紫锥菊及其复方制剂中菊苣酸的HPLC测定
紫锥菊中菊苣酸的萃取工艺研究
紫锥菊中菊苣酸的萃取工艺研究作者：高莹慧岳鑫滢周扬张瑶迟羽淳扬敏张天锡李峰来源：《云南中医中药杂志》2022年第02期摘要：目的提高乙酸乙酯對菊苣酸的萃取效率，优化一套经济高效适于工业放大生产的萃取工艺。
方法以菊苣酸的萃取率和纯度为评价指标，通过单因素实验考察药液浓度、药液pH值、萃取次数、萃取剂用量、萃取时间、萃取搅拌时间、萃取搅拌转速对萃取工艺的影响。
结果最佳萃取条件为药液菊苣酸浓度为15 mg·mL-1，药液pH=2，乙酸乙酯用量与药液体积分数比例为1∶1，萃取2次，每次萃取时间为40 min（搅拌15 min、静置25 min），搅拌转速为100 r·min-1。
在此条件下，菊苣酸纯度为41.4 %，纯度提高了13.0 %，萃取率为98.4 %。
结论该工艺稳定可靠，操作简便，适用于工业生产，可为紫锥菊中菊苣酸的工业萃取提供参考。
关键词：紫锥菊;菊苣酸;萃取率;纯度;单因素中图分类号：R284.2 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2022）02-0075-06紫锥菊（Echinacea pupurea（L.）Moench）为菊科紫锥菊属多年生草本植物[1]，主要含咖啡酸衍生物、多糖和糖蛋白及烷酰胺类化合物等[2]。
菊苣酸作为咖啡酸衍生物中重要的、具代表性的化合物[3-4]，广泛应用于药品、营养补充剂和保健食品。
本课题组前期研究发现紫锥菊提取物菊苣酸抗RSV疗效显著，在抗RSV新型候选药物的开发中具有广阔的前景。
为菊苣酸抗RSV制剂生产提供高纯度的原料来源，本实验以紫锥菊醇提物为原料，以菊苣酸的纯度及萃取率为指标，探究菊苣酸的乙酸乙酯萃取工艺，旨在优化出一套环保经济、简便高效适用于工业化的萃取工艺方案。
1 材料与仪器1.1 药材紫锥菊购自青州市康达中药材种植专业合作社（批号：20190630），经山东中医药大学药学院李峰教授鉴定为菊科植物紫锥菊属紫锥菊（Echinacea pupurea（L.）Moench）的干燥地上部分。
HPLC法测定菊花及其炮制品中主要成分的含量
HPLC法测定菊花及其炮制品中主要成分的含量付美霞;胡伶俐【摘要】目的:建立检测菊花及其炮制品种主要成分的方法,并对三批菊花及其炮制品中的主要成分绿原酸(C16H18O9)、木犀草苷(C21H20O11)、异绿原酸A(C25H24O12)进行含量测定.方法:色谱柱Agilent XBD C18(4.6 mm×250 mm,5.0 μm),流动相乙腈/0.1％磷酸,流速1.0 mL/min,柱温25℃,检测波长348 nm.结果:三种化合物的分离度较好,理论塔板数较高,绿原酸:A =8.278 71C +4.935 05,R=0.999 9(n =7),浓度范围为8.656～86.56 μg/mL;木犀草苷:A=15.866 45C-2.036 02,R=0.999 9(n=7),浓度范围为4.16～41.60 μg/mL;异绿原酸A:A=8.514 90C+1.2142 8,R=1.0(n=7),浓度范围为18.92～189.20 μg/mL,三种化合物的峰面积和浓度有良好的线性关系.结论:本方法能够准确快速地对菊花及其炮制中,主要成分进行定量分析,具有简便、稳定、准确等特点.【期刊名称】《中国野生植物资源》【年(卷),期】2015(034)001【总页数】4页(P26-29)【关键词】HPLC;菊花;绿原酸;木犀草苷;异绿原酸A【作者】付美霞;胡伶俐【作者单位】武汉市第五医院,湖北武汉430050;武汉市第五医院,湖北武汉430050【正文语种】中文【中图分类】R284.1菊花是我们生活中最常见药食两用的中药之一，来源于菊科植物菊(Chrysanthemum morifolium Ramat.)干燥的头状花序，具有散风清热、平肝明目、清热解毒，用于风热感冒，头痛眩晕，目赤肿痛，眼目昏花，疮痈等[1]。
绿原酸、异绿原酸A和木犀草苷是菊花中的主要化学成分。
绿原酸具有清除自由基、抗菌消炎、抗病毒、降糖、降血脂、保肝利胆等多种功效[2-4]；异绿原酸A与绿原酸的药理活性相似，具有抗菌、抗病毒清除自由基、兴奋中枢神经系统等多种生物活性作用[3-7]；木犀草苷具有清热解毒、抗炎、镇咳、祛痰等作用[8-10]。
紫锥菊及其复方制剂中菊苣酸的HPLC测定
HPLC测定紫锥菊提取物及其复方制剂中菊苣酸含量紫锥菊是平原印地安部落使用最广泛的药用植物，一般用于感冒，牙疼，毒蛇咬伤和其它外伤。
美国土著多年以来应用其作为增强免疫系统和清血的替代医药，特别是在季节变化和感冒咳嗽多发季节。
紫锥菊提取物更是连续数年被选入美国最畅销植物药行列。
紫锥菊及紫锥菊提取物复方制剂中菊苣酸分离、分析方法较少，常用梯度淋洗，但在分析时需要两种流动相系统，操作相对复杂。
本次实验，西安源森生物应用醋酸铵-甲醇流动相与C18反相柱，选择二极阵列管检测器，准确、快速地分析复方制剂中菊苣酸的含量：一、紫锥菊及其复方制剂中菊苣酸的HPLC测定实验（一）实验仪器和试剂Wat ers 2695分离单元；Wat ers996二极管阵列UV检测器；水为二次蒸馏水；紫锥菊提取物、菊苣酸复方制剂采自市场；菊苣酸对照品(自制)；所用试剂均为分析纯。
（二）样品处理取紫锥菊提取物1g→加20m L水→超声提取20 min→离心→弃去残渣→上清液多次加入氯仿提取色素→弃去氯仿层→水相用甲酸调至pH=3加入乙酸乙酯提取( 3×30m L ) →蒸干乙酸乙酯→残渣用50%甲醇-水定容至10m L→样液离心后过0. 45μm滤膜→即得。
（三）色谱条件:采用Xterra T M C18柱( 5μm , 150mm×3. 9m m) ；流动相: 400mmol / L醋酸铵-甲醇( 95∶5)；流速: 1 m L /mi n；紫外检测波长: 330 nm。
二、锥菊及其复方制剂中菊苣酸的HPLC测定实验方法与结果（一）检测波长的选择: 经PAD紫外检测器扫描，菊苣酸的最大吸收波长为330 nm，所以选择330nm作为菊苣酸的检测波长。
（二）提取溶剂的选择: 考察了不同溶剂对紫锥菊提取物中菊苣酸的提取率，结果见表1。
可见水提取最完全，可能因为紫锥菊提取物中菊苣酸大部分以盐的形式存在，所以极性最强的水提取率最高。
RP-HPLC测定紫锥菊提取物中2种咖啡酸衍生物的含量
RP-HPLC测定紫锥菊提取物中2种咖啡酸衍生物的含量徐度;唐宇伟;朱伟【期刊名称】《中成药》【年(卷),期】2006(028)010【摘要】目的:建立RP-HPLC测定紫锥菊提取物中2种咖啡酸衍生物含量的方法,同时测定5种样品.方法:采用RPHPLC同时测定紫锥菊提取物中2种主要咖啡酸衍生物:单咖啡酰酒石酸、菊苣酸的含量.色谱条件为Agilent ZORBAX StableBond C18柱(5 μm,4.6 mm×250 mm);流动相:A(乙腈)-B(0.1%磷酸溶液)梯度洗脱,流速:1.2 mL/min;检测波长:330 nm.结果:2种主要咖啡酸衍生物在色谱条件下有良好的分离度,浓度与峰面积之间线性关系良好,线性范围:单咖啡酰酒石酸在0.064～0.416 μg,菊苣酸0.1～0.7 μg.平均回收率:单咖啡酰酒石酸为99.37%,RSD为1.50%;菊苣酸为100.44%,RSD为1.71%.结论:方法简便、精确、专属性强,可作为提取物和研发新药的质量控制.【总页数】5页(P1493-1497)【作者】徐度;唐宇伟;朱伟【作者单位】上海市中药研究所,上海,200127;上海市中药研究所,上海,200127;上海市中药研究所,上海,200127【正文语种】中文【中图分类】R284.1【相关文献】1.反相高效液相色谱法测定紫锥菊中松果菊苷的含量 [J], 曹岚;刘桂琴;王勇;刘培;吕宪禹2.紫锥菊不定根悬浮共培养中咖啡酸衍生物积累研究 [J], 安冬;刘智强;黄韬;赵柏霞;田启云;吴春华3.RP-HPLC法测定紫锥玉屏风颗粒中菊苣酸含量的研究 [J], 孙伟;何冉娅;刘汉儒4.UPLC-PDA法测定紫锥菊提取物中菊苣酸的含量 [J], 魏秀丽; 孔梅; 徐恩民; 崔进; 张志民; 李有志5.HPLC-PDA测定紫锥菊商业提取物中有效成分的含量 [J], 毕小玲;蔡妙颜;王兆梅;邓韵;张干元因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
紫锥菊根中菊苣酸提取工艺及对氧化应激肠道细胞的保护作用研究
中国畜牧兽医 2022,49(7):2497-2505C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y &V e t e r i n a r y Me d i c i ne 紫锥菊根中菊苣酸提取工艺及对氧化应激肠道细胞的保护作用研究李一鹏,张 虎,任 娟,任 欣,刘聚祥,王庚南(河北农业大学动物医学院,保定071000)摘 要:ʌ目的ɔ优化紫锥菊根中菊苣酸提取工艺,并测定菊苣酸在肠道细胞中的抗氧化效果㊂ʌ方法ɔ试验选用有机溶剂乙醇作为紫锥菊根粉末(80目)提取溶剂,对提取溶剂浓度㊁提取温度㊁提取时间㊁提取次数以及原料与溶剂的比例等因素进行分析,得到每个因素下菊苣酸得率和该因素的对应曲线,再在单因素基础上,选择溶剂浓度(30%㊁40%㊁50%)㊁提取温度(60㊁70㊁80ħ)㊁提取时间(1㊁2㊁3h )和料液比(1ʒ12㊁1ʒ15㊁1ʒ18)4个因素3个水平设计正交试验㊂用不同浓度H 2O 2(100㊁200㊁400㊁600㊁800㊁1000μm o l /L )处理人结肠腺癌细胞(C a c o -2)与猪小肠上皮细胞(I P E C -J 2)建立氧化应激模型㊂分别使用不同浓度菊苣酸(0㊁100㊁200㊁400㊁600㊁800㊁1000μm o l /L )处理氧化应激前后的细胞24h ,应用M T T 法,分别测定菊苣酸对两种肠道细胞氧化应激的保护和缓解效果㊂ʌ结果ɔ菊苣酸最佳提取条件为:50%浓度的乙醇在70ħ下采用1ʒ18的料液比,超声辅助提取2h ,得率为1.89m g /g ㊂细胞抗氧化试验结果显示,菊苣酸对C a c o -2和I P E C -J 2两种肠道细胞氧化应激均具有保护和缓解效果,对C a c o -2细胞的保护作用和缓解作用的半数抑制浓度(I C 50)值分别为172.6和207.5μm o l /L ,对I P E C -J 2细胞的保护作用和缓解作用的I C 50值分别为133.1和196.5μm o l /L ㊂ʌ结论ɔ试验得到了紫锥菊根粉中菊苣酸的最佳提取方案,为工业化高效提取菊苣酸提供了参考;同时菊苣酸对氧化应激的肠道细胞具有很好的保护作用,经计算其保护作用的I C 50值较缓解效果更小,进一步证明了菊苣酸具有成为肠道抗氧化剂的潜力㊂关键词:紫锥菊;菊苣酸;提取;肠道细胞;抗氧化作用中图分类号:S 