氨基酸的薄层层析剖析

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氨基酸薄层层析实验报告doc

氨基酸薄层层析实验报告篇一：生物化学实验-氨基酸分析实验报告【实验报告第一部分（预习报告内容）：①实验原理、②实验材料（包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材）、③实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项）；评分（满分30分）：XX】一、预习报告? 实验原理：根据固定相基质的形式，层析可分为纸层析、薄层层析和柱层析。

薄层层析是在玻璃或塑料等光滑表面铺一层很薄的基质进行层析。

薄层层析（thin layer chromatography，TLC）：是将吸附剂均匀地在玻璃板上铺成薄层（固定相），再把样品点在薄层板一端，再把板的这端浸入适当的溶剂（流动相）在薄层板上扩展。

并在此过程中通过吸附——解吸附——再吸附——再解吸附的反复进行，而将样品各组份分离出来。

本次实验：? 具体原理：当流动相在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。

? 吸附剂（固定相）：硅胶（C.P.）。

为使制成的薄层板不易松散，加入5%羟甲基纤维素钠（CMCNa）作黏合剂。

? 展开剂：正丁醇、冰醋酸和蒸馏水的混合液（80:10:10,V/V/V）。

? 展层-显色剂：按照10:1比例（V/V）混匀的展开剂和0.1%茚三酮溶液。

? 活化（activation）：在一定温度下，对吸附剂硅胶加热去除水分。

可使硅胶的活性提高，吸附能力加强。

? 氨基酸与茚三酮的显色反应：茚三酮水化后生成的水合茚三酮在加热时被还原，此产物与氨基酸加热分解产生的氨结合，以及另一分子水合茚三酮缩合生成紫红色化合物而使氨基酸斑点显色。

? Rf值：Rf?斑点中心到样品原点的距离对应溶剂前沿到样品原点的距离由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。

?实验材料：? 样品：1、0.01mol/L丙氨酸;2、 0.01mol/L精氨酸;3、0.01mol/L甘氨酸;4、混合氨基酸溶液。

氨基酸的薄层层析(TLC)

氨基酸的薄层层析（TLC）【实验原理】聚酰胺薄膜层析是60年代以后发展起来的一种新的层析方法，特别适用于氨基酸及其衍生物的分析。

具有灵敏度高、分辨率强、操作方便快捷等特点。

聚酰胺是一类化学纤维素原料，即锦纶（尼龙）。

由乙二酸和乙二胺聚合而成的，称锦纶66。

由于分子中含有大量的酰胺基团，故称聚酰胺。

聚酰胺薄膜是在涤纶片基上涂上一层锦纶制成的。

聚酰胺对许多极性物质有吸附作用，这是由于聚酰胺的-C=O和 -NH- 能与被分离物质的一定基团形成H键。

如酚类（黄酮类、鞣质）和酸类（氨基酸、核苷酸）能以其羟基与酰胺键的羰基形成H键。

在层析过程中，当样品随流动相通过聚酰胺薄膜时，由于聚酰胺与各极性分子产生H键吸附能力的强弱不同，从而可将样品中各成分分离。

物质分离后，层析点在图谱上的位置，即在滤纸上的移动速率，用Rf来表示。

在一定条件下，每个物质都有特定的Rf值，因此，用Rf可鉴定不同的物质。

无色物质的层析图谱可用光谱法（紫外照射）或显色法鉴定。

氨基酸层析图谱常用茚三酮作显色剂。

本实验利用单向上行层析法鉴定氨基酸。

【实验试剂和器材】(一) 试剂1. 氨基酸标准液(10mg/ml)：三种氨基酸是赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸，分别配成上述浓度的溶液。

2. 氨基酸混合液（每种氨基酸5mg/ml）3. 展层剂：正丁醇：12％氨水：95％乙醇＝13: 3: 3（V/ V）4. 0.1%茚三酮－正丁醇液。

(二) 器材聚酰胺薄膜，毛细管，层析装置，电吹风机，喷雾器，塑料手套等。

【实验方法】(一) 薄膜的剪裁取薄膜（7cm×10cm）一张，在纸的一端距边缘2cm处用铅笔轻轻划一直线，在此直线上每隔1厘米作一记号为点样处（外侧两点距边缘2c m）。

