钙B. 血液中Ca2+含量过高，人体易出现抽搐C. 适当补充维生素D可以促进肠道对钙的吸收D. 适当补充碘，可以预防缺碘引起的甲状腺功能减退症2. 经内质网加工的蛋白质进入高尔基体后，S酶会在其中的某些蛋白质上形成M6P标志。
具有该标志的蛋白质能被高尔基体膜上的M6P受体识别，经高尔基体膜包裹形成囊泡，在囊泡逐渐转化为溶酶体的过程中，带有M6P标志的蛋白质转化为溶酶体酶；不能发生此识别过程的蛋白质经囊泡运往细胞膜。
下列说法错误的是（ ）A. M6P标志的形成过程体现了S酶的专一性B. 附着在内质网上的核糖体参与溶酶体酶的合成C. S酶功能丧失的细胞中，衰老和损伤的细胞器会在细胞内积累D. M6P受体基因缺陷的细胞中，带有M6P标志的蛋白质会聚集在高尔基体内3. 植物细胞内10%～25%的葡萄糖经过一系列反应，产生NADPH、CO2和多种中间产物，该过程称为磷酸戊糖途径。
该途径的中间产物可进一步生成氨基酸和核苷酸等。
下列说法错误的是（ ）A. 正常生理条件下，利用14C标记的葡萄糖可追踪磷酸戊糖途径中各产物的生成B. 磷酸戊糖途径产生的NADPH与有氧呼吸产生的还原型辅酶不同C. 与有氧呼吸相比，葡萄糖经磷酸戊糖途径产生的能量少D. 受伤组织修复过程中所需要的原料可由该途径的中间产物转化生成4. 为了分析某21三体综合征患儿的病因，对该患儿及其父母的21号染色体上的A基因（A1～A4）进行PCR扩增，经凝胶电泳后，结果如图所示。
关于该患儿致病的原因叙述错误的是（ ）A. 考虑同源染色体互换，可能是卵原细胞减数第一次分裂21号染色体分离异常B. 考虑同源染色体互换，可能是卵原细胞减数第二次分裂21号染色体分离异常C. 不考虑同源染色体互换，可能是卵原细胞减数第一次分裂21号染色体分离异常D. 不考虑同源染色体互换，可能是卵原细胞减数第二次分裂21号染色体分离异常5. “低渗性脱水”是指水和钠同时缺失，但缺水少于缺钠，血浆中钠低于正常范围，细胞外液呈低渗状态，需采用含盐溶液或高渗盐水静脉滴注予以治疗。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
钙离子载体对牛精子体外受精及胚胎发育的影响彭礼繁１，罗光彬・，（１．沈阳农业大学动物胚胎工程实验室，辽宁沈阳李东全－，陈自洪ｚ，石德顺ｚ１１０１６ｌ；２．广西大学动物繁殖研究所，广西南宁５３０００５）摘要：在牛精子获能液中添加不同浓度的钙离子载体，应用体外培养技术对牛精子体外获能及早期胚胎发育作了研究。
通过对顶体反应、超激活、活率和早期胚胎发育率的观察，筛选出获能液中最适的钙离子载体浓度，作用时间及其有利于早期胚胎发育的最佳浓度。
结果表明：钙离子载体在诱导牛精子获能上存在一个浓度一时间阅值，其最佳浓度和时间组合是Ｏ．１ｕＭ处理２ｍｉｎ或者０．１５ｕＭ处理Ｏ。
５ｍｉｎ，此时的囊胚率最高；钙离子载体的添加不能诱导牛精子获能的发生．关键词：钙离子载体；牛；精子；体外受精；胚胎发育中图分类号：Ｓ８１４．４文献标识码：Ａ文章编号：１００５—８５６７（２００８）０４一００３５一０４目前，学术界对Ｃａｚ＋在精子获能中的作用存在争议。