859.7文献标识码:AD o i :10.16431/j.c n k i .1671-7236.2022.07.007 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2022-02-07基金项目:国家自然科学基金项目(32002343);河北省教育厅在读研究生创新能力培养资助项目(C X Z Z B S 2021038)联系方式:李一鹏,E -m a i l :1072599721@q q .c o m ㊂通信作者王庚南,E -m a i l :y i yu o n e @s i n a .c o m S t u d y o n t h eE x t r a c t i o nP r o c e s s o fC h i c o r i cA c i d f r o m E c h i n a c e a R o o t a n d I t s P r o t e c t i v eE f f e c t s o nO x i d a t i v e S t r e s sD a m a ge d I n t e s t i n a l C e l l s L IY i p e n g ,Z H A N G H u ,R E NJ u a n ,R E N X i n ,L I UJ u x i a n g ,WA N G G e n gn a n (C o l l e g e o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e ,H e b e i A g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,B a o d i n g 071000,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b j e c t i v e ɔT h e e x t r a c t i o n p r o c e s s o f c i c h o r i c a c i d f r o m E c h i n a c e a r o o tw a s o pt i m i z e d ,a n d t h ea n t i o x i d a n te f f e c to fc i c h o r i ca c i di ni n t e s t i n a lc e l l s w a sd e t e r m i n e d .ʌM e t h o d ɔI nt h e e x p e r i m e n t ,t h ee c o n o m i c a lo r ga n i cs o l v e n te t h a n o l w a ss e l e c t e da st h ee x t r a c t i o ns o l v e n to f E c h i n a c e a r o o t p o w d e r (80m e s h ),a n ds e v e r a l f a c t o r s s u c ha se x t r a c t i o ns o l v e n t c o n c e n t r a t i o n ,e x t r a c t i o n t e m pe r a t u r e ,e x t r a c t i o n t i m e ,e x t r a c t i o n t i m e s ,a n d t h e r a t i o of r a w m a t e r i a l s t o s o l v e n t w e r e s e t f o r a n a l y s i s ,a n d t h e r e s u l t s o f e a c h f a c t o rw e r e o b t a i n e d .T h e c o r r e s p o n d i ng c u r v e o f a c i d y i e l d a n d thi s f a c t o r ,a n dt h e no nt h eb a s i so f s i n gl e f a c t o r ,s e l e c t s o l v e n t c o n c e n t r a t i o n (30%,40%,50%),e x t r a c t i o n t e m p e r a t u r e (60,70,80ħ),e x t r a c t i o nt i m e (1,2,3h ),s o l i d -l i qu i dr a t i o (1ʒ12,1ʒ15,1ʒ18),f o u r f a c t o r sa n dt h r e e l e v e l so fo r t h o g o n a l e x p e r i m e n t sw e r ed e s i gn e d .W i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so f H 2O 2(100,200,400,600,800,1000μm o l /L )t ot r e a th u m a n c o l o na d e n o c a r c i n o m a c e l l s (C a c o -2)a n d p o r c i n e s m a l l i n t e s t i n a l e pi t h e l i a l c e l l s (I P E C -J 2).T h e中国畜牧兽医49卷c e l l s b e f o r e a n d a f t e ro x i d a t i v es t r e s sw e r e t r e a t e dw i t hc h i c o r y a c i d(0,100,200,400,600,800, 1000μm o l/L)f o r24hr e s p e c t i v e l y.T h e p r o t e c t i v ea n da l l e v i a t i n g e f f e c t so fc h i c o r y a c i do n o x i d a t i v e s t r e s s o f t w o i n t e s t i n a l c e l l sw e r em e a s u r e db y MT T m e t h o d.ʌR e s u l tɔT h e r e s u l t so f e x t r a c t i o n p r o c e s s s h o w e d t h e o p t i m a l e x t r a c t i o n c o n d i t i o n s o f c h i c o r i c a c i dw e r e50%e t h a n o l a t 70ħw i t ha s o l i d-l i q u i d r a t i oo f1ʒ18,u l t r a s o n i c-a s s i s t e d e x t r a c t i o n f o r2h.F i n a l l y,t h e y i e l do f t h i s p r o c e s sw a s1.89m g/g.T h er e s u l t so f c e l l u l a ra n t i o x i d a n t a s s a y s h o w e dt h a t c h i c o r i ca c i d h a d p r e v e n t i v e a n da l l e v i a t i n g e f f e c t so nb o t hC a c o-2a n dI P E C-J2c e l l l i n e sw h i c hd a m a g e db y o x i d a t i v es t r e s s.T h e I C50v a l u e s o fi t s p r o t e c t i v e a n d a l l e v i a t i n g e f f e c t s w e r e172.6a n d 207.5μm o l/Lf o rC a c o-2,133.1a n d196.5μm o l/Lf o r I P E C-J2,r e s p e c t i v e l y.ʌC o n c l u s i o nɔT h e b e s t e x t r a c t i o n p r o c e s s o f c h i c o r i c a c i d f r o m E c h i n a c e a r o o t p o w d e rw a s o b t a i n e d,w h i c h p r o v i d e d ar e f e r e n c ef o ri n d u s t r i a la n d e f f i c i e n te x t r a c t i o n o fc h i c o r i c a c i d,a n d t h e c e l la n t i o x i d a n t e x p e r i m e n t s h o w e d t h e i n t e s t i n a l a n t i o x i d a n t a b i l i t y o f c h i c o r i ca c i d.T h ec a l c u l a t e dI C50v a l u eo f i t s p r o t e c t i v ee f f e c tw a ss m a l l e rt h a nt h a to f t h e m i t i g a t i o ne f f e c t.I tw a sf u r t h e r p r o v e dt h a t c h i c o r i c a c i dh a d t h e p o t e n t i a l a s a f u t u r e i n t e s t i n a l a n t i o x i d a n t d r u g.K e y w o r d s:E c h i n a c e a;c h i c o r i c a c i d;e x t r a c t i o n;i n t e s t i n