细胞培养操作步骤
细胞培养实验步骤大全(精华版)
细胞培养实验步骤大全(精华版)细胞培养是生物学研究中常用的技术，在许多实验室中都扮演着重要角色。
下面是细胞培养的一般步骤，供参考。
材料准备1. 细胞培养基：根据实验需求选择适当的培养基，如DMEM、RPMI 1640等。
2. 细胞培养器具：培养皿、离心管、移液器等。
3. 细胞培养室：确保环境清洁、无菌。
细胞准备1. 细胞来源：选择要培养的细胞系或原代细胞。
2. 细胞传代：如果使用的是细胞系，根据需要进行传代，确保细胞状态良好。
细胞培养1. 细胞计数：使用显微镜和细胞计数仪等工具，准确计算细胞数目。
2. 细胞接种：按照实验要求，在含有培养基的培养皿中接种适量的细胞。
根据细胞类型的不同，可能需要预先涂覆培养皿。
3. 细胞培养条件：根据细胞类型的要求，提供适宜的培养条件，如温度、湿度和CO2浓度等。
4. 培养培养：定期更换培养基，保持细胞处于良好的生长状态。
5. 细胞观察：使用显微镜观察细胞形态和生长情况，检测是否存在异常。
细胞处理1. 细胞传代：根据细胞数量和状态，决定是否进行细胞传代。
传代可以延续细胞的寿命和维持细胞应答。
2. 细胞刺激：根据实验设计，给予细胞适当的刺激，如添加药物、因子或介质等。
3. 细胞采集：当需要获取细胞样本时，使用细胞剥离剂或胰蛋白酶等方法将细胞从培养皿中采集。
4. 细胞冻存：如果需要长期保存细胞，可以使用液氮冷冻保存的方法。
先加入冻存液，然后将细胞在适当条件下冷冻保存。
以上是细胞培养的一般步骤，根据具体实验和细胞类型，步骤可能会有所调整和细化。
在进行细胞培养实验时，请始终注意无菌操作和合理使用实验工具，以确保实验结果的准确性和可靠性。
细胞培养的实验步骤
细胞培养的实验步骤细胞培养的实验步骤如下：1、细胞复苏：细胞培养条件2、复苏流程：（1）确认水浴锅的水清洁可用，方可提前打开37度预热。
（2）确认好复苏细胞的液氮罐中具体位置，并做好复苏登记。
（3）提前做好复苏准备，预热培养基。
（4）悬浮和贴壁细胞复苏参数：（5）将细胞快速放入37度水浴锅中迅速溶解，1.8ml时间大概1分30秒，1ml大概1min左右，需计时，其间不要老是拿起来观察，需要快速复溶，避免细胞受到损伤。
（6）贴壁细胞需离心，1000rpm，5min。
悬浮细胞直接加入预热的培养基中然后放入培养箱中（7）贴壁细胞离心后去除上清，用预热的培养基重悬细胞后加入T25方瓶，蕞后放入培养箱中培养。
（8）取小样计数观察，细胞活力在70%以上算正常。
低于70%活力可能细胞状态不太好，需要培养和恢复。
3、细胞传代培养1．悬浮细胞传代流程：（1）先将装有细胞的摇瓶从培养箱拿出，用酒精喷洒瓶身后将摇瓶拿进超净台。
（2）打开摇瓶瓶盖，用200ul移液器取100~200ul细胞放入1.5mlEP管中，瓶盖过火，拧紧，将培养瓶放回摇床。
（3）将200ul细胞混匀，取10ul细胞加入10ul台盼蓝，显微镜下计数。
根据细胞数决定下游实验。
（4）细胞需计数两次求平均值。
（5）悬浮细胞生长参数（6）根据不同细胞的生长曲线在合适的时间和密度给细胞接种传代。
以sf9细胞为例：细胞接种密度0.4x10^6个/ml,24h密度1x10^6个/ml,48h密度2.4x10^6个/ml,72h密度6x10^6个/ml，此时需要传代细胞。
要求留样100ml0.4x10^6个/ml具体操作如下：计算：需要母细胞体积=100*0.4/6=6.6ml需要培养基体积=100-6.6=93.4ml将上面体积的细胞和培养基加入摇瓶中，放回27度培养箱培养即可2.贴壁细胞传代流程：（1）显微镜下观察细胞状态和密度，80%汇合率以上需要传代。
（2）T25方瓶中加入0.5ml~1ml0.25%胰酶溶液（需37度预热），使瓶底细胞都浸入溶液中。
细胞培养的方法与步骤
细胞培养的方法与步骤1．开紫外灯前先擦超净台，台内紫外30分钟，室内紫外10分钟。
同时将放在4℃内的培养液提前放置到室温。
（可放在抽屉中，防止紫外照射）换液2．先将培养液打开（开一层烧一层），放置在酒精灯旁。