(二) 点样氨基酸的点样量以5ul为宜。

点样时，用毛细管吸取氨基酸样品，与薄膜垂直方向轻轻碰点样处，每点在纸上扩散的直径最大不超过2mm。

点样过程中，必须在第一点样品干后再点第二滴。

《氨基酸的薄层层析》课件

薄层板的制备
薄层板选择
选择适合氨基酸分离的薄层板，如硅胶板、氧化铝板等。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ薄层板的活化
对薄层板进行活化处理，使其表面具有较好的吸附性能。
点样
点样工具选择
选择适当的点样工具，如微量注射器或点样模板。
点样位置和量
在薄层板上标记点样位置，并控制点样量，以便于后续的展开和分离。
展开
展开溶剂选择
选择适合氨基酸分离的展开溶剂，确保能够将氨基酸充分展开。
氨基酸的鉴定
斑点颜色
不同氨基酸在薄层层析后呈现不同的颜色，可初步判断氨基酸的种类。
斑点Rf值
不同氨基酸在薄层层析后的迁移率不同，得到的 Rf值也不同，可用来鉴定氨基酸的种类。
斑点质谱分析
对薄层层析后的斑点进行质谱分析，可确定氨基酸的分子量和结构，进一步确定氨基酸的种类。
定量分析
斑点面积法
通过测量薄层层析后斑点的面积，计算斑点中氨基酸的含量。该方法简单易行，但误差较大。
在生物科学研究中的应用
氨基酸薄层层析在生物科学研究中常用于分离和鉴定蛋白质和多肽，是研究蛋白质组学和生物大分子相互作用的重要手段之一。
通过氨基酸薄层层析技术，可以分离出不同蛋白质组分，进一步进行质谱分析和功能研究，有助于深入了解生物体内蛋白质的种类、结构和功能。
在医学和临床诊断中的应用
分离效果的评价
分离度
层析后各氨基酸斑点的清晰度和分离度，可用分离度数值表示。分离度数值越大，分离效果越好
。
分辨率
层析后各氨基酸斑点间的距离和清晰度，分辨率越高，分离效果越好。
重复性
层析实验的重复性，包括多次层析结果的重复性和同一份样品多次层析结果的重复性。重复性越好，分离效果越稳定。

氨基酸纸层析法

氨基酸纸层析法氨基酸纸层析法（paper chromatography of amino acids）是一种常用的分离和鉴定氨基酸的方法。

本文将详细介绍氨基酸纸层析法的原理、步骤、实验条件和数据处理方法等内容，以帮助读者更好地了解并应用这一实验技术。

一、氨基酸纸层析法的原理氨基酸纸层析法是利用氨基酸在纸上的分布系数和溶剂的渗透速度差异进行分离的方法。

其原理是在一根滤纸条上画上水平的线，将待测的氨基酸溶液直接点于纸条上，待溶液中的氨基酸离子在滤纸上沿渗透液前进，不同氨基酸在滤纸上的迁移速度不同，从而实现氨基酸的分离和测定。

二、氨基酸纸层析法的步骤1. 实验前准备（1）准备氨基酸样品，将其溶解在适当的溶剂中，并使用pH 计调节至适当的酸碱度。

（2）准备滤纸条，按照实验需要确定滤纸的宽度和长度。

（3）准备层析槽，将槽中的溶剂预先与上盖采光纸取代，避免有光照射到。

2. 进行层析实验（1）在滤纸条上绘制水平基线，并将标记的点分开，便于后续氨基酸的测定。

（2）将氨基酸溶液直接点于滤纸条上，点的位置要尽量靠近基线，以避免扩散的影响。

（3）将纸条的一端浸入含有适当溶剂的层析槽中，保持溶剂的面平稳。

（4）待溶液中的氨基酸在滤纸上渗透，不同氨基酸迁移的距离不同，最终在纸条上形成清晰的色斑。

（5）将纸条取出，用热风干燥，然后在紫外灯下进行观察和记录。

3. 数据处理将滤纸上的色斑分别用铅笔勾画出来，并测量它们与基线之间的距离。

然后，根据距离之间的比例关系来计算氨基酸在纸上的迁移速度，并与标准曲线进行比较，从而得出待测氨基酸的浓度。

三、氨基酸纸层析法的实验条件1. 溶剂体系常用的溶剂体系有正丙醇/ 乙酸/水 = 4:1:5、正丙醇/氨水/水 = 70:2:25等，需要根据实验需要确定溶剂的组成和比例。