有人认为获能过程中精子细胞内ｃａ２＋浓度不变，但多数学者认为精子细胞内的ｃａｚ‘嶂衣度增加。
Ｂａｌｄｉ等【－１证实人精子在获能前２ｈ，细胞内Ｃａ２＋浓度从７０ＩｌＭ增至２５０ｐＭ。
Ｃｒｏｓｓ认为Ｃａ２＋在精子获能中的作用是通过刺激腺苷酸环化酶（ＡＣ）的合成来增加环腺苷酸（ｃＡＭＰ）的合成幽，而ｗａｓｃｏ则认为Ｃａｚ＋能通过ｃＡ＾ＩＰ酶来降解ｃＡＭＰ合成［３］。
此外Ｂａｋｅｒ等认为细胞内Ｃａ２＋的增加会抑制细胞内ＡＴＰ的利用，从而妨碍ＰＴＰ团。
Ｃａｚ＋在精子获能中的分歧，原因可能在于对顶体反应中Ｃａ２＋作用的认识不同，以及研究Ｃａ２＋作用和相关事件的复杂性。
自从Ｙａｎａｇｉｍａｃｈｉ等发现Ｃａｚ＋对精子顶体反应起重要作用，同时证明ＩＡ（ＩｎｖｉｔｒｏＡｒｔｉｆｉｃｉｔｉｏｎ）能诱导精子获能促使顶体反应的发生后，Ｃａｚ＋载体在获能中的作用引起了关注网。
目前，Ｃａ斗载体在牛（Ｆｕｋｕｄａ等，１９９０；Ｊａｎｕｓｋａｕｓｋａｓ等，２０００）、羊（张嘉保等，１９９０）、猪（Ａｔｓｕｓｈｉ等，２００４）和水牛（Ａｂｄｕｌ等，２００５）的精子体外获能中，均获得成功。
但是由于钙离子载体．Ａ２３１８７作用剧烈，处理时间过长或浓度过高，会导致精子死亡。
目前，在牛精子获能中钙离子载体的添加量还不是很清楚，为此我们进行了钙离子载体对牛精子体外受精及其早期胚胎发育的影响试验，筛选出获能液中最适的钙离子载体浓度及其有利于牛早期胚胎发育的最佳浓度，从而为牛胚胎体外生产商品化奠定基础。
１材料与方法１．１材料１．１．１主要仪器荧光显微镜、生物显微镜附显收稿日期：２００８一０４—２４相系统、Ｃ０。
培养箱、倒置显微镜及显微操作系统等来自于沈阳农业大学动物胚胎工程实验室。
１．１．２主要试剂ＴＣＭ一１９９、Ｄ—ＰＢＳ、钙离子载体－Ａ２３１８７、Ｂ０（体外获能液）等均购于ｓｉｇｌｎａ公司。
１．１．３试验材料采集与保存牛卵巢采自沈阳市于洪区金氏牛羊屠宰场，在牛宰后３０ｍｉｎ内采集卵巢，保存在３５℃左右的装有灭菌生理盐水的保温瓶中，生理盐水中添加Ｏ．２ｍｇ／ｍＬ青霉素和０．２ｍｇ／ｍＬ链霉素，２ｈ内带回实验室。
牛冷冻精液购自辽宁省肉牛繁育中心，０．２５ＩｎＬ／管。
１．２方法１－２．１卵泡卵母细胞的采集和成熟培养按文献［１蛐３介绍的方法进行。
１．２．２成熟卵母细胞的体外受精（肝素受精法）成熟培养后，把卵母细胞先用洗涤液洗３次，再用处理好的精液洗涤１次，移入覆盖于石蜡油下的微滴中进行获能（受精）处理。
精液处理方法：细管冻精于３９℃温水中解冻后，检查其活率。
活率合格后，置于灭菌离心管中，加入精子洗涤液，混匀后ｌ５００ｒ／ｍ离心５ｍｉｎ，弃上清液（两次）。
然后加入获能（受精）液，再ｌ０００ｒ／ｍ离心ｌｍｉｎ，弃去沉淀。
最后再加入获能液，１５００ｒ／ｍ离心５ｍｉｎ，弃上清液，用获能液调整精子浓度到１×１０６个／ｍＬ。
１．２．３成熟卵母细胞的体外受精（钙离子载体受精法）细管冻精于３９℃温水解冻后，检查其活率，活率合格后，置于灭菌离心管中，加入精子洗涤液，混匀后１５００ｒ／ｍ离心５ｍｉｎ，弃去上清液（两次）。
