细胞工程实验方案设计
细胞工程的方案设计
细胞工程的方案设计一、研究目的和意义细胞工程的研究目的在于通过对细胞进行改造和调控，来实现对生物体的有针对性的改良和应用。
其意义在于扩大了人类对生命的控制能力，可以满足社会的需求，提高生活质量和增加生产力。
二、研究对象和方法我们选取哺乳动物细胞作为研究对象，通过基因编辑技术、代谢调控技术、信号传导调控技术等手段，来进行细胞工程的研究。
具体方法包括：1. 基因编辑技术：利用CRISPR/Cas9技术，对细胞内的基因进行改造，增强或者减弱其功能。
2. 代谢调控技术：通过调节细胞内代谢通路的活性，来增加特定产物的产量或者减少无关产物的产生。
3. 信号传导调控技术：通过调控细胞内的信号传导通路，来控制细胞的生长、分化和凋亡等过程。
三、研究内容和重点1. 细胞的基因改造：选择目标基因，设计合适的CRISPR/Cas9靶点，进行基因敲入或敲除，来增强或减弱目标基因的功能。
2. 代谢通路的调控：选择特定的代谢通路，通过调控酶的活性或者信号分子的浓度，来调控产物的合成。
3. 信号传导通路的调控：选择目标信号传导通路，寻找特定的激活子或者抑制子，来控制细胞的生理过程。
四、预期成果和应用前景1. 通过细胞工程的研究，我们可以获得具有特定功能的细胞系，用于生物医学研究、新药发现等领域。
2. 细胞工程的技术也可以应用于农业领域，用来改良植物细胞的功能，提高作物的产量和抗逆能力。
3. 同时，细胞工程的技术也可以应用于环保领域，利用细胞去除有害物质，净化环境。
4. 此外，还可以将细胞工程的技术应用于食品和生物能源领域，来生产更加健康和环保的食品和能源产品。
五、研究计划和进度安排1. 首先，我们将对细胞内的基因进行筛选和设计，确定需要改造的基因目标。
2. 其次，我们将利用CRISPR/Cas9技术，对细胞进行基因编辑，获得目标基因突变的细胞系。
3. 然后，我们将利用代谢通路的调控技术，来调控产物的合成，获得具有特定代谢特性的细胞系。
动物细胞工程设计方案模板
动物细胞工程设计方案一、项目名称：____________________二、项目背景：____________________三、项目目标：____________________四、实验材料：1. 动物细胞：____________________2. 试剂：____________________3. 仪器设备：____________________五、实验方法与步骤：1. 动物细胞的培养：（1）取动物组织，剪碎并加入胰蛋白酶分解成单个细胞。
（2）制备动物细胞培养液体培养基，将细胞接种至培养基，放入二氧化碳培养箱中进行初代培养。
（3）当细胞增殖达到一定程度，出现接触抑制现象时，用胰蛋白酶再次处理，并用细胞悬液吹打贴壁生长的细胞。
进行细胞计数。
（4）依照计数结果，分瓶培养，进行传代培养。
获得细胞系或细胞株。
2. 动物细胞融合：（1）选择适当的融合方法，如电融合、聚乙二醇诱导融合等。
（2）将目的细胞和辅助细胞进行融合实验。
（3）筛选融合细胞，并进行鉴定。
3. 动物细胞核移植：（1）取成熟雄性青蛙的体细胞，去除细胞核。
（2）将正常雄性青蛙的体细胞的细胞核移植到去核卵细胞中。
（3）将移植后的卵细胞培养至胚胎阶段。
（4）将胚胎移植到受体青蛙中，观察发育情况。
六、预期结果：1. 成功培养出所需的动物细胞株。
2. 实现动物细胞融合，获得具有特定性状的融合细胞。
3. 成功进行动物细胞核移植，获得具有全能性的核移植胚胎。
七、实验结果分析与讨论：1. 分析培养出的动物细胞株的特性，与预期目标进行对比。
2. 分析融合细胞的性状，探讨融合效率和稳定性。
3. 分析核移植胚胎的发育情况，探讨细胞核全能性的实现程度。
八、实验结论：1. 成功实现了动物细胞工程的实验目标。
2. 掌握了动物细胞培养、融合和核移植的基本技术。
3. 为后续相关研究提供了实验基础和参考。
九、实验注意事项：1. 严格遵守无菌操作原则，确保实验材料的纯净度。
细胞工程实验室设计方案
细胞工程实验室设计方案一、实验室概况细胞工程实验室是一个为细胞工程学科研究提供实验条件和设备的实验场所，主要用于细胞培养、基因编辑、转基因技术、细胞分离和分析等方面的实验研究。