3．将细胞从培养箱中拿出，进超净台前先要喷酒精。
4．打开培养瓶，烧瓶口，而后弯脖朝后，倒液，注意瓶口不要残留液体，若有残液要用纱布擦净。
5．倒培养液（之前要烧瓶口），注意量（5ml）不要再瓶口有残留液体是烧瓶口，否则碳化的培养液会对细胞的生长有毒害作用。
6．倒一瓶封一瓶，迅速放平，培养瓶口拧紧后再松一下，放入培养箱中。
传代2．拿出细胞，开口，烧，倒液。
3．（5ml大枪加3ml）用PBS洗2~3遍（洗净血清，放置血清钝化胰酶）。
4．胰酶消化，37℃5分钟（时间可自控）。
消化程度是细胞不能滑落，要吹落。
500微升胰酶（4×，1%）+1.5mlPBS→工作浓度0.25%（此时要用大枪）。
5．（大枪）加入3mlDMEM完全培养液终止消化，用吸管缓慢吹打壁上的细胞（不要让吸管的嘴端接触到瓶壁）6．将混合物吸入离心管，加封口膜，离心500g 5分钟（此时洗去胰酶）在此期间PBS 洗培养瓶3遍，PBS一定要吸净，否则加入培养液后会产生沉淀（培养瓶要重复使用，至少100次）7．倒掉上清，此时动作要轻或用大枪吸，加入3mlDMEM完全培养液重悬细胞，用吸管吹掉（再洗，清除胰酶）。
8．离心完毕，加入3ml新鲜培养液，再次吹打（约50~100下，视细胞情况而定），防止起泡沫，至细胞单个，圆球状为宜。
9．在培养瓶中加入新鲜培养液4ml，将吹打起来的细胞分配至各培养瓶中（量依需要而定）。
80微升，100微升都可以。
冻存8．在冻存管中加入200微升冻存液，在离心管中加入1000微升冻存液，吹打（防止起泡），移入冻存管中，此段时间不宜过久（DMSO对细胞伤害很大）。
9．封口膜封紧冻存管，可多封几层，用胶布缠紧，只缠一层就行，然后写字。
细胞培养过程
细胞培养过程：复苏、换液、传代、冻存1、复苏（1）取适量培养液加入离心管中；（2）将冻存的细胞在37℃水浴中快速使其融化；（3）将细胞吸入离心管中，1000r.min-1离心5 min,倒去上清液，规定加入培养液，打匀，转移到培养瓶中，即可。
2、换液（1）将培养瓶中已变色的培养液倒掉，余液用棉花蘸掉；（2）用PBS洗涤培养瓶（从没有细胞的一侧倒掉）（3）加入新鲜培养液，即可。
3、传代（细胞生长得较满、较好，分瓶后至少培养两天后再铺板）（1）将培养瓶中已变色的培养液倒掉；（2）用PBS洗涤培养瓶（细胞一侧）；（3）加入2 mL胰酶，静置，待细胞将脱落时，倒掉胰酶，加入培养液，打匀后，分至多个瓶中。
4、冻存（1）将培养瓶中已变色的培养液倒掉；（2）用PBS洗涤培养瓶（细胞一侧）；（3）加入胰酶，静置，待细胞将脱落时，倒掉胰酶（可不倒），加入适量培养液，将贴壁细胞吹落，吸入到离心管中，1000r.min-1×5min,倒掉上清液，加入900uL新生牛血清（营养来源）和100 uLDMSO（保护剂）打匀后，吸到冻存管中，密封，于-80℃冻存。
1.预先配制冻存液：10 % DMSO + 90%胎牛血清，4℃冰箱保存预冷；2.用胰酶对细胞进行消化：倒去培养瓶中的培养基或用枪小心吸去培养板中的培养基，PBS 冲洗两次，用胰酶消化细胞（尽可能温和）；3.再次用完全培养液悬浮细胞，将预冷的冻存液加入消化完全的细胞中，用滴管轻轻吹打混匀。
4.在每支冻存管中加入1ml细胞液，密封后标记冻存细胞名称和冻存日期。
5.冻存步骤的细致直接关系到细胞复苏时的活力，如果有程序降温器（放在-80℃冰箱过夜，放入液氮罐）最好；或者可以在4℃，2h；然后转到-20℃，2h；-80℃，2h；放入液氮罐。
细胞复苏1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；3. 离心， 1000rpm，5min；4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；5. 次日更换一次培养液，继续培养。
细胞培养的操作步骤
细胞培养的操作步骤细胞培养是一种在体外培养和繁殖细胞的方法，广泛应用于医学、生物学和生物工程等领域。
下面是细胞培养的操作步骤，包括细胞的收获、传代和检测。