2. 滤纸条的准备常用的滤纸有菱形滤纸和圆形滤纸，需要根据所需分离的氨基酸种类和数量决定滤纸的大小。

3. 实验条件实验应在干燥、通风的环境中进行，避免光照和温度过高。

氨基酸的薄层层析_实验报告

生物化学实验报告姓名:学号:专业年级:组别: 第四实验室生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称氨基酸得薄层层析实验日期2015-11-09 实验地点第四实验室合作者指导老师评分教师签名批改日期一、实验目得1.掌握薄层层析法得一般原理。

2.掌握氨基酸薄层层析法得基本操作技术,包括制板、点样、层析、显色。

3.掌握如何根据样品得移动速率(Rf值)来鉴定被分离得物质(本实验中即氨基酸混合液)。

二、实验原理1.薄层层析法:本实验将硅胶作为固相支持物,羧甲基纤维素钠作为黏合剂,两者得混合物作为固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。

当液相展开溶剂在固定相上流动时,由于吸附剂对不同氨基酸得吸附力不一样、不同氨基酸在展开溶剂中得溶解度不一样,点在薄板上得混合氨基酸样品随着展开剂得移动速率也不同,通过吸附-解吸-再吸附-再解吸得反复进行,混合液中得氨基酸可以彼此分开。

2.硅胶吸附薄层层析得特点:层析用硅胶就是一种多孔性物质,它得硅氧环交链结构表面上密布极性硅醇基(－Si－OH),这种极性得硅醇基能与许多化合物形成氢键而产生吸附。

硅胶得吸附能力比氧化铝稍弱,其吸附活性也与含水量呈负性相关,故涂布操作前必须保证平板足够干燥。

硅醇基显较弱得酸性,因而,硅胶只能用于中性、或酸性成分得分离,碱性成分不能用它分离,故混合氨基酸样品中得氨基酸组分均为中性或酸性氨基酸。

硅胶得活化温度通常为105℃－110℃,不能过高,故活化过程中得烘干温度控制在70℃左右。

3.氨基酸得显色反应:茚三酮水化后生成水化茚三酮,它与氨基酸得羧基反应生成还原茚三酮、氨基醛,与此同时,还原茚三酮又与氨基茚三酮缩合生成紫红色化合物而使氨基酸斑点显色。

(氨基酸显色反应得化学方程式参见下图)4. Rf值鉴定混合氨基酸中含得氨基酸种类:层析中,物质沿溶剂运动方向迁移得距离与溶液前沿得距离之比为Rf值。

由于物质在一定溶剂中得分配系数就是一定得,故移动速率(Rf值)也就是恒定得,因此可以根据Rf值来鉴定被分离得物质。

氨基酸的薄层层析实验

实验十二氨基酸的薄层层析
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氨基酸的薄层层析
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一、实验目的
掌握氨基酸的薄层层析的方法和原理，学会分析未知样品的氨基酸成分。
二、原理
滤纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析，滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。有机相流经固定相支持物时，与固定相之间连续抽提，使物质在两相间不断分配而得到分离。溶质在滤纸上的移动速度用Rf值表示：
1、如何用纸层析法对氨基酸进行定性和定量的测定？
2、纸层析和柱层析、薄层层析、高效液相层析
各有什么特点？
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氨基酸的薄层层析
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显色
喷雾器均匀喷上茚三酮溶液，电吹风热风吹干至看到AA彩色斑点。用铅笔将图谱上的斑点圈出，测Rf相关值。
氨基酸的薄层层析
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五、注意事项
1. 为了防止滤纸被手上的汗液污染，应尽量在操作时带手套。
2. 重复点样时可用吹风机的冷风吹干样品，喷了茚三酮后的显色则要用热风吹干滤纸。
六、思考题
四、操作步骤
如下页所示。
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氨基酸的薄层层析
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操作流程：
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点样
滤纸一边1.5厘米处划线，在线上等距离划6个点毛细管吸样品（约2cm高）点样，直径小于0.5cm，电吹风吹干，重复一次。干燥后将滤纸卷成圆形，缝合滤纸，注意两边缘不能接触。
层析
酸层析液放入培养皿中，将滤纸垂直放置在培养皿中，盖紧缸盖。层析纸2/3-3/4处取出滤纸，电吹风吹干，划前沿线。
原点到层析斑点中心的距离