a l c e l l s;a n t i o x i d a n t e f f e c t目前,中药免疫增强剂成为畜牧养殖业研究热点,其不但能够提高机体的免疫水平,还能够避免长期使用化学药物对动物机体产生的毒副作用以及药物残留等问题[1]㊂菊苣酸是一种可以从紫锥菊㊁菊苣等菊科植物中广泛提取出来的咖啡酸衍生物,又名二咖啡酰酒石酸㊂研究显示,菊苣酸作为一种中药提取物具有抗炎㊁抗肿瘤㊁抗氧化㊁提高机体免疫力等药理功效[2]㊂紫锥菊的地上部分及根中均含菊苣酸[3],而根中菊苣酸含量最高㊂伏健[4]曾用乙醇回流法对紫锥菊头状花序进行提取试验,优化提取工艺得到了菊苣酸含量为0.45%㊂孟创鸽[5]用超声波提取法提取了紫锥菊茎部的菊苣酸,菊苣酸得率为1.51m g/g㊂也有学者利用加热回流[6]及超声波协同方法[7]对紫锥菊根部进行了研究,但提取率相对较低㊂用更安全的提取溶剂更简便的提取方法,更能迎合工业化生产的需求,所以本研究以紫锥菊根为原料,乙醇为溶剂,超声提取为手段,优化菊苣酸的提取工艺㊂氧化应激是指动物机体在代谢过程中产生大量的氧化自由基和活性氧,可能会造成机体抗氧化系统的失衡,造成一定程度的氧化损伤㊂在动物的集约化养殖过程中,氧化应激的危害已经十分明显,如心脏病㊁乳房炎㊁肾病㊁消化道炎症等疾病都可能通过氧化应激导致,很大程度上影响了畜牧养殖业的发展[8]㊂而造成动物氧化应激的原因多种多样,如环境因素㊁自身状态的改变㊁外源致病菌或病毒等[9]㊂在蛋鸡的养殖中,氧化应激会对蛋鸡产蛋后期繁殖性能造成影响[10],T a r i n[11]首次提出蛋鸡卵巢老化是由于胞内活性氧的积聚和与衰老相关的细胞损伤造成的;仔猪的氧化应激会造成采食量和平均日增重的下降[12];更有研究显示,母牛在高产期由于体内大量的代谢活动,造成活性氧的聚积,从而产生氧化应激,对奶牛的产奶量和乳制品的质量有一定影响[13]㊂故抗氧化剂的研究和发展对畜牧养殖业的发展以及对提高畜牧养殖产品的质量有着重大意义㊂研究表明,菊苣酸可以通过降低细胞内活性氧和脂质过氧化物丙二醛的积累㊁清除自由基㊁抑制氧化低密度脂蛋白等方式,发挥抗氧化损伤的药理作用[14]㊂L i u等[15]通过体外抗氧化试验证明菊苣酸清除D P P H㊃㊁㊃O H和A B T S㊃+自由基的能力很强,高于咖啡酸和酒石酸的抗氧化能力㊂常小文[16]以人肝癌细胞(H e p G2)细胞为研究对象,证明了菊苣酸体内甲基化代谢产物对该细胞氧化应激损伤有较强的抗氧化活性,且菊苣酸甲基化的程度越高,其抗氧化活性就越强㊂口服是最常用且是适应性最佳的给药方式,但目前菊苣酸对肠道细胞的抗氧化应激损伤作用鲜有报道㊂本研究针对人结肠腺癌细胞(C a c o-2)及猪小肠上皮细胞(I P E C-J2)两种肠道细胞,构建氧化应激模型,进一步证明菊苣酸在肠道细胞中的抗氧化作用㊂1材料与方法1.1材料1.1.1 细胞和主要试剂人结肠腺癌细胞(C a c o-2细胞)购自协和细胞库;猪小肠上皮细胞(I P E C-J2细胞)购自北纳生物科技有限公司㊂紫锥菊根粉末(80目)由上海源叶生物科技有限公司提供;菊苣酸标准品由中国食品药品检定研究院提供;无水乙醇由天津北辰方正试剂厂生产;乙腈(色谱89427期李一鹏等:紫锥菊根中菊苣酸提取工艺及对氧化应激肠道细胞的保护作用研究级)和甲醇(色谱级)均购自德国默克股份两合公司;D ME M高糖培养基和H B S S溶液均购自北京索莱宝科技有限公司㊂1.1.2主要仪器液相色谱仪(H P L C1525)产自W a t e r s公司;K Q-500D E型数控超声波清洗仪产自昆山市超声仪器有限公司;离心机产自上海安亭科学仪器厂;细胞培养箱购自赛默飞世尔科技有限公司;酶标仪购自伯乐公司㊂1.2方法1.2.1 色谱条件二元溶剂泵(W a t e r s1525),自动进样器(W a t e r s2487),二极管阵列检测器(P D A,W a t e r s2998),W a t e r s S u n f i r e反相C18色谱柱(250m mˑ4.6m m,5μm),流动相为0.1%磷酸水溶液(A)和乙腈(B),等度洗脱流动相比例AʒB 为7ʒ3,流速1m L/m i n,柱温35ħ,检测波长327n m,进样量20μL㊂1.2.2溶液的配制及标准曲线的制作标准品溶液:精密称量1.0m g菊苣酸标准品溶于流动相中,配制成1m g/m L,再稀释成500㊁200㊁100㊁50㊁20μg/m L 浓度的标准品溶液,按照1.2.1项下色谱条件进行检测,记录峰面积,以菊苣酸浓度(μg/m L)为横坐标,以峰面积为纵坐标,绘制标准曲线㊂1.2.3检测限及定量限配制一系列浓度的标准溶液进行色谱检测,当信号和噪音的比值(S/N)为3时即为方法的检测限,当S/N=10,且将此时的浓度带入标准曲线中,实测浓度和规定浓度偏差在ʃ20%以内时,所得浓度即为定量限㊂1.2.4超声辅助提取单因素试验称取10.0g 紫锥菊根粉末,放入250m L圆底烧瓶中,以不同浓度(30%㊁40%㊁50%㊁60%㊁70%㊁80%)的乙醇作为提取剂,按照不同料液比(1ʒ12㊁1ʒ15㊁1ʒ18㊁1ʒ21)进行混匀后,在不同温度(40㊁50㊁60㊁70㊁80ħ)下进行最大功率的超声提取(1㊁2㊁3次),提取不同时间(1㊁2㊁3h),进行单因素试验,每个因素所得提取液进行冷冻干燥,称重,取一定量样品溶解进行高效液相色谱(H P L C)检测,每个因素进行3次平行试验计算菊苣酸得率㊂1.2.5超声辅助提取正交试验选取各个单因素最优条件以及最优条件相邻的两个条件,进行正交试验设计,采用L9(34)正交试验设计表,设置时间㊁温度㊁料液比和乙醇浓度为影响因素,选取能够提取出最高含量菊苣酸的提取工艺,各项参数如表1所示,进行3次平行试验㊂表1因素水平表T a b l e1F a c t o r l e v e l t a b l e水平L e v e l s时间T i m e/h温度T e m p e r a t u r e/ħ料液比F e e d l i q u i dr a t i o乙醇浓度E t h a n o lc o n c e n t r a t i o n/% 11601ʒ1230 22701ʒ1540 33801ʒ1850 1.2.6菊苣酸细胞毒性试验取对数生长期的细胞,以5ˑ104/孔接种到96孔板中,在细胞培养箱中培养24h,将每孔中的培养基取出弃去,用P B S 溶液冲洗3次,分别加入不同浓度的菊苣酸(100㊁200㊁400㊁600㊁1000μm o l/L),在细胞培养箱孵育24h后,每孔中加入20μL的M T T溶液,孵育4h后弃去培养基,每孔中加入100μL D M S O,避光震荡10m i n,用酶标仪测定570n m波长下各孔的吸光度值(D570n m)㊂并计算细胞存活率:细胞存活率(%)= (试验组D570n m/对照组D570n m)ˑ100%㊂1.2.7细胞氧化应激损伤模型的构建将细胞接种到96孔板中,以H2O2为造模剂,加入不同浓度的H2O2(100㊁200㊁400㊁600㊁800㊁1000μm o l/L),培养4h,用MT T法检测各个孔的吸光度并计算各个浓度下细胞的存活率㊂当细胞存活率处在50%~70%[17]时,即构建氧化应激模型成功㊂1.2.8菊苣酸对细胞氧化损伤保护效果试验将细胞接种到96孔板中,加入不同浓度菊苣酸(100㊁200㊁400㊁600㊁800㊁1000μm o l/L),以抗坏血酸(200μm o l/L)为阳性对照,以等体积H B S S溶液为阴性对照,孵育24h后除对照组外,其余组分别加入一定量的H2O2溶液(浓度通过1.2.7的结果确定),孵育4h后用MT T法检测各个孔的吸光度并计算细胞存活率㊂以细胞存活率为纵坐标㊁药物浓度的对数值为横坐标,用G r a p h P a dP r i s m6.0软件对数据进行拟合,求得半数抑制浓度(I C50)㊂1.2.9菊苣酸对氧化损伤应激细胞的缓解效果试验在构建的氧化损伤细胞中加入不同浓度的菊苣酸(浓度同1.2.8),以抗坏血酸(200μm o l/L)为阳性对照,以等体积H B S S溶液为阴性对照,孵育24h后,用MT T法检测各个孔的吸光度(D570n m)并计算细胞存活率㊂2结果2.1标准曲线的建立根据H P L C的结果建立标准品的线性回归方9942中国畜牧兽医49卷程为:Y=105.4X-47225,R2>0.999㊂2.2检测限和最低定量限以信噪比(S/N)=3为检测限,S/N=10为定量限,经测定检测限为50n g/m L,最低定量限为100n g/m L㊂2.3超声辅助提取菊苣酸单因素试验2.3.1提取时间对菊苣酸得率的影响取紫锥菊根粉末按照1ʒ18料液比加入80%浓度乙醇,在60ħ下分别超声1㊁2㊁3h,经H P L C检测后结果见图1A㊂由图1A可知超声2h之内菊苣酸得率随时间延长而逐渐增高,但在2h之后,菊苣酸得率无明显变化,提取时间选用2h为佳㊂2.3.2乙醇浓度对菊苣酸得率的影响取紫锥菊根粉末按照1ʒ18料液比加入30%㊁40%㊁50%㊁60%㊁70%㊁80%的乙醇,在60ħ下超声2h,经H P L C检测所得结果见图1B㊂由图1B可知,当乙醇浓度的小于40%时,随着浓度的升高菊苣酸得率增大,到40%达到最大,但是继续增大乙醇浓度其得率呈现逐渐减少的趋势,因此选用40%浓度的乙醇溶液为正交试验的中间浓度㊂2.3.3温度对菊苣酸得率的影响取紫锥菊根粉末按照1ʒ18料液比加入80%浓度乙醇,分别在50㊁60㊁70㊁80ħ下超声2h,经H P L C检测所得结果见图1C㊂由图1C可知,在60ħ以下,随着温度的升高,菊苣酸得率逐渐升高,而60ħ之后菊苣酸得率随温度的升高而呈现降低的趋势,因此在60ħ左右对紫锥菊根粉末提取能够得到较多的菊苣酸㊂2.3.4料液比对菊苣酸得率的影响取紫锥菊根粉末按照1ʒ12㊁1ʒ15㊁1ʒ18㊁1ʒ21料液比加入80%浓度乙醇,在60ħ下超声2h,经H P L C检测所得结果见图1D㊂由图1D可知,在15倍体积提取溶剂之前随着料液比的增加提取率有所提高,但继续增大溶剂量,菊苣酸的提取率逐渐变小,故选用料液比为1ʒ15为宜㊂2.3.5提取次数对菊苣酸得率的影响取紫锥菊根粉末按照1ʒ18的料液比在60ħ下进行超声辅助提取2h,取样后进行抽滤,将残渣收集再按照1ʒ18的料液比进行提取,总共提取3次,测得结果如图1E㊂由图1E可知,提取1次时紫锥菊根粉末中菊苣酸绝大部分被提出,只是剩余一小部分残存,出于经济㊁时间方面考虑,提取次数为1次㊂图1超声辅助提取菊苣酸单因素试验结果F i g.1T h e s i n g l e-f a c t o r e x p e r i m e n t a l r e s u l t s o f u l t r a s o n i c-a s s i s t e d e x t