实验室需要具备一定的生物安全性和实验条件，以满足相关研究需求。
二、实验室位置及面积细胞工程实验室位于学校科研楼内，总面积约为200平方米。
实验室需满足相关实验条件和生物安全标准，同时也需要考虑实验人员的日常工作环境和设备摆放等问题。
三、实验室布局设计1. 参考实验室布局示意图，将实验室空间划分为生物安全工作区、细胞培养区、基因编辑区、转基因区、细胞分析区、储存区等。
2. 生物安全工作区包括洗手间、更衣室、生物废弃物处理室等，需按照相关生物安全标准设置设施，确保实验人员和实验物质的安全。
四、实验室设备配置1. 细胞培养区设备：细胞培养箱、显微镜、离心机、共聚焦显微镜、显微切片机等。
2. 基因编辑区设备：CRISPR/Cas9系统、质粒转染仪、PCR扩增仪、电泳仪等。
3. 转基因区设备：质粒提取仪、基因枪、筛选培养箱、PCR仪等。
4. 细胞分析区设备：流式细胞仪、质谱仪、光学密度计、荧光显微镜等。
5. 储存区设备：液氮罐、冷冻离心机、冷冻箱等。
五、实验室常规操作规程1. 实验室进出口需安装生物安全门，实验室内部设施需按照生物安全等级标准进行装修和布局。
2. 实验室内部分区划分明确，不同区域的实验操作需符合相应区域的要求。
3. 实验室人员需进行生物安全操作培训和许可，使用实验设备前需进行操作规程的学习和考证。
4. 实验室设备需定期维护、清洁和标定，确保设备的正常运行和使用。
5. 实验室内部生物废弃物需按照相关规定进行分类和处理，确保安全卫生。
六、实验室安全管理1. 实验室内部设置摄像头，监控实验操作过程，防止实验事故和失窃事件。
2. 定期进行实验室安全检查和隐患排查，对可能存在的安全隐患进行改进和整改。
3. 实验室内设置应急救援设施和应急预案，保障实验人员和实验物质的安全。
《细胞工程》实验教学(及含实验学分课程)大纲
《细胞工程》实验教学（及含实验学分课程）大纲《细胞工程》实验教学（及含实验学分课程）大纲一、课程基本情况课程编号：137B09G 学分：1 周学时：4 总学时：34 开课学期：3.1 开课学院：海洋学院课程英文名称：Experiment of cell Engineering 适用专业：海洋资源环境课程类别：专业方向模块课课程修读条件：生物化学、普通生物学网络课程地址: 无课程负责人：所属基层学术组织：生物与海洋科学系二、课程简介细胞工程学是应用细胞生物学、遗传学、分子生物学等的原理与方法，在细胞水平上研究改造生物遗传特性等，以获得具有目标性状的细胞系或生物体的有关理论和技术的学科。
它是一门现代生物科学理论和工程技术相结合的综合性学科，是现代生物技术的重要组成部分，同时也是现代生物学研究的重要技术工具。
通过学习具体实验原理及操作，提高学生思考问题及动手的能力，为后续的实验学习及科学研究打下坚实的基础。
三、教学目标、任务该课程主要是巩固理论课学习的一些相关理论，提高学生的实际动手和操作能力，来更好的理解理论课学习的内容，培养学生的综合素质和逻辑思维能力，通过该门课程的学习，学生应该掌握实验仪器的使用，理论联系实际，更好的掌握理论课的相关知识，有能够综合运用理论知识来进行试验的综合设计的能四、教学方法与基本要求实验以操作为主，多媒体辅助教学和网络教学为辅。
学生实验前需预习实验指导书，在教师的指导下独立完成实验。
通过本实验课程培养学生动手能力，掌握最基本的操作技能。
五、主要内容及学时分配序号实验项目名称实验类型 (或上机类型) 实验类别时数每组人数 1 烟草愈伤组织诱导培养基的配置验证专业基础 3 2 2 烟草外植体的接种验证专业基础 3 4 3 观察愈伤组织的生长情况并补培养基配置和接种验证专业基础 3 4 4 烟草愈伤组织的继代及培养验证专业基础 3 4 5 烟草细胞培养设计专业基础 6 4 6 小鼠皮肤细胞的分离与接种培养综合设计专业基础 6 4 7 小鼠皮肤细胞的传代培养综合专业基础 6 4 8 生产转基因动物综合技术体系的方案设计综合演示专业基础 4 4 注：1.实验类型：演示、验证、操作、综合、设计、研究；上机类型：单项训练、综合训练。
细胞工程实验
实验一细胞工程实验室、器皿的洗涤与灭菌一、目的要求通过实验，培养学生良好的卫生习惯、树立组织培养的无菌意识；掌握组织培养实验室器皿的洗涤与灭菌方法。