1.材料准备：- 细胞培养基：选择适合细胞类型和培养要求的培养基，常用的包括DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）和RPMI（Roswell Park Memorial Institute）等。
-细胞：选择合适的细胞系，如人类胚胎肺成纤维细胞（HELF）和小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）等。
-细胞培养器具：包括培养皿、细胞培养瓶、细胞离心管等。
2.细胞收获：-细胞培养器具消毒：用70%乙醇或其他消毒剂将培养器具进行消毒。
-细胞培养基预热：将所需的培养基预先加热至37摄氏度。
-细胞培养皿涂覆：将培养皿或瓶子内壁涂覆一层细胞黏附物，如明胶或聚-卵氨酸等，以增加细胞附着。
3.细胞传代：-培养基预热：将所需的培养基预先加热至37摄氏度。
-细胞收获：将细胞培养瓶中的培养基倒掉，用生理盐水等缓冲液洗涤细胞。
- 细胞分离：使用胰酶（Trypsin）或胰蛋白酶（Trypsin-EDTA）将细胞从细胞培养瓶上析离下来。
-细胞计数：使用显微镜和细胞计数板对细胞进行计数，以确定细胞的密度。
-细胞培养：将细胞培养在新的细胞培养瓶中，加入适量的预热培养基。
4.细胞检测：-细胞形态观察：使用倒置显微镜或显微摄像系统观察细胞的形态变化和增殖情况。
- 细胞活力检测：使用细胞活力检测试剂，如MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）或CCK-8（Cell Counting Kit-8）等，评估细胞的存活率和代谢活力。
- 细胞凋亡检测：使用凋亡检测试剂盒，如Annexin V-FITC和PI （Propidium Iodide）等，评估细胞凋亡的程度。
细胞培养详细过程及注意事项
细胞培养详细过程及注意事项细胞培养是在体外培养和维持生物细胞生长和繁殖的一种技术，它是生物学、医学研究和药物研发等领域的重要实验手段。
细胞培养的过程需要遵循一定的步骤和注意事项，以确保细胞的正常生长和繁殖。
细胞培养的详细过程如下：2.细胞分离：将组织或细胞样品分离，去除多余的组织或细胞，获得单个细胞的悬浮液。
分离的方法包括酶消化、机械或化学分离等。
3.细胞培养基准备：准备培养基，培养基的配制根据细胞的要求而定，可以是无血清培养基、低血清培养基或含血清的培养基。
培养基提供了细胞所需要的营养物质和生长因子。
4.细胞接种：将细胞悬浮液接种到含有培养基的培养皿或培养瓶中，密度通常在1×105至1×106个细胞/mL之间。
接种后，培养皿或培养瓶需放入培养箱中，设定适当的温度、湿度和气体环境。
5.细胞培养条件控制：细胞的生长和繁殖需要适宜的培养条件。
常规的培养条件包括37℃、5%CO2和95%湿度。
通过调节培养基的pH值、温度和培养箱内的CO2和湿度等参数，来维持良好的培养环境。
6.细胞观察和培养基更换：培养过程中，需要定期观察细胞的生长状态和形态，通过显微镜观察细胞的形态变化和细胞层的覆盖率等指标。
根据需要，定期更换培养基，以确保提供足够的营养物质和维持适宜的细胞密度。
7.细胞传代：当细胞达到充分生长的状态时，需要进行传代，即将细胞从当前培养皿或培养瓶中移至新的培养皿或培养瓶中，以保证细胞的健康和生长。
用一句话总结上述细胞培养的过程就是从细胞分离到细胞培养，并按照一定条件进行观察和传代。
在进行细胞培养时，需要注意以下事项：1.无菌操作：细胞培养需要在无菌条件下进行，避免细胞被异物或外源性微生物污染。
操作前，材料和设备需要进行消毒。
2.培养基筛选：根据细胞的特性和需求选择合适的培养基，确保细胞能够获得必要的营养物质和生长因子。
3.冻存细胞库：定期将细胞进行冻存，以备后续使用，以避免病毒污染或细胞失活。
细胞培养操作流程
细胞培养操作流程细胞培养是一种人工环境中扩增和维持活细胞的技术。
它对于研究细胞生物学、药物筛选和治疗等方面有着重要的应用。