最后再加入获能液，准确计时，计时结束后，马上加入等体积的钙离子载体阻断剂，并充分万方数据・３６－试验研究钙离子载体对牛精子体外受精及胚胎发育的影响一彭礼繁，等混合。
ｌ５００ｒ／ｍ离心５ｍｉｎ，弃去上清液，用１：１的获能液和钙离子载体阻断剂的混合液调整精子浓度至１×１０６个／ＩＩｌＬ。
１．２．４受精卵的体外培养［・州］卵母细胞与精子共培养１６～１８ｈ，完成获能（受精）后，受精卵在胚胎培养液中洗涤，吹打法除去附着在卵母细胞上的精子和颗粒细胞。
吹打完毕后移入培养液中，采用与颗粒细胞共培养的方法进行微滴培养（１０～１５个／滴）。
每４８ｈ采用半量法置换培养液，观察并记录胚胎发育情况。
１．２．５牛精子获能的判断标准及方法精子获能将发生一系列变化。
主要表现为代谢活动增强，出现头部侧向曲线运动加强，鞭打幅度加宽的超活化现象；另外，获能后的精子头部膨大，易发生顶体反应；项体反应成功的诱导被认为是获能完成的终点，即进行顶体反应的精子已经获能。
因为顶体反应比受精更接近获能过程，且顶体反应分析过程较简单，本试验采用该方法来判断精子是否获能。
１－２．６超激活率的观察精子获能后，在３７℃下，４００倍的相差显微镜下观察精子的运动形式。
精子呈现激烈曲线运动（鞭打样）的即为超激活精子。
１．２．７项体反应的观察精子获能后，１５００ｒ／ｍ离心５ｍｉｎ，弃去上清液，在沉淀中加入含有１５ｕｇ／ｍＬ溶血磷脂酰胆碱（Ｌｙｓｏ—ＰＣ）获能液。
孵育完成后，常规抹片，将风干后的抹片置于在３７℃水浴中预热的考马斯亮蓝染色液中浸染５～７ｍｉｎ，然后在ｌ０００倍显微镜下检查。
顶体区不着色或着色非常浅者为获能精子，顶体区呈蓝紫色者为非获能精子。
１．２．８活率的观察在４００倍生物显微镜下观察精子的运动形式，呈直线运动的则为活精子。
１－２．９胚胎发育的观察受精完成后，进行胚胎的早期培养，每４８ｈ半量更换培养液，同时在实体显微镜下观察胚胎发育情况，记录卵裂数、桑椹胚数和囊胚数。
１．３试验设计１．３．１钙离子载体浓度和作用时间对牛精子体外获能的影响该试验采用３×３二因子试验设计，浓度设０．０５ｕＭ、０．１ｕＭ和Ｏ．１５ｕＭ，牛精子体外获能处理时间设０．５ｍｉｎ、１ｍｉｎ和２ｍｉｎ，正常受精卵培养采用同一培养条件作对照组。
１．３．２钙离子载体诱导钙离子内流对牛精子获能的影响试验设三个处理，即Ａ：Ｏ．１ｕＭ钙离子载体＋２．２４ｆＩｌＭＣａＣｌ舢２Ｈ２０，Ｂ：０．１ｕＭ钙离子载体，ｃ：２．２４ｌｌｌＭＣａｃｌ。
．２Ｈ２０。
正常受精卵培养采用同一培养条件作对照组。
１．４统计分析本试验中的数据以平均数±标准误表示，用ＳＰＳＳｌｌ．０统计软件进行方差分析。
２结果与分析２．１钙离子载体浓度和作用时间对牛精子顶体反应、活率和超激活的影响从表１可以看出，钙离子载体浓度对精子顶体反应、活率和超激活均有极显著影响（Ｐ＜０．０１）。
浓度超过Ｏ．１ｕＭ的项体反应率显著高于Ｏ．０５ｐＭ时（Ｐ＜０．０１）；从活率方面来看，高浓度时活率显著下降，下降幅度与低浓度时相比，高达３０．５％；超激活率则是高浓度和低浓度时均较低，但０．１ｕＭ和０．１５ｌｌＭ之间差异不显著（Ｐ＞０．０５），二者与０．０５ｕＭ之间的差异极显著（Ｐ＜０．０１）。
