细胞工程 实验一
《细胞工程》实验指导
细胞工程实验指导河北联合大学生命科学学院二零壹壹年七月邢朝斌目录实验一、植物组织培养培养基母液的配制实验二、植物组织培养的培养基配制实验三、康乃馨的离体快繁实验四、胡萝卜愈伤组织的建立实验五、组织培养物的继代培养实验一组织培养基母液的配制一、仪器及药品冰箱、天平（0.0001g）容量瓶: 1000 ml, 500 ml、250 ml、100 ml、25 ml广口储液瓶：500 ml、250 ml、50 ml、25 ml烧杯：1000 ml 、500 ml 、250 ml、100 ml 、50 ml数十根玻璃搅棒、大药勺、小药勺或挖耳勺标签纸、胶水、50%酒精、95%酒精、1 mol/L盐酸、1 mol/L NaOH几种常用的培养基所需的大量元素、微量元素、有机物、激素、铁盐等药品蒸馏水二、方法和步骤：按照培养基配方,把大量元素、微量元素、铁盐、有机物、植物激素分类,每一类中各种药品分别称量,如N6培养基各种母液的配制步骤如下：大量元素母液：包括用量较大的几种化合物〈见N6培养基配方〉，按表中排列顺序,将每种药品的用量扩大10倍，分别称取，分别溶解，然后按照顺序混合在一起。
如钙盐等易发生沉淀的药品不能混合，应单位定容，最后加上蒸馏水，定容至1升或500毫升。
在定容时注意用蒸馏水洗净烧杯和玻璃搅棒以减少误差。
定容后的溶液为大量元素母液，配制培养基时，每配1 L培养基需吸取该母液l00 ml或50 ml。
微量元素母液：因用量少，为了称量精确和方便,常配成100倍或1000倍的母液，即每种药品扩大l00倍或者l000倍。
逐个溶解，混合在一起成为微量元素母液，每配1 L N6培养基需吸取该母液10 ml或者1 ml。
铁盐：在N6培养基中需要单独配制，它是由硫酸亚铁（FeSO4•7H2O）2.78 g和乙二氨四乙酸二钠（Na2-EDTA）3.73 g，分别溶解，混合后，用酒精灯加热半小时以上，冷却后定容至1 L。
细胞工程实验一器材的清洗包装消毒与灭菌
压力蒸汽指示胶带
【结构与性能】压力蒸汽灭菌化学指示胶带，将特殊热敏化学染料与显 色剂及其辅料制成油墨，以斜形条纹或＾形状印制在特制的胶纸上制成；在 一定温度压力的饱和蒸汽作用下，经过一个灭菌周期处理后，指示剂变成灰 黑色或黑色；灭菌后的颜色不易褪色。
【使用范围】压力蒸汽灭菌化学指示胶带可适应各种型号压力蒸汽灭菌 器，用于固定物品包或标示物品包（或容器）是否已经过灭菌处理过程。
湿热消毒
高压蒸汽灭菌器 1.消毒物品不能装得太满
2.加热升压前，打开排气阀门排放消毒器内冷空气
3.达到所需压力时开始计算消毒时间
常用物品消毒压力及时间 培养液和橡胶制品：65kPa(115 ℃) 10min 玻璃制品和金属器械：101.3kPa(121.3 ℃) 20min
4.消毒完毕，待压力指针降至零位，等数分钟后， 打开消毒器盖
细胞工程实验
临床血液学实验室 张伶
器材的清洗，包装和灭菌
实验目的:
1.掌握细胞培养常用器材清洗、包装和灭菌方法 2.掌握湿热灭菌法和滤过除菌法的操作
实验内容：
常用实验器材 清洗 包装 消毒
塑料器材
浸泡 超声波加洗涤剂清洗
冲洗干净 清洁液浸泡 过夜（12h） 自来水冲洗15次 去离子水冲洗3次
烤干
紫外线或辐射灭菌备用
清洗
注意事项
塑料培养板主要为一次性商品，仍可经过清 洗和消毒灭菌重复使用 使用后应立即投入清水中浸泡
橡皮器材
清洗
浸泡
洗涤剂刷洗，冲洗干净
注意事项
5%NaOH煮10 -20min , 冲洗干净 胶塞洗刷的重点部位是胶塞使用面，用刷
逐个刷洗
4%盐酸煮10 -20min
自来水冲洗8-10次
细胞工程实验
实验一细胞工程实验室、器皿的洗涤与灭菌一、目的要求通过实验，培养学生良好的卫生习惯、树立组织培养的无菌意识；掌握组织培养实验室器皿的洗涤与灭菌方法。
二、材料与用具2%新洁尔灭、高锰酸钾、甲醛、70%酒精、洗涤剂、喷雾器、各种培养器皿、工作服、口罩和手套等。