r a c t i o no f c h i c o r i c a c i d 00527期李一鹏等:紫锥菊根中菊苣酸提取工艺及对氧化应激肠道细胞的保护作用研究2.4超声辅助提取菊苣酸正交试验由表2可知,在所选择的4个因素中温度对菊苣酸提取率影响最大,溶剂浓度次之,料液比和时间对得率影响相对较小,主次顺序为:温度>溶剂浓度>料液比=时间,选择最优水平温度为70ħ,料液比为1ʒ18,超声时间为2h,溶剂浓度选择50%,按照最优组合,即50%乙醇浓度按照1ʒ18的料液比,在70ħ下超声2h提取,菊苣酸提取得率为1.89m g/g㊂表2正交试验结果T a b l e2O r t h o g o n a l t e s t r e s u l t s项目I t e m s温度T e m p e r a t u r e/ħ料液比F e e d l i q u i d r a t i o时间T i m e/h乙醇浓度E t h a n o l c o n c e n t r a t i o n/%菊苣酸得率C i c h o r i c a c i d y i e l d/(m g/g)1601ʒ121301.57 2601ʒ182501.77 3601ʒ153401.71 4701ʒ151501.84 5701ʒ122401.85 6701ʒ183301.81 7801ʒ181401.84 8801ʒ152301.79 9801ʒ123501.84 K15.045.255.255.17K25.505.355.415.39K35.475.415.355.45K11.681.751.751.72K21.831.781.801.80K31.821.801.781.82R0.150.050.050.092.5菊苣酸的细胞毒性试验用不同浓度的菊苣酸孵育细胞24h后,细胞存活率如图2所示,菊苣酸浓度在100~1000μm o l/L 的范围下,C a c o-2和I P E C-J2细胞的存活率均在90%以上,故菊苣酸在100~1000μm o l/L的浓度范围内对C a c o-2和I P E C-J2细胞均没有毒性㊂图2不同浓度的菊苣酸处理24h对细胞存活率的影响F i g.2E f f e c t o f d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f c h i c o r i c a c i d t r e a t m e n t f o r24ho n c e l l v i a b i l i t y1052中 国 畜 牧 兽 医49卷2.6 细胞氧化损伤应激模型建立最佳浓度由图3可知,当H 2O 2浓度为200μm o l /L 时,C a c o -2细胞存活率为62.43%,处在50%~70%之间,可以作为C a c o -2细胞氧化损伤应激模型建立的最优浓度㊂当H 2O 2浓度为400μm o l /L 时,I P E C -J 2细胞存活率为62.06%,处在50%~70%之间,可以作为I P E C -J 2细胞氧化损伤应激模型建立的最优浓度㊂图3 不同浓度H 2O 2处理4h 对细胞存活率的影响F i g .3 E f f e c t s o f d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o fH 2O 2t r e a t m e n t f o r 4ho n c e l l v i a b i l i t y2.7 菊苣酸对细胞氧化损伤的保护效果如图4所示,在用不同浓度菊苣酸处理细胞后,再用H 2O 2诱导细胞的氧化损伤,当菊苣酸浓度为800μm o l /L 时,C a c o -2细胞存活率最高,为74%,与阳性对照组相当;当菊苣酸浓度为100μm o l /L 时,C a c o -2细胞存活率为54.5%,与阴性对照组相当;经过计算,C a c o -2细胞的I C 50值为172.6μm o l /L ㊂当菊苣酸浓度为600μm o l /L 时,I P E C -J 2细胞的存活率最高,为67.53%;当菊苣酸浓度为100μm o l /L 时,I P E C -J 2细胞的存活率为51.8%,与阴性对照组相当㊂经过计算,I P E C -J 2细胞的I C 50值为133.1μm o l /L ㊂2.8 菊苣酸对细胞氧化损伤的缓解效果由图5可知,当菊苣酸浓度为400μm o l /L 时,C a c o -2细胞的存活率最高,为70.2%;当菊苣酸浓度为100μm o l /L 时,C a c o -2细胞的存活率最低,为52.8%㊂经过计算,其I C 50值为207.5μm o l /L ㊂图4 不同浓度的菊苣酸对细胞氧化损伤的保护效果F i g .4 P r o t e c t i v e e f f e c t o f d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f c h i c o r i c a c i do n c e l l u l a r o x i d a t i v e d a m a ge 20527期李一鹏等:紫锥菊根中菊苣酸提取工艺及对氧化应激肠道细胞的保护作用研究图5 不同浓度的菊苣酸对细胞氧化损伤的缓解效果F i g .5 R e l i e f e f f e c t o f d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f c h i c o r i c a c i do n c e l l u l a r o x i d a t i v e d a m a ge 当菊苣酸浓度为100μm o l /L 时,I P E C -J 2细胞的存活率最高,为75.92%;当菊苣酸浓度为1000μm o l /L时,I P E C -J 2细胞的存活率为57.33%,与阴性对照组相当㊂经过计算,I P E C -J 2细胞的I C 50值为196.5μm o l /L ㊂3 讨 论菊苣酸的获取途径包括用化学方法合成[18]以及从植物体内提取纯化㊂但由于用化学合成法容易产生较多的副产物,造成一定程度的环境污染,且长期服用容易产生耐药性或造成肝肾损伤㊂所以天然植物中的菊苣酸提取工艺的优化是重中之重㊂在有关菊苣酸提取的相关文献中,多以紫锥菊全草或是地上部分为原料,而在相关研究中菊苣酸在紫锥菊的花和根中含量丰富,分别为1.2%~3.1%和0.6%~2.1%[19],且根部含量最高,所以本研究选用紫锥菊根粉作为原材料㊂而较短的提取时间,较少的提取次数,简单的提取方法,安全的提取溶剂更能适应工业化生产,对比相关文献的回流提取[20]及超声辅助提取法[5],本提取工艺更加便捷,省时,且得率较高㊂对于氧化应激损伤细胞模型的建立,应激源的选择多种多样,前人通过很多试验证明了很多应激源均可以成功构建氧化应激细胞模型㊂除H 2O 2[21]㊁M P P +[22]㊁6-O H D A [23]等化学类应激源外,还包括一些物理类应激源与生物类应激源[24]㊂本试验选用H 2O 2为应激源进行细胞氧化损伤应激模型的建立,其优点在于H 2O 2性质稳定,易于获得㊁成本较低且效果明显㊂此外在建立细胞氧化损伤应激模型的过程中发现,I P E C -J 2与C a c o -2细胞所需的H 2O 2溶液的浓度并不一致,说明不同的细胞系对H 2O 2溶液的氧化应激效果有所差异㊂天然酚酸及多糖类药物均有良好的抗氧化效果,而菊苣酸是从紫锥菊等菊科植物中提取出来的天然酚酸类化合物㊂在本研究中菊苣酸作用于两种肠道细胞的氧化应激保护和缓解作用的I C 50值在133.1~207.5μm o l /L 之间,均远小于文献中用D P P H 法测定的茶多酚的抗氧化I C 50值(0.143m g /m L ),与三七多糖的抗氧化I C 50值(0.055m g /m L )相接近[25],同时在选定浓度下最强的抗氧化效果与所选定的阳性药物抗坏血酸相当,且保护效果的I C 50值小于缓解效果的I C 50值,显示菊苣酸在这两种肠道细胞中具有很好的氧化损伤保护和缓解效果,且对氧化损伤的保护效果明显优于其缓解效果,在一定程度上证明了菊苣酸具有成为肠道细胞的天然抗氧剂的潜力㊂4 结 论本研究设计了4个因素3个水平正交试验,对提取方案进行优化,最终得到了菊苣酸提取率最高的优化方案为:50%乙醇浓度按照1ʒ18的料液比,在70ħ下超声2h 提取,最终菊苣酸提取得率为1.89m g /g㊂并发现菊苣酸对C a c o -2和I P E C -J 2两种肠道细胞均有很强的保护和缓解氧化损伤的效果,其保护作用的I C 50值分别为172.6和133.1μm o l /L ,缓解作用的I C 50值分别为207.5和196.5μm o l /L ㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] 韩若婵,闫永平.菊苣酸在养鸡生产中的应用与发展3052中国畜牧兽医49卷方向[J].北方牧业,2016,15:27.HA N R C,Y A N Y P.A p p l i c a t i o na n dd e v e l o p m e n td i re c t i o no fc h i c o r y a c i di n c h i c k e n p r o d u c t i o n[J].N o r t h e r n A n i m a l H u s b a n d r y,2016,15:27.(i nC h i n e s e)[2]王玉真,高爽,李凌军,等.菊苣酸生物活性及其药理作用研究进展[J].中国新药杂志,2020,29(15):1729-1733.WA N G YZ,G A OS,L ILJ,e t a l.R e s e a r c ha d v a n c e so nb i o a c t i v i t y a n d p h a r m a c o l o g i c a l e f f e c t so f c h i c o r i ca c i d[J].C h i n a J o u r n a l o f N e w D r u g s,2020,29(15):1729-1733.(i nC h i n e s e)[3]王彦彦,孙玉滨,王怀生,等.H P L C法测定紫锥菊不同药用部位中菊苣酸的含量[J].人参研究,2016,28(2):23-25.WA N G Y Y,S U N Y B,WA N G H S,e t a l.D e t e r m i n a t i o n o f c h i c o r i c a c i d f r o md i f f e r e n tm e d i c i n a lp a r to f E.p u r p u r e a M o e n c hb y H P L C[J].G i n s e n gR e s e a r c h,2016,28(2):23-25.