下面是一个常见的细胞培养操作流程，具体步骤如下：1.准备培养器具和试剂：首先需要准备好培养器具和所需试剂，包括培养皿、离心管、培养基、培养液、胶原蛋白贴士等。
2.细胞的分离和收获：将待培养的组织或细胞样品取出，用适当的方法将细胞分离开来。
可以使用酶消化、机械切割或筛选等方法。
分离好的细胞通过离心将细胞沉淀，将上清液吸掉，得到细胞沉淀。
3.细胞计数和浓度调整：使用细胞计数仪或血球计数室等工具，将细胞计数。
根据需要可以进行浓度调整，使其适合在培养器具中的扩增。
4.细胞的接种和培养：将得到的细胞沉淀重新悬浮于培养基中，并将其放置于培养皿中。
确定适宜的培养条件，包括温度、湿度、气体环境等。
定期观察细胞的生长情况，并更换培养基，以维持细胞的健康生长。
5.细胞的传代：当细胞在培养皿中达到一定密度时，需要进行传代，以防止细胞群体过于致密导致细胞生长受限。
传代前需先将细胞沉淀，并用如十倍的细胞培养基将其重新悬浮。
将悬浮的细胞分装至新的培养皿中，培养基的更换和细胞的观察也是相同的。
6.试验处理：在细胞培养过程中，可能需要对细胞进行各种试验处理，如药物处理、感染等。
根据需要，将试验处理物加入培养基中，确保细胞接触到试剂，并保持正常生长。
7.细胞固定和染色：进行一些试验或者观察时，对细胞进行固定和染色可以帮助观察或者分析细胞的形态、细胞器分布等。
选择适合的固定和染色方法，将细胞固定在培养皿中，并使用染色剂染色。
8.细胞的收集和保存：在实验完毕后，可以用适当的方法将培养皿中的细胞收集起来。
例如，轻轻洗涤细胞，然后加入适当的缓冲液，用吸管吸出，或者使用离心机离心沉淀。
收集好的细胞可以用于下一步的实验，或者进行冷冻保存。
9.培养器具的清洁和消毒：一旦细胞收集完毕，需要对使用过的培养器具进行清洗和消毒，以防止细菌、真菌、病毒等的传播。
细胞培养操作步骤
细胞培养操作步骤细胞培养是一项用于研究和生产生物技术产品的基础技术。
以下是细胞培养的一般操作步骤：1.实验室准备：-消毒：在开始实验之前，对实验室进行消毒处理，确保实验环境的无菌。
-工具准备：准备好所有需要的培养器具，如离心管、试管、培养皿、吸管等。
-培养基准备：根据实验需要，准备好适当的培养基，并对其进行消毒处理。
2.细胞准备：-细胞收获：收获细胞，并将其转移到一个装有细胞培养基的培养皿中。
-细胞计数：使用细胞计数器或显微镜对细胞进行计数和分析，以确定细胞的浓度和活性。
-细胞传代：如果需要，将细胞进行传代以维持其活性和数量。
3.培养条件：-培养温度：根据细胞的要求，将培养皿放置在适当的温度控制设备中，通常为37℃。
-CO2浓度：对于一些细胞（如哺乳动物细胞），需要提供适当的CO2浓度来维持其生长和代谢。
-培养液更换：根据具体要求，定期更换培养液，以保持细胞的健康生长。
4.细胞培养：-培养基添加：向培养皿中加入适当量的培养基，以提供细胞生长和繁殖所需的养分。
-培养皿处理：将培养皿放入恒温培养箱中，确保细胞在适宜的环境中生长。
-细胞观察：定期使用显微镜观察细胞的生长情况和形态变化，以评估细胞的健康状态。
-培养皿除菌：如果培养皿被发现有细菌或真菌污染，需要将其除菌，以保证细胞的无菌状态。
5.细胞传递：-细胞解离：当细胞达到所需密度或需要进行分离时，使用适当的酶或溶液将细胞从培养皿中解离。
-细胞收获：通过离心，将细胞收集到离心管中，并进行计数和分析。
-细胞传递：将细胞转移到新的培养皿中，重新开始培养过程。
细胞培养是一项复杂而精细的操作，需要高度的无菌技术和细心的操作。
在整个过程中，需要持续监测和调整培养条件，以确保细胞的健康生长和繁殖。
此外，注意遵循实验室的安全规范，保护自己和实验室的安全。
细胞培养的成功与否，将直接影响到后续实验的结果和应用。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml冻存液的配置：DMS018ml+胎牛血清2ml。
依次比例酌量配置。