三、方法步骤1、地面、墙壁和工作台的灭菌将配好的2%新洁尔灭溶液倒人喷雾器中，对地面、墙壁、角落均匀地喷务。
在喷房顶时间，注意不要让药液滴入眼睛。
2、无菌室和培养室的灭菌首先将房子关闭，然后用10ml甲醛和5g高锰酸钾的配比液进行熏蒸。
操作时要戴好口罩和手套，用甲醛与高锰酸钾配比时要注意避开烟雾。
3、培养器皿的洗涤与灭菌将培养器皿先用肥皂水或洗衣粉浸泡几小时，然后用清水冲洗，最后用三级水和一级水各冲3遍，烘干后备用。
四、实验报告1、将本次实验内容整理成实验报告2、简述组织培养实验室的灭菌过程与注意事项。
实验二:细胞培养基的配制及灭菌一、目的要求：1．了解基本设备以及有关仪器的用途与功能。
2．通过实际操作，学会洗涤剂的配制和各种器皿的清洗和灭菌方法。
3．通过掌握培养基对母液制备及常用培养基的配制和灭菌方法，为植物组织培养准备合适的营养条件。
4．每四人一组，每人接种一个三角瓶，2支试管；每两组制备一套培养基母液。
二、材料用具：每组所需器皿：50ml三角瓶×8 ；试管×16试剂瓶×5（200ml、2×1000ml、100ml、500ml）容量瓶烧杯量筒漏斗玻璃棒移液管pH试纸称量纸封口膜橡皮筋标签纸记号笔所需仪器：高压灭菌锅、烘箱、超净工作台、百分之一与万分之一天平、电炉、冰箱、所需药品：重铬酸钾、浓硫酸等、CaCl2·2H2O，KNO3，MgSO4·7H2O，NH4NO3，KH2PO4，Na2—EDTA，FeSO4·7H2O，MgSO4·4H2O，Zn SO4·7H2O，H3BO3，KI，NaMoO4·2H2O，CuSO4·5H2O，CoCl2·6H2O，甘氨酸，盐酸硫胺素，盐酸吡哆醇，烟酸，肌醇，蔗糖，琼脂，HCL,NaOH,酒精。
细胞生物学实验(本科生)实验内容
细胞生物学实验（本科生）实验内容实验一细胞的结构目的：1、熟悉实验室规范2、掌握光镜下细胞器的形态、分布特点；3、掌握临时制片法；4、学会生物绘图内容：（一）录像：临时标本片的制作（二）光镜下细胞器形态学观察：1、高尔基体（兔神经节切片）2、细胞核及核仁（蝾螈表皮装片）3、线粒体（肾小管切片）4、细胞骨架（培养肝癌细胞飞片）5、中心体*（马蛔虫受精卵切片）（二）操作：制作人口腔上皮细胞临时制片（显示活体线粒体）（三）实验报告：绘制人口腔粘膜上皮细胞实验二细胞化学细胞工程目的：1、掌握甲基绿-派洛咛染色法原理及操作技巧2、了解几种化学成分的显示方法及原理；3、观察各种化学成分在细胞中的分布；4、了解PCC原理；5、了解细胞融合及其应用；内容：（一）录象：克隆羊（二）观察：1、糖原（动物肝切片，PAS反应）2、酸性蛋白（蟾蜍血涂片，酸性固绿染色）3、酸性磷酸酶*（鼠腹腔液涂片，金属沉淀法显色）4、DNA* （小鼠睾丸切片，Feulgen反应）5、DNA、RNA*（人口腔粘膜上皮细胞涂片，吖啶橙染色，荧光显微镜观察）6、细胞融合（鸡血细胞、培养细胞）7、PCC*（Hela细胞）（三）操作：制作蟾蜍血涂片，显示DNA、RNA（四）实验报告：甲基绿-派洛咛染色原理、步骤及结果实验三显微测量细胞的生理活动目的：1、掌握显微测量技术；2、观察细胞的生理活动；3、掌握死活细胞的鉴别方法及原理；内容：(一)录象：细胞的活动显微测量（二）观察：1、胞质环流（黑藻叶片）2、吞噬作用*（小鼠白细胞）3、吞噬作用（蟾蜍白细胞）（三）操作：1、显微测量（蟾蜍红细胞）2、死活细胞鉴别（酵母细胞）（四）实验报告：1、测量5-10个细胞的大小，计算平均值；2、计算细胞存活率。
实验四细胞增殖染色体（质）目的：1、熟悉细胞增殖的主要方式；2、掌握细胞增殖周期各期的形态学特点；3、熟悉人染色体的基本形态特征；4、掌握X染色质标本的制备方法及原理；内容：（一）观察：1、动物细胞有丝分裂（马蛔虫受精卵切片）2、植物细胞有丝分裂（洋葱根尖纵切片）3、收缩环*（肝癌细胞飞片）4、无丝分裂*（草履虫装片）5、人染色体的基本形态（人血涂片）（二）操作：1、制作有丝分裂压片（洋葱根尖）2、制作X染色质标本片（人口腔粘膜上皮细胞）（三）实验报告：绘有丝分裂图、X染色质图。