氨基酸的薄层层析

氨基酸的薄层层析[原理]氨基酸薄层层析属于吸附层析，主要根据各种氨基酸在吸附剂表面的吸附能力不同进行分离或提纯的一种方法。

将硅胶（吸附剂—作为固定相的支持剂）均匀地铺在玻璃片上，并将氨基酸样品点于吸附剂上。

在密闭容器中，由于吸附剂的毛细管作用使展开剂上行将样品展开。

被分离的氨基酸因结构不同，在吸附剂上的吸附亲和力也不同。

吸附力大的就容易被吸附剂吸附，而较难被溶剂所冲洗（即解吸）；吸附力小的就容易被溶剂携带至较远的距离。

氨基酸在吸附剂和展开剂之间反复多次的进行吸附和解吸附，从而使不同的氨基酸达到分离的目的。

[试剂]（一）硅胶G（二）0.2%羧甲基纤维素钠称取羧甲基纤维素钠1g溶于蒸馏水100 ml中，在沸水浴中煮沸至无气泡，冷却，置冰箱储存，临用前稀释至0.2%。

（二）氨基酸溶液制备下列各氨基酸的异丙醇（90%）溶液各10ml。

1．0.01mol/L精氨酸精氨酸15.9mg溶于90%异丙醇10ml中。

2．0.01mol/L甘氨酸甘氨酸7.5mg溶于90%异丙醇10ml中。

3．0.01mol/L酪氨酸酪氨酸18.1mg溶于90%异丙醇10ml中。

将上述溶液各取出1ml，混合均匀作为氨基酸混合溶液。

（三）展开剂按4：1：1体积比例混合正丁醇，冰乙酸及水。

临用时配置。

（四）0.5%茚三酮丙酮溶液茚三酮0.5g溶于无水丙酮100ml中。

[主要器材]（一）玻璃板（4×10cm）（二）层析缸。

（三）喷雾器。

（四）长颈漏斗。

（五）玻璃毛细管。

（六）恒温干燥箱。

[操作步骤]（一）薄板的制备1．称取硅胶G 0.5g放入研钵中，加1.5ml0.2%羧甲基纤维素钠，研磨成均匀的稀糊状。

2．将上述糊状物倾倒在4×10cm的玻璃片（图11）上，使之均匀地布满于玻片，将玻片轻轻地晃动，使硅胶G均匀分布，表面平坦，光滑，无水层及气泡，然后水平放置在空气中使其自然干燥。

1．薄板上硅胶干后，放入105℃的恒温干燥箱内活化，半小时后取出，晾凉备用。

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Mix
生物化学与分子生物学实验教学中心
结果计算
斑点至原点距离
Rf = 溶剂前缘至原点距离
小心量出斑点中心至原点中心距离，再量出原点中心至溶剂前沿的距离，计算出它们的Ｒｆ值。根据Ｒｆ值，鉴定出混合样品中氨基酸的种类，并绘出层析图谱。
09年秋季学期生物化学与分子生物学实验教学中心
The scan of TLC plate (silica gel G) with 10 essential oils(精油）
09年秋季学期生物化学与分子生物学实验教学中心
实验材料

吸附剂：硅胶粘合剂： 0.5%的羧甲基纤维素钠氨基酸的异丙醇溶液丙氨酸、精氨酸、甘氨酸展开-显色剂（正丁醇、乙酸、茚三酮溶液）分析样品：氨基酸混合液
09年秋季学期
生物化学与分子生物学实验教学中心
器材

