微生物克隆文库的综述

JISHOU UNIVERSITY本科生毕业论文题 目： 微生物克隆文库的综述 作 者：学 号： 20114071021所属学院： 生物资源与环境科学学院专业年级： 11级生物科学（师范）指导教师： 职 称：副教授 完成时间：2015年4月5日吉首大学教务处制独创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。

除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。

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同意吉首大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。

(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)论文题目：学生签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日目录摘要........................................................................................... 错误！未定义书签。

Abstract ....................................................................................... 错误！未定义书签。

前言............................................................................................. 错误！未定义书签。

1具体微生物克隆文库的目的和意义...................................... 错误！未定义书签。

2构建微生物克隆文库的方法.................................................. 错误！未定义书签。

2.1技术路线........................................................................ 错误！未定义书签。

2.2获取目的基因 (6)2.3 质粒的准备过程........................................................... 错误！未定义书签。

参考文献..................................................................................... 错误！未定义书签。

致谢.. (10)微生物克隆文库的综述摘要：在微生物领域研究中，想要更加深入全面的了解微生物在理化性质上形成的机理，需要有针对性的对各种菌理化特性进行研究。

然而近年来的研究发现传统培养微生物的方式和鉴定手段上存在着很多弊端,例如，微生物的组成，生微生物种间关系。

因此，必须探索新的微生物培养研究方法。

随着分子生物学技术的快速发展，许多种微生物克隆方法都应运而生，在实验中不段发展、完善。

该文就现阶段微生物克隆的概念，意义，以及方法进行简要概述。

关键字微生物，微生物克隆文库，方法；前言在微生物生态学研究中，分子生物学的理论与技术至关重要,微生物多样性的研究有了许多突破，其结果更趋于真实。

基因是细胞内具有遗传效应的特定的脱氧核苷酸序列，即DNA分子片段。

基因克隆技术是分子生物学手段上的一系列技术。

美国斯坦福大学的伯( P． Berg) 等合成一种新的重组DNA 分子，为基因克隆技术的研究奠定了基础[1]。

科恩( S． Cohen)等人把一段外源DNA 片段与质粒DNA 连接组成的重组质粒转入大肠杆菌，首次完整地建立了基因克隆体系[2]。

1具体构建微生物克隆文库的目的和意义构建微生物克隆文库的开始阶段，需要要查看大量的文献，弄清楚该微生物基因的相关理化特性。

微生物克隆文库是一种结合生物学、基因组学和生物信息学等学科知识技术方法, 首先以微生物基因组DNA 的序列信息为依据, 通过分析样品中DNA 分子的种类和数量来反映微生物区系的组成和群落结构及其变化[3]。

构建克隆文库是微生物分子生态学中用来研究微生物组成的常用方法之一[4] , 目前细菌菌群分析中应用最多的是16S rDNA 克隆文库方法。

它是通过对16S rDNA全长序列进行扩增和分析, 达到研究和监测样品与环境中细菌多样性、种群结构和区系变化的目的[5-6] , 并应用于水体、土壤、海洋沉积物、生物水处理系统中的微生物分析。

本文采用建立16S rDNA 克隆文库的方法, 通过测序并与已知序列比较确定细菌种类, 以揭示有机物料腐熟菌剂样品中的细菌组成, 同时也可以根据克隆文库中克隆子出现的频率了解样品的细菌组成比例。

2构建微生物克隆文库的方法2.1技术路线→→→→→获取样品PCR 产物纯化连接转化克隆文库2．2 获取目的基因目的基因的序列已知时，通常利用PCR( Polymerase Chain Reaction，即多聚酶链式反应) 技术来分离目的基因序列。