细胞工程实验内容
细胞工程实验（生物技术大实验二）安排
一、实验内容：
实验一、杂交瘤抗体制备录像观看和培养基的配制
实验二、小鼠饲养层细胞和小鼠免疫脾细胞的制备
实验三、细胞原代培养：组织块法
实验四、免疫脾细胞与骨髓瘤细胞的融合技术
实验五、融合细胞的培养及的观察
实验六、动物细胞的传代
实验七、细胞的冻存和复苏
实验八、细胞活性的MTT法检测
实验九、原生质体的分离技术
实验十、原生质体的收集与纯化
实验十一、原生质体的培养与观察
实验十二、AO/EB双染荧光显微镜观察细胞凋亡
二、实验分组（见后）
三、各组做实验的时间安排
*注意：本实验是连续性的大实验，由于学生操作能力不同，每一小小组（2～3人）所用的时间不一样，因此所做实验在次序和时间上会有些变化，实验也会穿插进行。
要求学生在实验时间段里听从安排。
四、地点：10-404～406;10-407～409
第三、第四和第五大组分组及超净工作台安排
09生技(行)
6.28～
7.1（上午8点开始）
注意事项
1．每个大组再分5个小组，每小组的小组长负责实验工具的领取及用后干净归还。
2．超净工作台用完后收拾干净。
3．实验结果的观察时间另行通知。
4．实验结果观察结束后，把自己小组的培养瓶等洗干净归还。
细胞工程实验总结
实验一、细胞培养实验器材和试剂的准备1、哪些物品适合于高压灭菌，并说明理由。
①材料：微孔滤膜(直径25 cm)：孔径为0.22μm、微孔滤膜(直径90 cm)：孔径为0.22 μm、过滤器(直径25 cm)。
②仪器和器材：眼科剪刀和镊子、长镊子、培养皿、培养瓶、试剂瓶（或盐水瓶）、移液枪、10毫升试管、10毫升离心管、巴氏吸管、5毫升（或10毫升）吸量管、不锈钢过滤器、塑料过滤器、注射器、超净工作台、干燥箱、高压灭菌锅、正压泵。
理由：适合于高压灭菌是布类、橡胶制品(如胶塞)、金属器械、玻璃器皿、某些耐高温的塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液(如Hanks液、PBS等)。
2、细胞培养常用液体如何配制和灭菌？1）PBS ：8.0g NaCl、0.2gKCl、2.2gNa2HPO4、0.12gKH2PO4溶于1000 mL双蒸水，高压灭菌，4℃保存。
（准备试剂瓶）灭菌方法：高压灭菌。
2）干粉培养基过滤除菌（先准备好不锈钢过滤器及滤膜，安装后高压灭菌，适度烘干；铝盒4个，三角瓶2个，容量瓶，不锈钢过滤器一套，酒精灯，酒精棉球3瓶，吸耳球3个，吸量管10毫升和5毫升各5根，分装用瓶，血清，超纯水，抗生素）认真阅读说明书。
说明书都注明干粉不包含的成分，常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。
这些成分有些是必须添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根据实验需要决定。
配制方法（1L）：1）在一个尽可能接近总体积的容器中加入大约500mL双蒸水。
2）在室温（20℃到30℃）的水中加入干粉培养基。
3）水洗袋内残留培养基，全部转移到容器内，轻轻搅拌，不要加热。
4）完全溶解之后，1袋1L粉状DMEM加3.7g NaHCO3，1mmoL∕L丙酮酸钠，即0.11g/L，添加双抗。
5）用双蒸水定容到1L，搅拌溶解。
注意不要过分搅拌。
6）通过缓慢搅拌加入1N NaOH 或1N HCL调节pH值培养基在过滤前要保持密封。
《细胞工程》实验指导书
实验指导书课程：细胞工程授课专业：生物工程、生物技术主编：徐艳实验一实验室的概况与培养基母液的配制一、实验目的：熟悉植物细胞工程实验室的基本结构、必须的基本设备及其用途与作用方法，掌握配制培养基母液的基本技能。