层析板、尺子、铅笔烧杯、量筒喷雾器、吹风机毛细管、层析缸药匙烘烤箱
09年秋季学期
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操作步骤—
点样
1、位置：用铅笔距底边 2cm水平线上均匀确定4个点。每个样品间相距1cm。 2、用毛细管分别吸取氨基酸溶液，轻轻接触薄层表面点样。 3、加样后原点扩散直径不超过2mm。 4、待点样点干后再重复点一次。
09年秋季学期
2cm
Ala Arg Gly Mix

硅胶的吸附力与含水量的问题
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
吸附实验中吸附剂的选择根据
氨基酸纸层析，两者有何区别

09年秋季学期
生物化学与分子生物学实验教学中心
生物化学与分子生物学实验教学中心
09年秋季学期生物化学与分子生物学实验教学中心
注意事项
1.切勿用手直接接触薄层板面。 2.如果样品液太稀，需要重复点样时，点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴。 3.样品量太少，有的成分不易显示；样品量太多，易造成斑点过大，互相交叉或拖尾。
09年秋季学期
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复习思考题
如何分离鉴定氨基酸混合液？
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氨基酸的薄层层析
(Thin layer chromatography of amino acids)
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实验目的

掌握薄层层析法的一般原理。掌握氨基酸薄层层析法的基本操作技术。掌握如何根据移动速率（Rf值）来鉴定被分离的物质（即氨基酸混合液）。
09年秋季学期生物化学与分子生物学实验教学中心
层析法的分类

气相层析（以气体为流动相的层析法）液相层析（以液体为流动相的层析法，此为生物化学领域里常用的方法） 1.吸附层析：薄层吸附层析、吸附柱层析 2.分配层析：纸层析、柱层析、薄层层析 3.离子交换层析 4.凝胶层析：柱层析、薄膜层析 5.亲和层析
09年秋季学期
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实验原理
2. 氨基酸与茚三酮的显色反应茚三酮水化后生成的水合茚三酮在加热时被还原，此产物与氨基酸加热分解产生的
氨结合，以及另一分子水合茚三酮缩合生成
蓝紫色化合物而使氨基酸斑点显色。
09年秋季学期
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茚三酮
水合茚三酮
Ninhydrin (2,2-Dihydroxyindane1,3-dione)
09年秋季学期生物化学与分子生物学实验教学中心
实验原理
1.薄层层析法是色谱分析技术的一种
一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。（即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开来）
1cm
生物化学与分子生物学实验教学中心
操作步骤—
展层、显色
将薄层板点样端浸入展层-显色剂，展层-显色剂液面应低于点样线。盖好层析缸盖，上行展层。当展层剂前沿离薄板顶端2cm时，停止展层，取出薄板，用铅笔描出溶剂前沿界线，用热风吹干或在85℃下烘干，即可显出各层斑点。
09年秋季学期
Ala Arg Gly
09年秋季学期
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操作步骤—
薄层板的制备
1、调浆称取硅胶3克，加0.5%的羧甲基纤维素钠8毫升，调成均匀的糊状。
2、涂布取洁净的干燥玻璃板均匀涂层。
3、干燥将玻璃板水平放置，室温下自然凉干。 4、活化 70℃烘干30分钟。切断电源，待玻璃板面温度下降至不烫手时取出。
09年秋季学期
生物化学与分子生物学实验教学中心
层析技术

概念：是利用化合物中各组分的物理性质的差别（如溶解度、吸附能力、分子形状和大小、分子极性等）使各组分在两相中的分布不同，从而使各组分以不同速度随流动相向前移动而达到分离的目的。特点：分离效率高，能分离各种性质相类似的物质。不仅可用于少量物质的分离纯分，也可用于大量物质的分离纯化和制备。
09年秋季学期
生物化学与分子生物学实验教学中心
茚三酮反应（ninhydrin reaction)
09年秋季学期生物化学与分子生物学实验教学中心
实验原理
3.混合氨基酸被分离后在薄层层析图谱上的位置用相对迁移率—Rf值（rate of flow）来表示。层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为Rf值。由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。