从作用时间方面看，钙离子载体作用时间对顶体反应率的影响差异不显著（Ｐ＞０．０５），对活率的影响差异极显著（Ｐ＜Ｏ．０１），作用ｏ．５ｍｉｎ的活率显著高于作用２ｍｉｎ的活率（４２．２％ＶＳ３０．８９６），而与ｌｍｉｎ之间的差异不显著（Ｐ＜０．０５），ｌｍｉｎ与２ｍｉｎ之间的差异显著（Ｐ＜Ｏ．０５）；对超激活率的影响差异显著（Ｐ＜Ｏ．０５），超激活率以作用ｌｍｉｎ时为最高。
从整个实验来看时间与浓度互作对项体反应和活率的影响，差异不显著（Ｐ＞０．０５），而对超激活率的影响极显著（Ｐ＜０．０１）。
２．２钙离子载体浓度和作用时间对早期胚胎发育的影响由表２可见，钙离子载体作用时间对卵裂率和桑椹胚率有显著影响（Ｐ＜０．０１）。
随作用时间的延长，早期胚胎发育率先增后减，当作用时间超过ｌｍｉｎ，胚胎发育率开始下降；作用时间对囊胚发育率无显著影响（Ｐ＞Ｏ．０５）。
从浓度方面看，浓度对早期胚胎发育有极显著的影响（Ｐ＜Ｏ．０１）。
低浓度（Ｏ．０５“Ｍ）时无论作用时间长短，早期胚胎发育率均不高；高浓度（０．１５ｐＭ）时随作用时间延长，早期胚胎发育率显著下降。
在整个试验期间，时间和浓度互作对早期胚胎发育有极显著影响（Ｐ＜０．０１）。
２．３钙离子载体、钙离子对牛精子顶体反应、活率和超激活的影响由表３可以看出，顶体反应率和超激活率Ａ组均显著高于其它两组（Ｐ＜０．０１），其它两组间差异不显著（Ｐ＞０．０５）；而活率方面恰好相反，即Ａ组的活率显著低于其它两组（Ｐ＜０．０１），其它两组间差异不显著（Ｐ＞Ｏ．０５）。
２．４钙离子载体、钙离子对早期胚胎发育的影晌万方数据钙离子载体对牛精子体外受精及胚胎发育的影响一彭礼繁，等试验研究・３７・表１钙离子载体对牛精子顶体反应、活率和超激活的影响注：１．带有不同的小写字母表示差异显著（Ｐ＜ｏ．０５），带有不同的大写字母表示差异极显著（Ｐ＜ｏ．０１）。
下同。
表２钙离子载体对牛早期胚胎发育的影响由表４中可以看出，早期胚胎发育率，Ａ组显著高于其它两组（Ｐ＜０．０１）。
Ａ组的卵裂率和桑椹胚率是其它两组的５倍多，囊胚率则是其它两组的３倍左右，其它两组间差异不显著（Ｐ＞０．０５）。
裹３钙离子载体、钙离子对牛精子顶体反应、活率和超激活的影响表４钙离子载体、钙离子对早期胚胎发育的影响３讨论本试验结果表明，Ｂ．０．液中钙离子载体浓度、作用时间对精子获能和早期胚胎发育有显著影响。
当浓度为０．１ｕＭ，作用时间为ｌｍｉｎ和２ｍｉｎ时，顶体反应率、超激活率和早期胚胎发育率均较高，这与Ｆｕｋｕｄａ和Ｌａｎｄｉｍ的结果相一致［６］：但与Ｔａｔｅｎｏ等的结果差异较大啪。
Ｔａｔｅｎｏ等在制备牛精子染色体时，以ｎｌＢｗｗ培养基及１０ｕＭ的钙离子载体处理精子１０ｍｉｎ诱导获能，低浓度钙离子载体（低于４｜ｌＭ时）处理精子不能诱导精子获能。
浓度方面的这种巨大差别，可能与获能液中的其它活性添加物有关，例如，钙离子载体诱导精子获能与咖啡因有协同作用。
Ａｏｙａｇｉ等研究表明［５］：钙离子载体一Ａ２３１８７结合咖啡因对牛的精子进行获能处理，能迸一步提高受精分裂率和囊胚发育率；在钙离子载体诱导精子获能过程中，添加亚牛磺酸有助于牛精子获能。
具体原因还有待进一步研究。