二、材料与用具：1、药品：生长调节类物质、无机盐类、有机化合物等。
2、用具：分析天平、移液管、量筒、培养瓶、烧杯、冰箱、母液瓶等。
三、教学时数：4课时。
四、实验内容：（一）实验室的基本结构及主要设备：1、洗涤室：水槽、工作台、蒸馏水器等功能：器皿及材料洗涤；蒸馏水制备。
2、消毒室：高压蒸汽灭菌锅、烘箱等功能：器皿的干燥；器皿及培养基的消毒。
3、试剂室：试剂柜、冰箱功能：存放试剂及器皿。
4、准备室：工作台、天平、水浴锅、电炉、显微镜及各种玻璃仪器、金属仪器等功能：培养基药品称量、配制、分装、灭菌；材料预处理；培养材料的观察分析。
5、接种室（含缓冲室）：超净工作台、接种箱等功能：无菌操作。
6、培养室：培养架、摇床等功能：培养物的控制培养。
7、驯化移栽室：如温室、大棚等功能：试管苗的驯化移栽。
（二）培养基母液的配制：1、MS基本培养基母液：各成分单独称量、单独溶解后混合定容①大量元素母液：10倍，1L注意：CaCl2.2H2O易与其他成分反应产生沉淀；②微量元素母液：100倍，0.5L③铁盐母液：100倍，0.5L注意：两者等体积溶解后混合，且需80℃水浴1h充分螯合，等待冷却后定容；④有机母液：100倍，0.5L2、激素类母液的配制：①1mg/ml的6－BA 50ml：先用0.1mol∕L的 HCL或NaOH溶解后再加水定容；②0.1mg/ml的NAA 50ml：先用少量0.1mol∕L的NaOH溶解后再加水定容。
注：精度要求精确到小数点后三位。
（三）培养器皿的洗涤：1、对污染的培养器皿先进行消毒灭菌处理；2、清除残渣，用清水洗净，浸泡于合成洗涤剂中6-24小时；3、用洗涤刷洗涤，并用自来水冲洗干净；4、用烘箱烘干或晾干，存放于防尘橱内备用。
植物细胞工程实验 (1)
植物细胞工程实验一 培养基母液的制备一、实验目的与意义学习和掌握培养基母液的配制方法。
在配制培养基前，为了使用方便和用量准确，常常将大量元素、微量元素、铁盐、有机物质、激素类分别配制成比培养基配方需要量大若干倍的母液。
当配制培养基时，只需要按预先计算好的量吸取母液即可。
二、实验器材电子天平（称量为0.0001g ）、电子天平（称量为0.01g ）、烧杯（500ml 、100ml 、50ml ）、容量瓶（1000ml 、100 ml 、50 ml 、25 ml ）、细口瓶（1000 ml 、100 ml 、50 ml 、25 ml ）、药勺、玻璃棒、电炉。
三、实验药品NH 4NO 3、KNO 3、CaCl 2·2H 2O 、MgSO 4·7H 2O 、KH 2PO 4、KI 、 H 3BO 3、 MnSO 4·4H 2O 、 ZnSO 4·7H 2O 、 Na 2MoO 4·2H 2O 、CuSO 4·5H 2O 、CoCl 2·6H 2O 、FeSO 4·7H 2O 、Na 2-EDTA·2H 2O 、肌醇 、烟酸、盐酸吡哆醇(维生素B 6)、盐酸硫胺素(维生素B 1)、甘氨酸。
四、实验步骤每种母液均配制500ml ，各成分的质量如下： 1、大量元素母液的配制表1 MS 培养基大量元素母液制备序号 药品名称培养基浓度（mg/L ）扩大20称量(mg)备注1 NH 4NO 3 1650 16500 蒸馏水定容至500ml2 KNO3 1900 19000 3 CaCl 2·2H 2O 440 44004 MgSO 4·7H 2O 370 37005 KH 2PO 41701700各成分按照表1培养基浓度含量扩大20倍，用称量为0.01g 的电子天平称取，用蒸馏水分别溶解，按顺序逐步混合。
后用蒸馏水定容到500ml 的容量瓶中，即为20倍的大量元素母液。
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细胞器的分离、制备与观察
[目的要求]
1．掌握差速离心法的原理。
2．了解甲基绿-派洛宁、中性红-詹姆斯绿的染色原理和着色现象。