超净工作台常规配置移液器1套（2.5小20 d、200 pl> 1ml）,酒精灯1盏，液器1台，斜架1台，酒精喷壶 1 个，酒精棉球缸 1 个，污缸 1 个，常规耗材：培养瓶（50 cm 2）,定量移液管（5ml、10ml）,枪头（1ml、200小10 d）,培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，保种管所需试剂：gibco高糖培养基，胎牛血清，双抗，DMSO,胰酶，苯扎溴氨，75%酒精……实验前准备：所需的各项高压后的耗材放于超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯照射30min 后开始实验操作。
首次传代前细胞的复苏，首先用一大烧杯盛满37C的温水放于液氮罐旁边，待细胞株取出后留上端1/3于37C水面上尽最大速摇动管使其在2min内迅速融化。
若种管顶部含有冻存的细胞液在摇动期间用力甩动使其降于管底后再摇动。
这一过程可在超净工作台外操作。
实验步骤一、原代细胞的培养1. 紫外消毒30min 后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。
2. 将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3 次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。
特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。
3. 取1 个高压后的新培养瓶，瓶口在酒精灯上消毒2-3 次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3 次分别放于酒精灯两侧，把保种管在超净台外用酒精棉球擦拭下2/3 后拿进超净台内在酒精灯上消毒保种管口2-3次放于台面左手边，取1ml 移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2 次，然后再装上枪头吸取保种管内的细胞液，悬空移入培养瓶内。
4. 拿出1 支高压后的5ml 定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3 次，悬空进入培养基瓶内吸取4ml 培养基再悬空移入培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3 次后拧紧平放，在瓶身做好实验标记。
5. 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3 次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。
6•将培养瓶放于28C,5%CO2的培养箱内培养，旋开瓶口少许。
注意整个培养箱底托盘内一定要放高压后的水，且定期更换确保无菌。
在CO2培养箱内培养10-12h，瓶盖拧紧后拿出培养箱，置于荧光倒置显微镜下观察细胞贴壁情况，及细胞形态。
最后更换培养液。
、培养液的更换1．紫外消毒30min 后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。
2．将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3 次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。
特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧3. 将培养瓶瓶口在酒精灯上消毒2-3 次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3 次，瓶盖放于酒精灯右侧后将培养瓶内的培养液悬空倒进污缸，在酒精灯消毒2-3 次瓶口，4．拿出1 支高压后的5ml 定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3 次，悬空进入培养基瓶内吸取4ml 培养基再悬空移入培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3 次后拧紧平放。