二、材料与用具2%新洁尔灭、高锰酸钾、甲醛、70%酒精、洗涤剂、喷雾器、各种培养器皿、工作服、口罩和手套等。
三、方法步骤1、地面、墙壁和工作台的灭菌将配好的2%新洁尔灭溶液倒人喷雾器中，对地面、墙壁、角落均匀地喷务。
在喷房顶时间，注意不要让药液滴入眼睛。
2、无菌室和培养室的灭菌首先将房子关闭，然后用10ml甲醛和5g高锰酸钾的配比液进行熏蒸。
操作时要戴好口罩和手套，用甲醛与高锰酸钾配比时要注意避开烟雾。
3、培养器皿的洗涤与灭菌将培养器皿先用肥皂水或洗衣粉浸泡几小时，然后用清水冲洗，最后用三级水和一级水各冲3遍，烘干后备用。
四、实验报告1、将本次实验内容整理成实验报告2、简述组织培养实验室的灭菌过程与注意事项。
实验二:细胞培养基的配制及灭菌一、目的要求：1．了解基本设备以及有关仪器的用途与功能。
2．通过实际操作，学会洗涤剂的配制和各种器皿的清洗和灭菌方法。
3．通过掌握培养基对母液制备及常用培养基的配制和灭菌方法，为植物组织培养准备合适的营养条件。
4．每四人一组，每人接种一个三角瓶，2支试管；每两组制备一套培养基母液。
二、材料用具：每组所需器皿：50ml三角瓶×8 ；试管×16试剂瓶×5（200ml、2×1000ml、100ml、500ml）容量瓶烧杯量筒漏斗玻璃棒移液管pH试纸称量纸封口膜橡皮筋标签纸记号笔所需仪器：高压灭菌锅、烘箱、超净工作台、百分之一与万分之一天平、电炉、冰箱、所需药品：重铬酸钾、浓硫酸等、CaCl2·2H2O，KNO3，MgSO4·7H2O，NH4NO3，KH2PO4，Na2—EDTA，FeSO4·7H2O，MgSO4·4H2O，Zn SO4·7H2O，H3BO3，KI，NaMoO4·2H2O，CuSO4·5H2O，CoCl2·6H2O，甘氨酸，盐酸硫胺素，盐酸吡哆醇，烟酸，肌醇，蔗糖，琼脂，HCL,NaOH,酒精。
《细胞工程》实验指导书
实验指导书课程：细胞工程授课专业：生物工程、生物技术主编：徐艳实验一实验室的概况与培养基母液的配制一、实验目的：熟悉植物细胞工程实验室的基本结构、必须的基本设备及其用途与作用方法，掌握配制培养基母液的基本技能。
二、材料与用具：1、药品：生长调节类物质、无机盐类、有机化合物等。
2、用具：分析天平、移液管、量筒、培养瓶、烧杯、冰箱、母液瓶等。
三、教学时数：4课时。
四、实验内容：（一）实验室的基本结构及主要设备：1、洗涤室：水槽、工作台、蒸馏水器等功能：器皿及材料洗涤；蒸馏水制备。
2、消毒室：高压蒸汽灭菌锅、烘箱等功能：器皿的干燥；器皿及培养基的消毒。
3、试剂室：试剂柜、冰箱功能：存放试剂及器皿。
4、准备室：工作台、天平、水浴锅、电炉、显微镜及各种玻璃仪器、金属仪器等功能：培养基药品称量、配制、分装、灭菌；材料预处理；培养材料的观察分析。
5、接种室（含缓冲室）：超净工作台、接种箱等功能：无菌操作。
6、培养室：培养架、摇床等功能：培养物的控制培养。
7、驯化移栽室：如温室、大棚等功能：试管苗的驯化移栽。
（二）培养基母液的配制：1、MS基本培养基母液：各成分单独称量、单独溶解后混合定容①大量元素母液：10倍，1L注意：CaCl2.2H2O易与其他成分反应产生沉淀；②微量元素母液：100倍，0.5L③铁盐母液：100倍，0.5L注意：两者等体积溶解后混合，且需80℃水浴1h充分螯合，等待冷却后定容；④有机母液：100倍，0.5L2、激素类母液的配制：①1mg/ml的6－BA 50ml：先用0.1mol∕L的 HCL或NaOH溶解后再加水定容；②0.1mg/ml的NAA 50ml：先用少量0.1mol∕L的NaOH溶解后再加水定容。
注：精度要求精确到小数点后三位。
（三）培养器皿的洗涤：1、对污染的培养器皿先进行消毒灭菌处理；2、清除残渣，用清水洗净，浸泡于合成洗涤剂中6-24小时；3、用洗涤刷洗涤，并用自来水冲洗干净；4、用烘箱烘干或晾干，存放于防尘橱内备用。
细胞工程实验室建设方案与要求
细胞工程实验室建设方案与要求在细胞工程实验室中, 细胞实验室区别于其他实验室的规划建设要求, 主要在于要求保持无菌操作, 避免微生物即其他有害因素的影响。
接下来就由未名雷蒙特实验室设计公司的小编来讲一下细胞工程实验室建设方案与要求。