3. 掌握细胞核、线粒体等细胞器的染色方法。
[实验原理]
球形颗粒的沉降速率取决于其密度、半径、介质黏度和离心力。
差速离心法（differential centrifugation）是将细胞匀浆在密度均一的介质中从低速到高速离心，较大颗粒先在低速离心时沉淀，再用高速离心上清液中的小颗粒物质，从而达到逐级分离细胞器的目的。
细胞器的分离常通过组织细胞匀浆、分级分离和分析三个步骤完成。
分级分离方法有两种，即：差速离心法和密度梯度离心法。
细胞器沉降先后顺序是细胞核、线粒体、溶酶体和替他微体、核糖体和大分子物质。
线粒体内膜上分布细胞色素氧化酶，能使詹纳斯绿B燃料保持在氧化状态呈现蓝绿色，而胞质中的颜料被还原成无色。
[实验用品]
1．器具：匀浆器、高速冷冻离心机、天平、普通光学显微镜、1.5 ml Ep管、载玻片、10 ml滴管、冰盒、冰块、滤网、染缸、20 ml烧杯。
2．材料：动物肝脏。
3．试剂：生理盐水、PBS、0.25 mol/L的蔗糖溶液、0.34mol/L的蔗糖溶液、0.88mol/L 的蔗糖溶液、95%乙醇、丙酮、甲基绿—派洛宁、中性红—詹纳斯绿、蒸馏水、冰。
4. 甲基绿-派洛宁染液：0.2mol/L醋酸缓冲液(pH4.8)：冰醋酸1.2ml，加蒸馏水至100ml；醋酸钠2.72g溶于100ml蒸馏水中; 使用时两液按2：3比例混合.
A液：5%派洛宁水溶液4ml、2%甲基绿水溶液14ml、蒸馏水16ml；B液：0.2mol/L。
醋酸缓冲液(pH4.8)16ml。
使用时临时将A液与B液混合(5:2)。
5．）中性红-詹纳斯绿B染液： A: 将3滴詹纳斯绿B饱和水溶液(溶解度5.18％)加到5ml无水乙醇中，然后再加入1ml 1:15000中性红溶液(中性红10mg溶于
150ml水中)，瓶子用黑纸包好，4℃冰箱保存。
[实验步骤]
1．组织匀浆制备
肝脏用预冷的生理盐水洗净血污，用滤纸吸干。
称取约1 g左右的肝组织，用预冷的0.25 mol/L的蔗糖溶液冲洗数次，剪碎。
以预冷的0.25 mol/L的蔗糖溶液4.5ml悬浮剪碎的组织，移入匀浆器内，在冰浴条件下匀浆（蔗糖溶液分数次加入）。
（0.25 mol/L的蔗糖溶液使肝脏细胞在匀浆的过程中处于低渗条件下，使得细胞更容易破碎，匀浆彻底）
2.细胞器的分级分离
2.1细胞核的分离：
将组织匀浆分装到1.5ml 离心管中，3000rpm,离心10min，沉淀为细胞核及质膜碎片。
（上清液留作线粒体分离）
2.2沉淀用1ml0.25mol/L蔗糖溶液洗涤离心2次，每次4000r/min离心10min；
2.3将沉淀用500μL0.34mol/L蔗糖溶液悬浮，然后在悬液下轻轻加入0.88mol/L蔗糖溶液400μL，尽量使溶液分层，5000r/min离心15-20min；
2.4用PBS溶液悬浮——涂片——干燥——95%乙醇固定（5min）——甲基绿-派洛宁染色15-20min——放入丙酮分离30S——蒸馏水漂洗——吸干镜检。
(2)线粒体的分离
将分离细胞核时收集的上清以10000g 离心10 min，弃去上清。
沉淀用预冷的0.25 mol/L的蔗糖溶液1ml重悬后，10000g 离心10 min，取沉淀。
(3)线粒体的鉴定
于洁净载玻片上滴1滴中性红-詹纳斯绿B染液，用牙签挑取线粒体沉淀均匀涂于染液中，染色5-10 min，盖上盖玻片，镜检。
[结果与分析]
光学显微镜下观察，可看到富集分离的细胞核，细胞核呈圆球形，核中央可见到两个或多个被染成红色的核仁，外围的物质被染成蓝绿色；线粒体经詹纳斯绿B 染色呈蓝绿色，呈棒状或哑铃状。
[注意事项]
1．组织匀浆时，既要尽可能使细胞完全破碎，又要尽量快速。
2．在细胞器分离过程中，所有操作应尽可能在低温下进行。
3．实验过程应注意保持细胞器的完整性，避免操作过于剧烈。
[思考题]
1．简述细胞器分级分离的实验原理和主要步骤？
2．实验操作中有哪些关键步骤和因素影响所得细胞器的含量和纯度？。