5．将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3 次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。
6•将培养瓶放于28C,5%CO2勺培养箱内培养，旋开瓶口少许。
每天定时观察细胞生长情况，一般72-96h 后，细胞生长密度大于90%，即可进行细胞勺传代。
三、细胞传代1. 紫外消毒30min 后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者勺双手。
2. 将所需勺培养基，胰酶确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基和胰酶瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3 次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯勺两侧。
特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近勺位置，瓶盖置于酒精灯勺另一侧。
3. 将培养瓶瓶口在酒精灯上消毒2-3 次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3 次，瓶盖放于酒精灯右侧后将培养瓶内勺培养液悬空倒进污缸，在酒精灯消毒2-3 次瓶口，竖直放好。
取1ml 移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2 次，然后再装上枪头吸取 1.5ml 胰酶液，悬空移入培养瓶内。
4. 将培养瓶平放使胰酶浸没整个瓶壁的细胞层，计时约40s,立马竖起对着灯光可观察到细胞与细胞之间有针孔样缝隙，并有1-2 个细胞脱落，这时为胰酶消化的最适时机。
若看到成片的细胞从瓶壁脱落为胰酶消化过度；若看不到针孔样缝隙和细胞脱落，则需继续消化，轻轻的迅速平放培养瓶使胰酶浸没细胞层1s后迅速竖起对着灯光观察细胞情况，可反复几次，直至出现针孔样缝隙和1-2 个细胞脱落的最佳消化状态。
用移液器将胰酶吸净。
5. 吸取1ml 培养基于培养瓶内，并用移液器吸取少量的培养基轻柔的反复冲洗培养瓶壁5-8 次，使贴壁细胞完全脱落于培养基内再轻轻吹打2-3 次，使细胞尽可能处于单个悬浮状态。
6. 取2或3个高压后的新培养瓶，瓶口在酒精灯上消毒2-3 次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3 次分别放于酒精灯两侧，然后将细胞培养基均匀的分到 3 或 4个培养瓶内（注意原来传代时使用的培养瓶可继续传代使用），进行1传3或1传4的培养。
7. 拿出1支高压后的5ml 定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3 次，悬空进入培养基瓶内吸取4ml 培养基悬空移入每个培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3 次后拧紧平放，在瓶身做好实验标记。
8. 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3 次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。
9•将培养瓶放于28C,5%CO2勺培养箱内培养，旋开瓶口少许。
注意整个培养箱底托盘内一定要放高压后的水，且定期更换确保无菌。
每天定时观察细胞生长情况，一般72-96h 后，细胞生长密度大于90%，即可进行细胞勺传代或保株。
四、细胞株勺保存1. 紫外消毒30min 后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者勺双手。