(i nC h i n e s e) [4]伏健.紫锥菊提取工艺优化及对小鼠免疫调节的研究[D].长沙:湖南农业大学,2016.F UJ.S t u d i e so ne x t r a c t i o n p r o c e s so p t i m i z a t i o na n di m m u n o r e g u l a t i o no n m i c ei n E c h i n a c e a p u r p u r e a[D].C h a n g s h a:H u n a n A g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y,2016.(i nC h i n e s e)[5]孟创鸽.菊苣中菊苣酸的提取纯化及生理活性的研究[D].杨凌:西北农林科技大学,2016.M E N G C G.S t u d y o n e x t r a c t i o n a n d a n t i o x i d a n ta c t i v i t y o f c h i c o r i c a c i d f r o m C i c h o r i u m l n t yb u sL.[D].Y a n g l i n g:N o r t h w e s tA&F U n i v e r s i t y,2016.(i nC h i n e s e)[6]杨敏,冯帅,史磊,等.菊苣酸提取及分离纯化工艺的研究概况[J].山东中医杂志,2020,39(7):749-753.Y A N G M,F E N G S,S H I L,e ta l.R e v i e w o nt h et e c h n o l o g y o fe x t r a c t i o na n d p u r i f i c a t i o n o fc h i c o r ya c i d[J].S h a n d o n g J o u r n a lo f T r a d i t i o n a lC h i n e s eM e d i c i n e,2020,39(7):749-753.(i nC h i n e s e) [7]王英超,王蕾,金红,等.超声微波协同萃取法提取菊苣酸条件研究[J].食品研究与开发,2015,15:38-41.WA N G Y C,WA N G L,J I N H,e t a l.S t u d y o ne x t r a c t i o n c o n d i t i o n s of u l t r a s o n i c m i c r o w a v es y n e r g i s t i c e x t r a c t i o n m e t h o d o f c h i c o r i c a c i d[J].F o o dR e s e a r c ha n dD e v e l o p m e n t,2015,15:38-41.(i nC h i n e s e)[8]朱若岑,蒋维维,谭柱良,等.动物体内活性氧㊁氧化应激与细胞凋亡以及抗氧化剂研究进展[J].中兽医医药杂志,2015,34(3):21-25.Z HU RC,J I A N G W W,T A NZL,e t a l.P r o g r e s so fr e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s,o x i d a t i v e s t r e s s,c e l l a p o p t o s i sa n da n t i o x i d a n ti n a n i m a l s[J].J o u r n a lo f C h i n e s eV e t e r i n a r y M e d i c i n e,2015,34(3):21-25.(i nC h i n e s e)[9]储蓄,张军霞,王晶.动物氧化应激及其营养调控措施研究进展[J].畜牧兽医学报,2021,52(12):3346-3356.C H U X,Z H A N GJX,W A N G J.R e s e a r c h p r o g r e s so fa n i m a l o x i d a t i v e s t r e s s a n d i t sn u t r i t i o n a l r e g u l a t i o n[J].J o u r n a l o f A n i m a l H u s b a n d r y a n d V e t e r i n a r yM e d i c i n e,2021,52(12):3346-3356.(i nC h i n e s e) [10]李先强,吴艳,王家乡,等.氧化应激对蛋鸡产蛋后期繁殖性能的影响研究进展[J].中国畜牧杂志,2021,57(11):16-21.L IX Q,WU Y,WA N GJX,e t a l.R e s e a r c h p r o g r e s so n e f f e c t s o f o x i d a t i v e s t r e s s o n r e p r o d u c t i v ep e r f o r m a n c e i n l a t e l a y i n g s t a g e o f c h i c k e n[J].C h i n e s e J o u r n a l o f A n i m a l H u s b a n d r y,2021,57(11):16-21.(i nC h i n e s e)[11] T A R I NJ J.A e t i o l o g y o f a g e-a s s o c i a t e d a n e u p l o i d y:Am e c h a n i s m b a s e d o n t h e f r e e r a d i c a l t h e o r y o fa g e i n g [J].H u m a n R e p r o d u c t i o n U p d a t e,1995,10(6):1563-1565.[12]贺琼玉.山竹醇调控氧化应激对仔猪肝脏脂肪合成的作用及机制研究[D].武汉:华中农业大学,2020.H E Q Y.E f f e c t a n dm e c h a n i s mo f g a r c i n o l r e g u l a t i n gl i v e r l i p o g e n e s i s i n p i g l e t su n d e r o x i d a t i v e s t r e s s[D].W u h a n:H u a z h o n g A g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y,2020.(i nC h i n e s e)[13]郭文晋.丁酸对高产奶牛氧化应激的缓解作用及其机制研究[D].长春:吉林大学,2020.G U O W J.E f f e c ta n d m e c h a n i s m o fb u t y r i ca c i do nr e l i e v i n g o x i d a t i v es t r e s si n h i g h-y i e l d i n g c o w s[D].C h a n g c h u n:J i l i nU n i v e r s i t y,2020.(i nC h i n e s e)[14]王红,冯帅,史磊,等.菊苣酸的研究进展[J].药学研究,2021,40(9):614-619.WA N G H,F E N GS,S H IL,e t a l.R e s e a r c h p r o g r e s so fc h i c o r i ca c i d[J].P h a r m a c e u t i c a lR e s e a r c h,2021,40(9):614-619.(i nC h i n e s e)[15] L I U Q,WA N G Y T,X I A OC X,e t a l.M e t a b o l i s mo fc h i c o r i ca c i db y r a t l i v e r m i c r o s o m e sa n db i o a c t i v i t yc o m p a r i s o n so fc h i c o r i ca c i da n di t s m e t a b o l i t e s[J].F o o d a n dF u n c t i o n,2015,6(6):1928-1935.[16]常小文.菊苣酸甲基化代谢产物对H2O2诱导H e p G2细胞氧化应激损伤的影响及作用机制研究[D].杨凌:西北农林科技大学,2021.40527期李一鹏等:紫锥菊根中菊苣酸提取工艺及对氧化应激肠道细胞的保护作用研究C HA N G X W.T h e r e g u l a t o r y m e c h a n i s m o fm e t h y l a t e d m e t a b o l i t e so fc h i c o r i ca c i d o n h y d r o g e np e r o x i d e(H2O2)-i n d u c e do x i d a t i v es t r e s si n H e p G2c e l l s[D].Y a n g l i n g:N o r t h w e s t A&F U n i v e r s i t y,2021.(i nC h i n e s e)[17]石瑶瑶,叶元土,蒋蓉,等.过氧化氢诱导的草鱼原代肝细胞氧化损伤模型的构建及其对天然植物抗氧化能力的评价[J].动物营养学报,2021,33(4):2290-2301.S H IY Y,Y E Y T,J I A N G R,e t a l.E s t a b l i s h m e n t o fo x i d a t i v ei n j u r y m o d e l o f g r a s s c a r p h e p a t o c y t e si n d u c e db y h y d r o g e n p e r o x i d ea n di t sa p p l i c a t i o ni na n t i o x i d a n tab i l i t y e v a l u a t i o n o f n a t u r a l p l a n t s[J].J o u r n a lo f A n i m a l N u t r i t i o n,2021,33(4):2290-2301.