PCR 技术是1985 年由美国 Cetus 公司开发的分子生物学技术，它具有能专一、快速、简便。

高效地体外扩增特定的DNA 片段的功能，在微生物克隆文库领域应用广泛。

此外，对于一些未知核苷酸序列核酸片段，一些经过改进的PCR 法可以对其特异扩增[7]。

这是方法参考了已知基因的序列克隆基因技术。

在已知的许多的植物基因序列中，当克隆类似基因时可先从Gene bank 库中找到有关基因序列，用 PCR 方法克隆到不同植物的基因。

但是对于知道功能，已知类似序列的基因却查不到，这一方法不能使用。

PCR方法简便快速，适用于此方法去克隆目的基因。

例如：国内利用PCR方法已经克隆到豌豆外源凝集素基因[8]，酵母超氧化物歧化酶基因[9]、水稻富硫10KD 醇溶蛋白基因[10]。

PCR 扩增法的一般操作程序如下: ( 1) 目的基因序列的扩增。

如果目的基因序列已知，就可以通过设计引物进行PCR; 未知基因序列时，可以经过Genebank 根据保守序列设计引物扩增。

( 2) PCR 扩增产物的连接、转化、重组、筛选。

2.3 质粒的准备过程质粒DNA的准备工作，运用实时荧光定量 PCR方法，通过已知绝对含量的标准物质的标准曲线计算目标分子的含量。

2.3.1 PCR反应16S 细菌PCR 反应程序：1）94℃ for 5min 2）94℃ for 1min 3）50℃ for 45S4）72℃ for 1min 30S 5）Goto 2,24 times 6）72℃ for 10min7）12℃ forever2.3.2 PCR产物的纯化对 PCR 扩增后的产物进行纯化处理，保证反应产物的纯度。

1）每 100ulPCR 扩增后体系加入 500ul 结合液 DB,充分混匀;2）将步骤一所得溶液加入吸附柱 AC 中，首先室温放置1min，然后12000rpm /min 离心，弃掉废液;3）加入 700ul 漂洗液 WB（必须加入无水乙醇），12000rpm /min离心，弃掉废液;4）加入 500ul 漂洗液 WB，12000rpm/min 离心，弃掉废液;5）将吸附柱 AC 放回空收集管中，6000rpm/min 离心，去除漂洗液（避免漂洗液中的乙醇抑制下游反应）；6）取出吸附柱 AC,放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加入 50ul 洗脱缓冲液 EB,室温放置 2min，12000rpm 离心 1min，即得到纯化好的PCR 产物。

2.3.3 连接转化以及DNA纯化常见问题及对策连接反应（按照 pGEM-Teasy 载体操作说明书进行。

DNA纯化常见问题及对策：1）凝胶无回收产物或回收率低,其可能原因有电泳缓冲液老化造成PH值升高，PW未去除干净，洗脱缓冲液用量过少等。

因此，需要使用新配置的缓冲液进行制胶和电泳，空甩2分钟充分去除PW,根据起始量使用适量的洗脱液；2）回收DNA质量不好，其可能原因是洗脱产物含有乙醇残留。

因此，在洗脱前课再次离心。

彻底去除乙醇残留。

参考文献［1］JACKSON，D. A. ，P. BERG and R. H. SYMONS，biochemical method for inserting new genetic information into DNA of simian virus 40 – circular sv40 DNA molecules contaning lambda phage genes and galactose oreron of escherichia － coli［J］. Procedings of the national academy of sciences of the united states of America，1972，6 9 ( 10) : 2904 － 2908.［2］Cohen，S. N. Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro［J］. Biotechnology，1992，24.[3] 李武, 王凌华, 等.微生物学通报,2006 , 33(1):53 ～ 58.[4] Amman R J , Ludwig W, S chleifer K H .Mi crobiol Rev , 1995, 59 :143～169.[5] Brambi lla E, Hippe H , Hagelstein A , et al.Extremophiles , 2001 , 5(1):23 ～ 33.[6] Baker G C , Gaiar S , Cowan D A, et al .FEMS Microbiology Let ters ,2001, 200 :103 ～ 109.［7］Preston，G. M. ，Polymerase chain reaction with degenerate oligonucleotide primers to clone gene family members［J］. Methods in Molecular Biology; Basic DNA and RNA protocols，1996: 303 － 312. ［8］李向辉，刘春明，于占洋，等. 豌豆外源凝集素基因的克隆及序列分析［J］. 遗传学报，1995( 4) : 89 － 92.［9］王爽. 蜡样芽孢杆菌M22 超氧化物歧化酶( SOD) 基因在毕赤酵母中的表达及其发酵条件优化［J］. 植物病理学报，2005 ( S1) : 210.［10］王广立，水稻10kD 醇溶蛋白基因克隆、序列分析及对植物百脉根的转化［J］. 植物学报，1994( 5) : 351 － 357.致谢本毕业论文是在导师李朝阳老师的亲切关怀和悉心指导下完成的。