2. 将所需勺培养基，胰酶确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基和胰酶瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3 次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯勺两侧。
特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近勺位置，瓶盖置于酒精灯勺另一侧。
3. 将培养瓶瓶口在酒精灯上消毒2-3 次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3 次，盖放于酒精灯右侧后将培养瓶内勺培养液悬空倒进污缸，在酒精灯消毒2-3 次瓶口，竖直放好。
取1ml 移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2 次，然后再装上枪头吸取 1.5ml 胰酶液，悬空移入培养瓶内。
4. 将培养使胰酶浸没整个瓶壁的细胞层，计时约40s,立马竖起对着灯光可观察到细胞与细胞之间有针孔样缝隙，并有1-2 个细胞脱落，这时为胰酶消化的最适时机。
若看到成片的细胞从瓶壁脱落为胰酶消化过度；若看不到针孔样缝隙和细胞脱落，则需继续消化，轻轻的迅速平放培养瓶使胰酶浸没细胞层1s 后迅速竖起对着灯光观察细胞情况，可反复几次，直至出现针孔样缝隙和1-2 个细胞脱落的最佳消化状态。
用移液器将胰酶吸净。
5. 吸取1ml 细胞冻存液于培养瓶内，并用移液器吸取少量的培养基轻柔的反复冲洗培养瓶壁5-8 次，使贴壁细胞完全脱落于培养基内再轻轻吹打2-3 次，使细胞尽可能处于单个悬浮状态。
6. 将1ml 含有细胞的冻存液移入新的保种管内，拧紧瓶盖，做好实验标记。
7. 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3 次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。
8•将保种管先放于4C冰箱30min后拿出放置-20 C冰箱过夜，次日再放于-80 C 的冰箱内3-4天，最后存放于-196 C的液氮灌内长期保存。
注此过程也可简化因实际操作过程中经验所得：步骤7 结束后将保种管用干脱脂棉包裹后胶带封好直接放于-80 C冰箱内4-5天，即可放于液氮灌保存。
但-80 C 冰箱也可保存细胞株2-3月。
五、细胞转染操作前：紫外消毒30min 后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。
1. 预混液A fugeneHD 5ul/孔+ OPTI-MEM 45ul/孑L 室温温育10min2. 预混液B arr 16ul/孔+ OPTI-MEM 34ul/孑L 室温温育5min3. 预混液C 空载16ul/孔+ OPTI-MEM 34ul/孔室温温育5min4. 预混液D arr 12ul/孔+ ops 12ul/孔+ OPTI-MEM 26ul孔室温温育5min 注：fugeneHD为转染试剂,arr，空载，ops为模板？OPTI-MEM为空培养基5•将步骤2,3,4中的预混液B,C,D中分别加入步骤1中的等体积的预混液A,轻柔混匀，室温温育15mi n,再次轻柔混匀后室温温育15mi n。
6. 取出6 孔培养板，将每培养孔的培养基全部吸净，无残留，是为了防止残留的双抗和胎牛血清影响转染效果。
加入 1.5-2.0ml/孔的OPTI-MEM到6孔培养板内，轻轻摇匀。
7•将步骤5中再次混匀温育结束的预混液B,C,D分别以100ul/孔，加入目的培养孔中（空载，目的质粒，48h 72h）,按上下，左右，斜对角的方向轻轻摇匀。
8. 28C, 5%CO培养箱孵育6-8h后。
细胞换液为完全培养基。
另外，转染试剂与质粒的比例为5ul: 2ug，此时包被效果最佳一般，细胞培养48h 收RNA，72h 收蛋白。