重组表达步骤
重组蛋白的原核表达
实验三重组蛋白的原核表达、亲和层析及免疫印迹分析一、实验内容1．重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达。
2．对重组蛋白进行亲和层析，得到纯度较高的融合蛋白。
3．对纯化结果进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测，并做蛋白质的Western blot鉴定。
二、实验目的和要求1．了解重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达的原理和实验方法。
2．掌握亲和层析基本原理和操作过程。
3．掌握蛋白质的免疫印迹分析。
三、实验操作步骤1．重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达。
①将在甘油保存的重组蛋白的表达菌株BL21（pET-IL-2）、BL21（pQE-IL-2）、BL21（pET43.1a）、Origami（pGEX-ES1）、Origami（pGEX-ES2）、Origami（pGEX-4T-1）取少量分别接种于10ml LA（LB+100mg/L的氨苄青霉素）培养基中，37℃下过夜培养。
②以1：100转接至100mL LA液体培养基中培养至OD 0.5-0.6。
加入0.5mM的IPTG诱导表达，诱导表达温度为18℃，诱导时间为9小时。
③将诱导表达的菌液于10000 rpm离心5 min，收集菌体，-20℃保存。
④将菌体细胞重悬于5mL缓冲液buffer I（20 mmoL/L Tris-HCL pH 8.0，150mmoL/L NaCl）（表达菌株BL21（pET-IL-2）、BL21（pQE-IL-2）、BL21（pET43.1a））或PBS（Origami（pGEX-ES1）、Origami（pGEX-ES2）、Origami（pGEX-4T-1））中。
⑤取0.5ml悬浮液，冰浴条件下进行超声波破菌，4℃下12000 rpm离心20 min。
分别取上清和沉淀，作SDS-PAGE检测，估计可溶性表达比例。
⑥将以上④得到的重悬液在冰浴中进行超声波破菌，4℃下12000 rpm离心20 min，其上清即为蛋白粗提液（BL21（pET-IL-2）、BL21（pET43.1a）、Origami（pGEX-ES1）、Origami（pGEX-ES2）、Origami（pGEX-4T-1））或沉淀（BL21（pQE-IL-2））。
重组dna技术的名词解释_操作步骤_产业现状
重组dna技术的名词解释_操作步骤_产业现状重组dna技术的名词解释基因工程(genetic engineering)又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。
重组dna技术的操作步骤工具(1)酶：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、(2)载体：质粒载体、噬菌体载体、Ti质粒、人工染色体1.提取目的基因获取目的基因是实施基因工程的第一步。
如植物的抗病(抗病毒抗细菌)基因，种子的贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因干扰素基因等，都是目的基因。
要从浩瀚的“基因海洋”中获得特定的目的基因，是十分不易的。
科学家们经过不懈地探索，想出了许多办法，其中主要有两条途径：一条是从供体细胞的DNA中直接分离基因;另一条是人工合成基因。
直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。
鸟枪法的具体做法是：用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞提供的DNA(即外源DNA)的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制(在遗传学中叫做扩增，如使用PCR技术)，从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有目的基因的DNA片段分离出来。
如许多抗虫抗病毒的基因都可以用上述方法获得。
用鸟枪法获得目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性。
又由于真核细胞的基因含有不表达的DNA片段，一般使用人工合成的方法。
人工合成基因的方法主要有两条。
一条途径是以目的基因转录成的信使RNA为模版，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需要的基因。
另一条途径是根据已知的蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对的原则，推测出它的基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。
重组蛋白的表达系统(详细版)