一、细胞工程实验室建设要求1.所有实验室的设计必须要完全的符合ISO、GB标准。
2.各实验室的相对温度为设定值±0.1℃～±1℃, 湿度为设定值±(1～2)%, 风速0.25m/s。
二、细胞工程实验室建筑要求1.实验室的门窗数量需要尽量减少, 还务必要做好至关重要的保温措施。
2.建筑物层高应在2.8m以上(主要是指其梁下净空高度)。
建筑物的周围是无震动、强磁场以及热源、异味和污染等。
3.实验室内的净空高度为2.5～2.85m,送风方式一般采用为孔板式, 上送风, 下回风。
三、细胞工程实验室功能区布置无菌操作区无菌操作区只限于细胞培养及其他无菌操作的区域, 主要要与外界隔绝。
理想的无菌操作室应划为三部分:1.更衣室: 供更换衣服、鞋子及穿戴帽子和口罩。
2.缓冲间: 位于更衣间与操作间之间, 目的是为了保证操作间的无菌环境, 同时可放置恒温培养箱及某些必需的小型仪器。
3.无菌操作间: 专用于无菌操作、细胞培养。
其大小要适当, 且其顶部不宜过高（不超过2.5m）以保证紫外线的有效灭菌效果；墙壁光滑无死角以便清洁和消毒。
工作台安置不应靠墙壁, 台面要光滑压塑作表面, 漆成白色或灰色以利于解剖组织及酚红显示pH的观察。
净化工作台: 操作简单, 安装方便, 占用空间小且净化效果很好。
一般细菌培养室使用的净化工作台主要有两种:a)侧流式或称垂直式b)外流式或称水平层流式。
4.孵育区本区对无菌的要求虽不比无菌区严格, 但仍需清洁无尘, 因此也应设置在干扰少而非来往穿行的区域。
孵育可在孵箱或可控制温度的温室中进行, 后者费用高, 一般实验室多采用孵箱进行工作。
细胞工程工作方案
细胞工程工作方案一、综述细胞工程是人类对生物细胞进行改造和调控的一种途径，它涉及细胞的遗传工程、代谢工程、信号转导工程、蛋白质工程等多个方面。
其应用范围广泛，包括但不限于制药工业、生物能源与环境保护等领域。
二、研究目的本研究拟以细胞工程技术为手段，旨在解决生物能源领域中的核心问题，具体包括：1. 利用细胞工程技术提高生物能源的生产效率；2. 利用细胞工程技术解决生物能源生产过程中的废弃物处理问题；3. 利用细胞工程技术开发新型生物能源生产工艺。
三、研究内容为实现研究目的，本研究将开展以下工作：1. 研究细胞工程技术在生物能源生产中的应用潜力，包括利用代谢工程手段提高生物质降解产物的生产效率；2. 开展基因编辑技术在微生物中的应用研究，以期望实现对生物降解微生物的遗传改造；3. 筛选和改良生物能源产业链中的重要微生物菌株，提高其生产能力及稳定性；4. 探索并优化新型生物能源生产工艺，包括利用特定菌株和酶的协同作用提高生物质降解效率；5. 研究细胞工程技术在废弃物降解和生物能源生产中的综合应用。
四、研究方法1. 采用代谢工程技术对生物降解微生物进行遗传改造，提高其降解效率和选择性；2. 利用基因编辑技术（CRISPR/Cas9等）对微生物菌株进行基因的精准修饰，使其适应特定的生产环境；3. 采用系统生物学的方法和生物信息学分析工具，研究并优化微生物菌株的代谢途径；4. 通过分子生物学和生物化学手段筛选并改良具有生物降解功能的酶，并进一步构建工程菌株；5. 利用微生物发酵技术和生物反应器对新型生物能源生产工艺进行优化和扩大应用。
五、研究方案的预期成果1. 已有工程菌株代谢途径的合成和调控技术；2. 具有高效降解性能的工程微生物菌株；3. 新型生物能源生产工艺的优化方案。
六、研究预期影响本研究的成果将为生物能源领域提供新的技术支持，提高生物能源的生产效率，降低生产成本，促进可持续发展。
综上所述，本工作方案将以现代生物技术手段为基础，通过对细胞工程技术在生物能源生产中的应用研究，期望为我国生物能源产业的发展提供技术支持。
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目录一、基本原理（一）基本概念（二）细胞冻存及复苏原理二、操作器材、设备及灭菌处理（一）准备室的设备（二）配液室的设备（三）培养室的设备（四）细胞培养用液的配制器材与试剂（五）灭菌操作三、基本用液的配置（一）水的制备（二）PBS的制备与消毒（三）胰蛋白酶溶液的配制与消毒（四）血清的灭活四、实验步骤（一）传代前准备工作（二）取材（三）原代培养（四）传代培养（五）细胞纯化（六）细胞系的建立（七）细胞冻存（八）冻存细胞的复苏五、实验记录及基本注意事项（一）基本注意事项（二）实验记录小鼠肝脏上皮细胞系的建立动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的中，让这些和增殖。