(i nC h i n e s e)[18]杜妍,甘春丽,曾庆轩,等.紫锥菊中酚酸类化合物的合成[J].哈尔滨医科大学学报,2017,51(3):200-205.D U Y,G A N C L,ZE N G Q X,e ta l.S y n t h e s i so fp h e n o l i c a c i d s i n E c h i n a c e a p u r p u r e a[J].J o u r n a l o fH a r b i nM e d i c a lU n i v e r s i t y,2017,51(3):200-205.(i nC h i n e s e)[19]姚兴东,聂园梅,D A T T A-G U P T A N.紫锥花种属中酚类化合物的H P L C分析[J].分析科学学报,2006,22(2):199-201.Y A O X D,N I E Y M,D A T T A-G U P T A N.H P L Ca n a l y s i s o f p h e n o l i c c o m p o u n d s i n E c h i n a c e as p e c i e s[J].J o u r n a lo f A n a l y t i c a l S c i e n c e,2006,22(2):199-201.(i nC h i n e s e)[20]马晓玲,魏鸿雁,冯薇源,等.正交设计优化紫锥菊提取工艺研究[J].新疆中医药,2014,32(3):52-54.MA X L,W E I H Y,F E N G W Y,e ta l.S t u d y o no p t i m i z a t i o no fe x t r a c t i o n p r o c e s s o f E c h i n a c e a b yo r t h o g o n a ld e s i g n[J].X i n j i a n g T r a d i t i o n a lC h i n e s eM e d i c i n e,2014,32(3):52-54.(i nC h i n e s e) [21] B A O D,WA N GJ,P A N G X,e t a l.P r o t e c t i v e e f f e c t o fq u e r c e t i na g a i n s t a x i d a t i v e s t r e s s-i n d u c e dc y t o t o x i c i t yi n r a t p h e o c h r o m o c y t o m a(P C-12)c e l l s[J].M o l e c u l e s,2017,22(7):1122.[22] C H E N G B,G U O Y,L IC,e t a l.E d a r a v o n e p r o t e c t e dP C12c e l l s a g a i n s t M P P(+)-c y t o x i c i t y v i ai n h i b i t i n g o x i d a t i v e s t r e s s a n d u p-r e g u l a t i n g h e m eo x y g e n a s e-1e x p r e s s i o n[J].J o u r n a l o f t h eN e u r o l o g i c a lS c i e n c e s,2014,343(1-2):115-119. [23] S I L V A J,A L V E S C,P I N T E U S S,e t a l.N e u r o p r o t e c t i v e e f f e c t s o f s e a w e e d s a g a i n s t6-h y d r o x i d o p a m i n e-i n d u c e d c e l ld e a t ho na n<i nv i t r o>h u m a nn e u r o b l a s t o m a m o d e l[J].B M C C o m p l e m e n t a r ya n dA l t e r n a t i v eM e d i c i n e,2018,18:58.[24]何方婷,陈嘉熠,徐佳伊,等.氧化应激细胞模型建立的研究进展[J].食品工业科技,2019,40(7):341-345.H EFT,C H E NJY,X UJY,e t a l.R e s e a r c h p r o g r e s so fe s t a b l i s h i n g c e l l u l a r o x i d a t i v e s t r e s s m o d e l[J].F o o d I n d u s t r y T e c h n o l o g y,2019,40(7):341-345.(i nC h i n e s e)[25]黄上峰,陆飞燕,黄元河,等.三七多糖抗氧化活性研究[J].微量元素与健康研究,2018,35(1):30-32.HU A N GSF,L UFY,HU A N G Y H,e t a l.S t u d y o nt h e a n t i o x i d a n t a c t i v i t y o f p o l y s a c c h a r i d e s o fP a n a x n o t o g i n s e n g(B u r k.)[J].T r a c eE l e m e n t sa n dH e a l t hR e s e a r c h,2018,35(1):30-32.(i nC h i n e s e)(责任编辑戴晔)5052。
紫锥菊中菊苣酸提取纯化工艺研究
紫锥菊提取物中菊苣酸的提取纯化研究菊苣酸是紫锥菊提取物中极为重要的免疫活性成分之一，具有增强人体免疫力和抗炎作用。
现有的高纯度菊苣酸制备工艺对生产设备要求高、不易放大，且目前只能生产对照品，这在很大程度上限制了紫锥菊提取菊苣酸生产的高效率、低成本化发展。
因此，西安源森生物实验室将紫锥菊中提取纯化菊苣酸成分的工艺作为本次实验主题进行研究：一、源森生物紫锥菊提取菊苣酸准备仪器与材料高效液相色谱仪；L—7420紫外检测器；RE—52A旋转蒸发器；DZ—2BC型真空干燥箱；紫锥菊根→自然干燥→粉碎；菊苣酸对照品；纯度94%;AB-8树脂。
二、源森生物紫锥菊提取纯化菊苣酸的方法与结果（一）HPLC法测定紫锥菊提取物中菊苣酸的含量1. 色谱条件：色谱柱:A lltima C18(250 mm×4. 6mm, 5μm)；流动相:乙腈-1. 8%冰醋酸(25∶75)；体积流量: 1. 0mL /m in；检测波长: 327 nm；柱温: 35℃；进样量: 5μL。
2. 标准曲线的制备：精密称取菊苣酸对照品5. 05mg→置10mL量瓶中→用70%乙醇溶解并加至刻度→精密吸取对照品溶液0. 5、1. 0、2. 0、3. 0、4. 0、5. 0、6. 0μL注入液相色谱仪中→测定峰面积。
以菊苣酸质量X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，得方程:Y= 401 209X+ 23 809，r= 0. 999 5，线性范围:0. 25～3. 03μg。
3. 供试品溶液的制备：精密称取各提取物、纯化物、萃取物样品适量→置10mL量瓶中→用70%乙醇溶解→超声提取10 m in→加70%乙醇至刻度→过0. 45μm滤膜，即得。
4. 测定：采用外标法进行测定。
（二）紫锥菊植物中提取菊苣酸1. 提取溶剂的选择：从紫锥菊植物中提取菊苣酸一般采取乙醇、甲醇或它们的水溶液。
考虑到试剂价格和工业化生产的可行性，西安源森生物本实验选择乙醇作为提取溶剂。
市售国内紫锥菊提取物质量评价
市售国内紫锥菊提取物质量评价作者：安士影胡玉梅苗宏伟孟兆青王佩香丁岗王振中萧伟来源：《中国中药杂志》2012年第22期[摘要] 目的：测定市售样品中多酚的含量，为紫锥菊提取物综合质量评价提供研究依据。
方法：通过LC-MS对市售紫锥菊提取物商品中各相关成分定性，采用优化的美国药典方法、RP-HPLC及一测多评法测定多酚的含量；同时按照国际标准ISO14502-1-2005，采用UV进行含量对比分析。
结果：所购6批市售紫锥菊提取物中HPLC测定多酚含量均未达到外贸出口标准，UV测定多酚含量4批符合标准，2批不符合。
结论：国内紫锥菊提取物含量测定普遍采用UV，结果与HPLC差异较大，为提升质量标准，与国际接轨，建议宜尽快使用HPLC检测方法，规范提取物质量，提高市场准入标准。
[关键词] 紫锥菊提取物；HPLC；多酚；LC-MS；含量测定松果菊（习称紫锥菊）是菊科Compositae松果菊属Echinacea植物，分布在北美洲，该属植物约有9种，主要药用种是狭叶松果菊E. angustifolia，紫花松果菊E. purpurea和淡紫松果菊E. pallida。
松果菊的治疗用途十分广泛，可以治疗各种炎症和感染，其疗效得到越来越多临床医生的肯定[1]。
现在欧美各国广泛应用该草药作为免疫促进剂和免疫调节剂，预防和治疗各种感染性疾病，目前国外有1 000多种紫锥菊或其复方制剂，仅德国就有800多种[2]。
在我国，紫锥菊的研究起步较晚，市场上紫锥菊产品种类较少。
目前，紫锥菊在我国许多地方已引种成功并形成一定规模，其提取物市场发展尤其快，主要规格为4%多酚（以咖啡酸、菊苣酸、绿原酸、紫锥菊苷4种成分总和计算）。
为了对国内紫锥菊提取物质量进行初步评估，本文参照并优化美国药典方法[3]，以LC-MS对相关色谱峰进行定性，根据美国药典中紫锥菊一测多评法校正因子计算，对6批国内市售紫锥菊提取物进行检测。
同时，采用目前国内普遍使用的的紫外法（福林酚法）进行多酚含量测定，并与HPLC进行对比分析，为客观评价国内紫锥菊提取物的质量提供依据。
2010紫锥菊中有效成分的分离提取工艺研究
收稿日期 : 2009 - 11 - 23. 作者简介 :张广求 (1979 - )男 ,讲师. 主要研究方向 :天然药物研究与开发.