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2.1 常用酵母表达系统(宿主-载体系统)
• 3.1.1 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表 • 由达于系遗统传和生理背景清楚而且安全，酿酒酵母是
最早应用于重组蛋白表达的酵母宿主菌。
• 表达菌株：
• INVSC1是酿酒酵母表达系统的常用菌株，它是一
种双倍体营养缺陷细胞株，在缺少组氨酸、亮氨
• 强启动子中，tac和trc是lac启动子的变体， 其重组蛋白产率能够达到细胞总蛋白量的 15-30%。araBAD启动子的诱导剂是便宜无 毒的L-阿拉伯糖，本底表达量低，启动能力 比tac稍弱。T7则是目前原核表达系统中最 高效的启动子，pET表达系统即是以它为中 心构建的。T7启动子整理版来ppt 源于λ噬菌体，专一 9
• 当重组蛋白不表达时：
• 如果重组蛋白不表达（包含体和可溶蛋白
都没有），首先检查cDNA和质粒是否正确，
蛋白对宿主菌是否有很大毒性，然后尝试
更换菌株、质粒载体和融合标签。原核蛋
白在大肠杆菌中不能表达的情况很少见，
通常是真核蛋白不能表达。不能表达的重
组蛋白，即使在更换了宿主、载体后可以
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重组蛋白表达系统
• 1.原核表达系统 • 2.酵母表达系统 • 3.昆虫细胞表达系统 • 4.哺乳动物细胞表达系统 • 5.转基因植物表达系统 • 6.转基因动物表达系统 • 7.表达系统的选择
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一、 原核表达系统
• 原核表达系统发展完善、流程简单快速、 成本低、产量高，对大部分蛋白来说都值 得一试白。
• 终止子：
• 转录终止子按照是否依赖和不依赖ρ因子的 作用分为两类，这两类终止子均在终止点 前含有一段7-20bp的回文序列。终止子可以 保护mRNA在核外不被降解，显著延长 mRNA的寿命，由此提高重组蛋白的表达量。 但是对于T7系统来说，由于T7 RNA聚合酶 效率极高，宿主中随时都有充足的mRNA以 供翻译，因此大部分在T7系统中表达的重 组蛋白并不在意质粒上是否有终止子，只 有一些自身带有翻译起始信号的外源基因 需要终止子。
在大肠杆菌中表达重组蛋白的流程
在大肠杆菌中表达重组蛋白的流程
在大肠杆菌中表达重组蛋白的流程通常包括以下步骤：
1. 克隆：首先需要将目标基因克隆到适当的表达载体中。
这可以通过PCR扩增目标基因，然后将其与表达载体连接，形成重组质粒。
2. 转化：将重组质粒转化到大肠杆菌细胞中。
可以使用化学方法（如热冲击法）或电穿孔法将质粒导入细胞。
3. 选择：转化后，将细胞分散在含有适当抗生素的琼脂平板上培养。
只有带有重组质粒的细胞能够存活并形成菌落。
4. 培养：将含有重组细胞的培养液转移到适当的培养基中，并在适当的条件下培养。
这可能包括调节温度、pH值和搅拌速度等。
5. 表达：在培养期间，目标基因会被大肠杆菌细胞转录和翻译为蛋白质。
使用适当的启动子和调控序列，可实现目标蛋白的高效表达。
6. 细胞破碎：一旦细胞达到最佳表达水平，就需要破碎细胞以释放目标蛋白。
这可以通过多种方法实现，如超声波、高压破碎或化学方法。
7. 纯化：通过使用各种分离和纯化技术（如亲和层析、凝胶过滤、离子交换层析等），从细胞裂解液中纯化目标蛋白。
以上是在大肠杆菌中表达重组蛋白的一般流程。
具体的步骤和条件可能因实验设计和目标蛋白的特性而有所不同。
大肠杆菌重组蛋白表达流程
大肠杆菌重组蛋白表达流程大肠杆菌重组蛋白表达流程主要包括以下几个步骤：1. 选择合适的表达载体：通常选择含有启动子、转录终止子、选择标记和适当的表达调控元件的表达载体。
启动子用于驱动基因转录，转录终止子用于确定转录产物的结束位置，选择标记有助于筛选含有目的基因的转化子，而表达调控元件可以调节基因的表达水平。
2. 构建表达载体：将目的基因插入表达载体中，构建成重组表达载体。
在此过程中，需要考虑目的基因的orientation（方向）、阅读框（ORF）以及表达调控元件的活性等因素。
3. 转化大肠杆菌：将构建好的重组表达载体转化到大肠杆菌中。
转化方法有多种，如化学法（如CaCl2法）、电转化、热激转化等。
转化后，大肠杆菌吸收了外源DNA，成为重组菌株。
4. 筛选重组菌株：在含有选择性抗生素的培养基上培养转化后的菌落，筛选出含有目的基因的重组菌株。
此外，可以通过鉴定菌落的形态、颜色等特征进行初步筛选。
5. 诱导表达：将筛选出的重组菌株接种到含有诱导剂（如IPTG）的培养基中，诱导目的基因的表达。
诱导剂IPTG可以与表达载体中的启动子结合，增强基因转录和翻译的效率。
6. 收集和纯化重组蛋白：诱导表达后，菌体中会含有目的蛋白。
可以通过离心、破碎细胞、柱层析等方法分离和纯化重组蛋白。
常用的纯化标签有His标签、GST标签等，这些标签可以帮助分离和纯化目的蛋白。
7. 蛋白活性检测和应用：对纯化的重组蛋白进行活性检测，如酶活测定、蛋白互作实验等。
确认蛋白活性后，可应用于生物学研究、药物研发等领域。