这个实验方案就是选取小鼠肝脏上皮利用动物细胞培养技术建立细胞系。
一、基本原理（一）基本概念1、原代培养（primary culture）直接从有机体中取出的细胞、组织或器官开始进行体外培养直到第一次传代为止。
这种培养称之为原代培养。
2、传代培养（subculture）细胞从一个培养皿以1：2或1：2以上的比率转移或移植到另一个器皿的培养，这种培养称之为传代培养。
（二）细胞冻存及复苏原理在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。
如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。
在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。
贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。
细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。
二、操作器材、设备及灭菌处理（一）准备室的设备：双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品柜（放置消毒过的物品）、包装台。
（二）配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品）、PH计（测量培养用液PH 值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液）。
（三）培养室的设备：液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（-80℃）、空调、二氧化碳缸瓶。
必须放在无菌间的设备：离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、CO2孵箱（孵育培养物）、水浴锅、三氧消毒杀菌机、4℃冰箱（放置serum和培养用液）。
（四）细胞培养用液的配制器材与试剂：干粉型培养基、胰蛋白酶，纯净水系统。
（五）灭菌操作1、无菌室的灭菌：（1）定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3‰来苏尔或者新洁尔灭或者0.5％过氧乙酸擦拭。
（2）CO2孵箱（培养箱）灭菌：先用3‰新洁尔灭擦拭，然后用75％酒精擦拭或者0.5％过氧乙酸，再用紫外灯照射；（3）实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30分钟；（4）实验后灭菌：用75％酒精（3‰新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。
2、实验人员的无菌准备：（1）肥皂洗手；（2）穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋；（3）用75％酒精棉球擦净双手。
3、无菌操作的演示：（1）凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面；（2）靠近酒精灯火焰操作；（3）器皿使用前必须过火灭菌；（4）继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火；（5）各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。
如吸管不能碰到废液缸；（6）吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染；4、器械的清洗和消毒（1）、玻璃器皿的洗消：1.自来水刷洗，除去灰尘。
2.烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。