第 2期 张广求 ,王亚洲 ,袁永华 ,等 :紫锥菊中有效成分的分离提取工艺研究
151
酸 3种有效物质进行含量分析 ,从而确定紫锥菊提 取工艺的较佳工艺参数.
Vol. 19 No. 2 M ar. 2010
紫锥菊中有效成分的分离提取工艺研究
张广求 1 ,王亚洲 2 ,袁永华 3 ,王伯初 2
(1. 云南民族大学 化学与生物技术学院 ,云南 昆明 650031; 2. 重庆大学 生物工程学院 ,重庆 400044; 3. 云南省玉溪一中 ,云南 玉溪 653100)
正交实验设计表如表 3.
6
2
3
1
2
7
3
1
3
2
2 实验结果及分析
实验结果如表 4、表 5.
8
3
9
3
表 4 提取物中总酚和菊苣酸含量及正交分析表
实验号 料液比 时间 / h 浓度 / % 温度 / ℃ 总酚含量 / % 料液比 时间 / h
1
1
1
1
1
2190
1
1
2
1
2
2
2
3106
1
2
3
1
33Βιβλιοθήκη 331731
3
4
2
1
2
3
3151
2
1
5
2
2
Study on the Extraction and Pur if ica tion Process of Effective Com ponen t in E ch inacea P u rpu rea
紫锥菊根中菊苣酸的提取分离及其分子印迹聚合物的制备
ｃａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄ （ Ｂ）
１ 材料与方法
１．１ 试验仪器和试验材料 Ｗａｔｅｒｓ １５２５ ＨＰＬＣ 系统（ 包 括 二 元 高 压 梯 度 泵、自动 进 样 器、 柱 温 箱、２９９８ 二 极 管 阵 列 检 测 器），超声清洗仪（ 宁波新芝生物科技股份有限公 司） ，旋转蒸发器（ 上海亚荣生化仪器厂），冷冻干燥 机（北京松源华兴科技有限公司），ＴＤＬ－６０Ｂ 低速离 心机（上海安亭科学仪器厂），ＩＳＯ－９００１ 电子天平（北 京赛多利斯仪器系统有限公司），ＴＴＬ⁃ＤＣ 型多功能 氮吹仪（ 北京同泰联科技发展有限公司） 。 菊苣 酸 对 照 品， 批 号 ＭＵＳＴ － １６０１０７１０， 购 自 成都曼思特生物科技有限公司中国科学院成都生 物研究所；乙腈、甲醇（ 色谱纯） 均购自德国默克公 司；磷酸、二 甲 基 亚 砜 （ ＤＭＳＯ） 均 为 分 析 纯， 紫 锥 菊根细 粉 （ ８０ 目） ，均 购 自 北 京 绿 源 生 物 有 限 公 司；偶氮二 异 丁 腈 购 自 天 津 市 科 密 欧 化 学 试 剂 有
酸、丁香酸、 阿 魏 酸、 香 草 酸、 咖 啡 奎 尼 酸、 洋 蓟 酸 等［４］ 。 近年来，对菊苣酸的药理 学 研 究 显 示 其 具 有抗炎［５－６］ 、抗病毒［７］ 、抗氧化［８］ 、抗菌［９］ 、抗结肠 癌［１０］ 及缓解记忆减退［１１］ 等功效。 随着对菊苣酸药理学的研究深入，研究者也 在进行菊苣酸提取工艺的深入研究。 目前对紫锥 菊中菊苣酸的提取纯化多应用喷雾提取［１２］ 、高速 逆流色谱［１３］ 及制备色谱［１４］ ，此技术所得化合物纯 度高，但设备和操作的较为繁杂。 近年来，分子印 迹聚合物（ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒ，ＭＩＰ） 由于 其特异 性 识 别 的 性 能 引 起 国 内 外 广 泛 学 者 的 关 注。 ＭＩＰ 的制 备 过 程 分 为 ３ 个 步 骤：首 先 是 由 特 定印迹分子为模板与功能单体通过共价键或非共 价键结合，再加入交联剂在 ＭＩＰ 周围形成刚性聚 合物，最后再将印迹分子洗脱下来。 由此，在聚合 物分子内留下了符合印迹分子结构的立体空穴，
高效液相色谱法测定保健食品中的菊苣酸
高效液相色谱法测定保健食品中的菊苣酸[摘要] 目的建立保健食品样品中菊苣酸的高效液相色谱快速分析方法。
方法称取适量样品，加入10ml0.05%磷酸溶解后，用甲醇定容至25ml，超声15min，取上清液10μl进样分析。
结果在选定的色谱条件下，样品中的菊苣酸能与样品中的干扰成分实现基线分离。
在0.0~50.0µg/ml范围内线性良好，检出限为0.0003g/100g。
标准溶液重复进样测定，峰面积和保留时间的相对标准偏差为3.71%和0.94%，将所建立的方法用于保健食品样品的分析，取得了较为满意的结果，加标回收率为94.5%～117.5%，样品测定的相对标准偏差为2.18%～5.28%。
结论该法可应用于保健食品中菊苣酸的测定，方法简单快速，可应用于大批量样品的快速检测。
菊苣酸为咖啡酸衍生物，是紫锥菊中极为重要的免疫活性成分之一，具有增强免疫功能、抗炎、抗氧化和清除自由基能力研究还表明，菊苣酸具有抑制HIV-1和HIV-2整合酶的作用[1~2]。
因其具有多种生理功能，常被添加于一些保健食品中以获得相应的保健功效，因此检测这类保健食品中菊苣酸的含量，是其质量监控和保健功能评价的重要质量指标。
目前，测定菊苣酸的方法主要有薄层色谱分析法[3]、高效液相色谱法[4~5]和毛细管电泳[6]等，其中高效液相色谱法应用最为广泛。
本文根据菊苣酸的结构和性质，以及保健食品的特点，建立其高效液相色谱快速分析方法，并对色谱条件和样品提取条件进行了详细的考察。
1 材料与方法1.1 主要仪器与试剂AKTA purifier液相色谱仪(GE Healthcare, General Electric Co. Ltd, USA)标准品（111752-200601，中国药品生物制品检定所）、乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、超纯水、磷酸（优级纯）。
标准贮备液配制：准确称取一定量标准品，加入10ml0.05%磷酸，溶解后用甲醇定容，配制成1mg/ml菊苣酸标准贮备液。
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Ξ 收稿日期: 2001212231 基金项目: 科技部国家“十五”攻关项目 (201J ZY2089) ; 湖南省科技厅重点项目 (01J ZY1005)
中草药 Ch inese T raditiona l and H erba l D rugs 2002 年第 33 卷第 10 期
·891·
验选用醋酸铵缓冲溶液作为流动相时, 不但得到较 对称的峰形, 而且有效地降低了检测限。 21312 流动相组成的选择: 比较了流动相中不同浓 度醋酸铵 (10, 20, 30, 100, 200, 400 mm o l L ) 对菊苣 酸保留特性的影响, 结果表明随着醋酸铵浓度增加, 出峰时间增长, 当醋酸铵浓度为 400 mm o l L 时可 以得到菊苣酸最佳分离 (图 1)。 同时比较了不同甲 醇比例 (100∶0, 97∶3, 96∶4, 95∶5) , 随着甲醇含 量减少, 出峰时间缩短, 没有甲醇时, 20 m in 内不出 峰, 结果表明 400 mm o l L 醋酸铵2甲醇 (95∶5) 是 最佳的配比 (表 2)。
图 2ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ紫锥菊提取物 2 (A) 和菊苣酸复方
3 讨论
制剂 (B) 的 HPLC 图谱
311 与梯度方法的比较: 按文献报道的梯度淋洗条 件[2～ 4]分析菊苣酸提取物, 结果峰出现拖尾。 但当流
动相中未加磷酸时, 虽峰未出现拖尾, 但检出的菊苣
酸含量很小, 大部分菊苣酸未能从柱上洗脱下来; 而
[ 2 ] N igel B P, E laine J B , V le A G. Ech inacea standard ization:
anan lytical m ethod s fo r p heno lic com pound s and typ ical levels