需要注意的是，大肠杆菌重组蛋白表达过程中可能会遇到表达量低、蛋白包涵体等问题。
为了解决这些问题，可以尝试优化表达载体、改变诱导条件、使用融合标签等策略。
重组蛋白质的表达与纯化技术
重组蛋白质的表达与纯化技术蛋白质是生命体活动的重要组成部分，对于生命体的生长、繁殖和免疫功能起着至关重要的作用。
而重组蛋白质则是利用基因工程技术，将人工合成的外源基因导入到特定的宿主细胞中，通过细胞表达和纯化技术得到的转录翻译产物。
这种技术不仅可以生产天然蛋白质，还可以生产人工合成的新型蛋白质，对于疾病的治疗和新药的研发有着重要的意义。
一、蛋白质表达技术蛋白质表达是获得大量重组蛋白质的重要方法。
选择适当的宿主细胞和表达载体是获得高水平表达的关键。
常用的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。
1.大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统具有生长快、表达量高等优点，广泛应用于重组蛋白质的表达和纯化。
其表达载体主要有pET和pBAD两种，pET系统一般用于产生可以形成包涵体的重组蛋白，pBAD系统用于在分泌表达中产生滞留蛋白。
2.昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统包括SF9、Sf21、HighFive等细胞系，常用的表达载体为pIB/V5-His、pFastBac等。
昆虫细胞表达系统通常用于表达大分子蛋白质，如糖蛋白、膜蛋白等。
3.哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统是目前表达规模最大、表达产物最接近人体蛋白质的一种表达系统。
其表达载体主要有pCDNA3.1、pCI 等，常用于表达与人体有关的蛋白质，如抗体、生长因子等。
二、蛋白质纯化技术蛋白纯化是重组蛋白质生产的重要环节，其目的是得到高质量的、纯度较高的蛋白质样品。
常见的纯化方法包括亲和层析法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法、逆流式层析法等。
1.亲和层析法亲和层析法是指因与载体中固定的亲和剂相互结合而纯化目标蛋白质的一种方法。
亲和剂通常是与目标蛋白质有特异性结合作用的化合物，如亲和标签、酶底物、抗体等。
常见的亲和层析方法有亲和柱层析、亲和膜层析等。
2.离子交换层析法离子交换层析法是根据蛋白质带有正或负电荷的差异性进行分离的一种方法。
离子交换层析的柱填充物常为离子交换树脂，其一般分为阴离子交换树脂和阳离子交换树脂两种。
重组dna的技术操作流程
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重组蛋白的大量表达
一、原理
1、E . coli 表达系统
E . coli 是重要的原核表达体系。
在重组基因转化入E . coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE 以检测表达蛋白质。
2、外源基因的诱导表达
提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。
常用的有温度诱导和药物诱导。
本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达。
不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。
二、步骤
1、一活：从-80℃取菌株，50 mL LB+50 uL抗生素（pet32:AMP，pet28:Kana）+50uL菌种（根据菌活性可多加），置于恒温振荡器中（37℃，150 rpm）培养过夜（约12 小时）。
2、二活：1 L LB+1 mL抗生素+50mL菌种，于恒温振荡器上（37℃，200 rpm）培养2小时。
3、取1.5 mL诱导前菌种，标记，加1 mL IPTG至二活后的LB培养基中根据相应条件诱导表达（低温(125rpm)，高温(150rpm)，8h，12h，20h）
4、诱导后取1.5mL菌，12000rpm离心2min，弃上清，加100uL PBS（可根据情况加50uL），吹打均匀(诱导前保留的菌也同样处理)，煮样，跑电泳。
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一．CARP质粒的扩增与测序
1.CARP带有Flag标记的质粒的扩增（plasmid 载体）
试剂配置
LB培养基配方1000 ml:
胰蛋白胨TRYPTONE 10 g
酵母提取物YEAST EXTRACT 5 g
NaCl 10 g
加去离子水950 ml用5 mol/l的NaOH（200ul）调pH 到7.0,灭菌
LB固体培养基（Ampicllin抗性）200 ml
胰蛋白胨TRYPTONE 2 g
酵母提取物YEAST EXTRACT 1 g
NaCl 2 g
Agarose 琼脂粉 3 g
加去离子水180 ml用5 mol/L的NaOH（40ul）调pH 到7.0,灭菌.