3.刷洗、烘干：12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。
4.泡酸、清洗：用清洁液（重铬酸钾120g：浓硫酸200ml：蒸馏水1000ml）浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次。
5.烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。
6.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向15磅时，维持20-30分钟。
7.高压消毒后烘干（2）、橡胶和塑料：橡胶和制品通常处理方法是：先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水和蒸馏水冲干净，再用烤箱烘干，然后根据不同品质进行如下的处理程序：1 . 针式滤器帽不能泡酸液,用NaOH泡6-12小时,或者煮沸20分钟,在包装之前要装好滤膜两张，安装滤膜时注意光面朝上(凹向上)，然后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒中在高压锅内15磅30分钟消毒，再烘干备用。
注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。
2. 胶塞烘干后用2％氢氧化钠溶液煮沸30分钟（用过的胶塞只要用沸水处理30分钟），自来水洗净，烘干。
然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。
最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。
3. 胶帽，离心管帽烘干后只能在2％氢氧化钠溶液中浸泡6-12小时（切记时间不能过长），自来水洗净，烘干。
然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。
最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。
4. 胶头可用75％酒精浸泡5分钟，然后紫外照射后使用即可。
注意事项：1.严格执行高压锅的操作规程：高压消毒时，先检查锅内是否有蒸馏水，以防高压时烧干，水不能过多因为其将使空气流畅受阻，会降低高压消毒效果。
检查安全阀是否通畅，以防高压时爆炸。
2.安装滤膜时注意光面朝上：注意滤膜光滑一面是正面，要朝上，否则起不到过滤的作用。
三、基本用液的配置（一）水的制备：细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。
需要用新鲜的纯净水。
（二）PBS的制备与消毒(也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks 液的配制)：（1）溶解定容：将药品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4·H2O 1.56g，KH2PO40. 2g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS 溶液。
（2）移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。
注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。
（三）胰蛋白酶溶液的配制与消毒：胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。
不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。
胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。
使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。