in m ed icinal sp ecies[J ]1 J A g ric Food Chem , 2001, 49: 17022 17061 [ 3 ] H yun2ock K, Tom o thy D D , Ch ristine H S, et a l. R eten ion of caffeic acid derivatives in d ried E ch inacea p u rp u rea [J ] 1 J A 2 g ric Food Chem , 2000, 48: 4182241861 [ 4 ] Chun H , D avid D K. Stud ies on the an tiox idan t activity of Ech inacea roo t ex tract [ J ] 1 J A g ric Food Chem , 2000, 48: 1466214721 [ 5 ] 陈 波, 潘振球, 范元成, 等 1 高效液相色谱法制备菊苣酸标准 对照品的研究[J ]1 实用预防医学, 2001, 8 (1) : 152171
紫锥菊 E nch inacea p u rp u rea L. 为紫菀科的全 草, 连续数年入选美国最畅销植物药行列[1]。近几年 我国已从北美和欧洲引进了该药材。 菊苣酸是其主
要的生理活性成分。 紫锥菊及其复方制剂中菊苣酸 分离、分析方法较少, 常用梯度淋洗[2～ 4], 但是在分 析时, 需要两种流动相系统, 操作繁杂。 本实验首次 应用醋酸铵2甲醇流动相与 C18 反相柱, 选择二极阵 列管检测器, 准确、快速地分析了复方制剂中菊苣酸 的含量, 结果满意。 1 实验部分 111 仪器和试剂: W a ters 2695 分离单元, W a ters 996 二极管阵列U V 检测器。水为二次蒸馏水; 紫锥 菊提取物、菊苣酸复方制剂采自市场; 菊苣酸对照品 (自制) [5]。 所用试剂均为分析纯。 112 样品处理: 取紫锥菊提取物 1 g, 加 20 mL 水, 超声提取 20 m in, 离心, 弃去残渣, 上清液多次加入 氯仿提取色素, 弃去氯仿层, 水相用甲酸调至 pH = 3, 加入乙酸乙酯提取 (3×30 mL ) , 蒸干乙酸乙酯, 残渣用 50% 甲醇2水定容至 10 mL , 样液离心后过 0145 Λm 滤膜, 即得。 113 色 谱 条 件: 采 用 X terraTM C18 柱 ( 5 Λm , 150
表 1 提取溶剂的影响
提取溶剂
水 丙酮 丙酮2水 (8∶2) 乙醇 乙醇2水 (2∶8) 甲醇2水 (8∶2)
菊苣酸的提取率 (% ) 95
0. 4 0. 8 0. 2 83. 6 2. 1
213 流动相的选择 21311 缓冲溶液的选择: 菊苣酸很容易拖尾, 可能 是结构中的羟基与固定相硅羟基作用而致, 用磷酸、 甲酸缓冲溶液作为流动相时, 峰拖尾十分严重。本实
等度分析时, 菊苣酸出峰时间快, 不拖尾, 与标准梯度
淋洗比较峰面积差值小于 5% , 两结果无明显差异。
312 本研究建立了等度高效液相色谱紫外检测的
定量分析方法, 方法快速、简便、准确, 可用于菊苣酸
复方、菊苣酸提取物的分析。
参考文献:
[ 1 ] 肖培根 1 国际流行的免疫调节剂—— 紫锥菊及其制剂[J ]1 中 草药, 1996, 27 (1) : 462481
acid in E. p u rp u rea ex t ract and it s p rep a ra t ion w ith sa t isfacto ry resu lt s.
Key words: E nch inacea p u rp u rea L. ; cicho ric acid; H PL C
D eterm ina tion of c ichor ic ac id in E nch ina cea p u rp u rea and its prepara tion by HPLC LU O Xu2b iao , CH EN Bo, ZHU X iao 2lan, YAO Shou2zhuo
·890·
中草药 Ch inese T raditiona l and H erba l D rugs 2002 年第 33 卷第 10 期
·药剂与工艺·
紫锥菊及其复方制剂中菊苣酸的 HPLC 测定
罗旭彪, 陈 波, 朱小兰, 姚守拙Ξ
(湖南师范大学化学研究所, 湖南 长沙 410081)
摘 要: 目的 测定紫锥菊及其复方制剂中菊苣酸的含量。方法 采用 H PL C 法, 流动相为 400 mm o l L 醋酸铵2甲 醇 (95∶5) , 流速为 1 mL m in, 检测波长为 330 nm。结果 该法的平均回收率为 99141% , R SD = 3123% (n= 5)。结 论 该方法可用于紫锥菊药材提取物及其制剂的质量控制。 关键词: 紫锥菊; 菊苣酸; 高效液相色谱 中图分类号: R 286102 文献标识码: A 文章编号: 0253 2670 (2002) 10 0890 02
验, 结果峰面积 R SD 为 2184%。 217 回收率试验: 精密称取已知含量的紫锥菊提取 物, 加入一定量菊苣酸对照品, 按样品的含量测定的 方 法 进 行 测 定, 计 算 回 收 率, 得 平 均 回 收 率 为 99141% (n= 5) , R S D = 3123%。 218 样品的含量测定: 样品溶液进样 1 ΛL , 以峰面 积计算菊苣酸的含量。 结果见表 4。 色谱图见图 2。
表 3 菊苣酸不对称因子与流动相 pH 值的关系
pH 值 不对称因子
3 > 1. 5
4 > 1. 5
5 1. 32
6 1. 10
214 标准曲线: 精密称取菊苣酸对照品 10 m g, 置 10 mL 量瓶中, 以甲醇2水 (5∶5) 溶解并稀释至刻 度, 摇匀。 精密吸取对照溶液 1, 2, 3, 5, 7, 9 ΛL 按上 述色谱条件测定。 以对照品质量 X (Λg) 为横坐标, 峰 面 积 Y 为 纵 坐 标, 得 方 程: Y = 32 106116 X 45121, r= 01999 1, 线性范围: 1～ 9 Λg。在最佳色谱 条件下, 以基线噪音的 3 倍所相当的物质的质量为 最低检出限, 计算出最小检出量为 200 ng。 215 精密度试验: 对紫锥菊提取物样品的溶液进行 测定, 连续自动进样 5 次, 计算得峰面积 R SD = 0187% , 说明系统稳定性好。 216 重现性试验: 对同一批号样品进行 5 次平行试
(Chem ica l R esea rch In stitu te, H unan N o rm a l U n iversity, Changsha 410081, Ch ina)
Abstract: O bject To determ ine the am oun t of cicho ric acid in E nch inacea p u rp u rea and it s p rep a rat ion. M ethods B y the u se of H PL C , m ob ile p ha se: 400 mm o l L amm on ium aceta te2m ethano l (95∶5) , flow ra te: 1 mL m in, detect ion w aveleng th: 330 nm. Results T he m ean recovery of cicho ric acid w a s 99141% , R S D = 3123% (n= 5). Conclus ion T he m ethod can be app lied in the determ ina t ion of cicho ric
400 mm o l L 醋酸铵2甲醇
100∶0 97∶3 96∶4 95∶5
保留时间 (m in) > 20 7. 27 5. 61 4. 46
21313 pH 值的选择: 考察了流动相 pH 值与菊苣 酸峰的不对称因子间的关系, 结果见表 3。 随着 pH 值减少, 菊苣酸的峰拖尾现象逐步严重, 当 pH = 6 时峰形最佳。