等温度降至55℃左右时，按终浓度5 μg/ml(200ul)加入氨苄青霉素，混匀，倒入到灭菌的平皿中，待凝固后，倒扣于4℃冰箱中备用。
DH5α感受态细胞的制备
1、LB培养基的平皿中挑取单克隆菌体接种到5 ml液体培养基中培养过夜。
14-16h
2、稀释100倍，取0.5 ml菌液50 ml到LB培养基中，37℃振摇
3、2 h后，不断测定培养菌液的OD590值，当光吸收到达0.3－0.5时，取出菌液。
4、菌体用低温离心机2 000 rpm 4℃，10 min。
5、弃去上清，加入2ml预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；
6．4℃下3000 g冷冻离心5分钟；
7．弃去上清，加入2ml预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；
8.200ul分装保存-20摄氏度（-4摄氏度）
CARP质粒转化大肠杆菌
1、－70℃储存的DH 5α感受态菌种一支放到冰上融化，刚融未融时，加入质粒DNA 10 ng左右，冰浴30 min.
3、42℃水浴，2 min；室温，2 min
4、加上无选择性的LB培养基1 ml,37℃摇菌30 - 45 min
5、用200μl铺氨苄青霉素抗性的固体LB培养基性培养皿, 37℃过夜。
（常用的大肠杆菌有BL21和DH5a，前者是表达菌，主要用来表达蛋白，后者是克隆菌，主要用来扩增质粒）
2.将菌液送到公司测序
二．根据CARP的序列设计引物
1.设计引物（引物一端有质粒的酶切位点的基因）
①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
②产物不能形成二级结构。
③引物长度一般在15~30碱基之间。
④ G C含量在40%~60%之间。
⑤碱基要随机分布。
⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。
⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。
⑧引物5′端可以修饰。
⑨引物3′端不可修饰。
⑩引物3′端要避开密码子的第3位。
2.引物与CARP质粒在PCR后得到含有引物的DNA片段，PCR产物纯化
1. DNA模版
2．对应目的基因的特异引物
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步骤
1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer 5 μl
dNTP mix （2mM） 4 μl
引物1（10pM） 2 μl
引物2（10pM） 2 μl
Taq酶（2U/μl） 1 μl
DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl
加ddH2O至 50 μl
2．将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。
一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，最后在72℃保温7min。
3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
电泳胶回收或者试剂盒回收
PCR产物纯化
1、加5倍体积的PB
2、将Spin柱放于2ml收集管上
3、加样液，14Krpm，离心1min
4、弃去排出液
5、加0.75ml PE, 14Krpm，离心1min
6、弃去排出液,14Krpm,离心1min
7、将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中
8、往Spin柱的膜中央加入50μl的EB(或milliq H2O),静置2min, 14Krpm，离心1min
2.DNA片段插入载体，构建重组质粒
双酶切
载体和PCR产物分别用一下条件进行双酶切（反应体系均为30ul，37℃，酶切n小时）：载体10ul PCR产物20ul
10x buffer 3ul 10x buffer 3ul
100xBSA 0.3ul 100xBSA 0.3ul
酶1 1ul 酶1 1ul
酶2 1ul 酶2 1ul
H2O 14.7ul H2O 4.7ul
双酶切后的载体用试剂盒割胶回收
1.割胶并称重，加3倍体积的QG（胶块每100mg约合100μl的体积）
2.50℃，恒温10min，等到胶完全被溶解
3.将一个Spin柱放在一个2ml的收集管中
4.加样液，14Krpm，离心1min
5.弃去排出液
6.加0.75ml PE, 14Krpm，离心1min
7.弃去排出液,14Krpm,离心1min
8.将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中
9.往Spin柱的膜中央加入50μl的EB(或milliq H2O),静置2min, 14Krpm，离心1min
3.质粒转化BL-21菌中表达
连接
上述双酶切产物经过纯化（其中载体酶切产物割胶回收，PCR片段酶切后纯化步骤与上述PCR产物纯化步骤相同），在T4 DNA连接酶作用下16℃连接过夜。
连接体系如下：
载体 2ul
PCR 片段 6ul
10x酶 buffer 1ul
连接酶DNA ligase 1ul
转化
取上述连接液5μl转化到预先制备的DH5α化学感受态细胞中，冰浴30分钟，42℃热激2min,置冰上5min，加入1mlLB培养液37℃摇床45min，离心5000rpm，1-5min（不要离心太久，以免太实），最后均匀涂布在含有100 ng/ml 抗生素的LB平板上（100-150 ul）。
将平板在37℃倒置培养过夜。
挑取阳性克隆菌落转划到另一块含有100 ng/ml抗生素的LB平板上，并对之进行编号，37℃倒置培养过夜。
4.重组质粒表达产物
生出菌
枪头取菌 +10毫升培养液
摇菌13-14小时 250转 37℃
5.送到公司得单克隆抗体。