因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks 液。
终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。
（1）称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。
搅拌混匀，置于4℃内过夜。
（2）用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。
然后分装成小于-20℃保存以备使用。
（四）血清的灭活：细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在56℃水浴中灭火30分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。
注意事项：1.配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。
2.安装蔡式滤器时通常使用孔径0.45微米和0.22微米滤膜各一张，放置位置为0.45的位于0.22微米的滤膜上方，并且要特别注意滤膜光面朝上。
3.配制RPMI1640培养基时因为还要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，为了保证培养液PH值最终为7.2，可在配制时调PH至7.4。
四、实验步骤（一）传代前准备工作：1、培养前准备：制定实验计划和操作程序。
2、超净台要用75%酒精擦洗，然后紫外线消毒30分钟，工作台面上用品不要过多或重叠放置。
3、个人进入无菌培养室原则上须彻底洗手并按外科手术要求着装，开始操作前要用75%酒精或0.2%新洁而灭消毒手和前臂。
4、实验中需保持无菌操作要求。
实验前要点燃酒精灯，烧过的器械要注意冷却，以防细胞损伤。
5、分别使用不同吸管吸取营养液、PBS、细胞悬液及其它各种用液，而不能混用6、不要用手触及已消毒的器皿，如已接触，要用火焰灼烧或取备用品更换。
7、注意操作时勿大声讲话或咳嗽。
（二）取材1、将小鼠引颈杀死。
2、将小鼠全部浸入酒精30秒到一分钟，时间不能过长，以免酒精进入小鼠体内。
用消毒后的手术刀要脖子处环行剪开皮肤。
3、将小鼠翻转剥皮。
4、开腹5、定位胸腺的位置，轻轻的用镊子夹出，取材。
（三）原代培养原代培养一共有两种培养方法，分别是组织块培养法和分散细胞培养法。
组织块培养法又包括薄层培养法和翻转干涸法。
分散细胞培养法包括机械分散法和消化分散法。
这两种方法相比，组织块法操作简单，不易污染，适合真皮细胞、骨骼肌细胞、牙髓细胞等的培养，但是由于在反复剪切和接种过程中对组织块的损伤，并不是每个小块都能长出细胞，而且所需时间较长。
分散细胞培养法适用于大量细胞的培养，细胞的产量高，但是步骤繁琐，容易污染。
这里，我们采用温消化分散的方法来进行培养。
1、先将材料切成2-3mm2的小块2、清洗干净沉去上清3、加入胰蛋白酶37℃消化1-4小时（消化过程中随时进行振动)4、将消化液和细胞悬液通过100目不锈钢过滤网，以除掉未充分消化的大块组织离心去除胰蛋白酶，用Hank,s液漂洗一到二次。
5、对细胞进行染色，再用计数板计数。
6、接种培养。
（四）传代培养传代培养具体包括贴壁细胞消化法传代和悬浮细胞传代。
这里我们采用第一种方法。
1、先吸除培养液2、用PBS洗涤细胞一到二次3、根据细胞贴壁的牢固程度，可分别选用0.08%、0.025%、0.25%浓度的胰蛋白酶-EDTA溶液，用其量为1mL/25cm2 ,2mL/75cm2 ,37℃作用数分钟，于倒立显微镜下观察。
当细胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉消化液。
4、加入适量含新鲜血清的培养液终止胰蛋白酶作用，离心后再吸掉上清液。
5、轻拍培养瓶使细胞自己脱落，加入适量的新鲜培养液，用吸管吸打数次以分散细胞团块，混合均匀后，按合适的比例稀释后转入新的培养瓶培养。
（五）细胞纯化细胞纯化有很多方法，大致可分为自然纯化和人工纯化。
其中，人工纯化又包含酶消化法、机械刮除法、反复贴壁法、克隆法、流式细胞仪技术等方法。