微生物的遗传育种-诱变育种
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微生物菌种的选育和保藏--诱变育种
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢诱变处理： ➢诱变剂的处理方式： ✔单因子处理：采用单一诱变剂处理出发菌株； ✔复合因子处理：两种以上诱变因子共同诱发菌体突变，包括①两种或多种 诱变剂先后使用；②同一种诱变剂的重复使用；③两种或多种诱变剂的同时使用。 ➢诱变剂的处理方法： ✔直接处理方法：将菌悬液用物理、化学因子处理，然后涂平板分离突变株； ✔生长过程处理法：适用于诱变作用强而杀菌率较低的诱变剂，或在分裂过 程中只对DNA起作用的诱变剂，如NTG、LiCl、 秋水仙碱等；方法：可将诱变剂 加入培养基后涂平板；或先把培养基制成平板，将一定浓度的诱变剂和菌体加入平 板； 或摇瓶振荡培养处理；
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢ 制备单孢子(或单细胞)悬液： ➢ 目的：获得单孢子(或单细胞)均匀的悬液；
➢ 原因: 分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，又可避免长出不纯菌落；
➢ 方法:✔菌龄:对数期细胞、刚成熟的孢子母菌细胞悬浮液的浓度为106个/mL、
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢ 突变株的分离与筛选： ➢ 筛选方案:
➢ 筛选方法： ✔初筛：a.随机筛选：也称摇瓶筛选；随机挑选的平板菌落进行摇瓶筛选； b.平板菌落预筛：在培养皿上诱变后从试样检出突变体的一种
琼脂平板筛选法,有纸片培养显色法、透明圈法、琼脂块培养法等; ✔复筛:对突变株的生产性能作比较精确的定量测定工作，代表方法：琼脂
放线 菌或细菌的浓度为108个/ mL左右;
✔菌悬液配制方法:离心洗涤前培养物，用冷生理盐水或缓冲液制备菌悬 液，放在盛有玻璃珠的三角瓶内振荡10min,令其分散，用无菌脱脂棉或滤纸过滤。 通过菌体计数，调整菌悬液的浓度供诱变处理。
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢ 诱变处理： ➢ 诱变剂种类的选择：物理诱变剂和化学诱变剂 ✔物理诱变剂：紫外线、χ射线、γ射线、等离子、快中子、ɑ射线、β射线、 超声波等； ✔化学诱变剂: 碱基类似物、烷化剂、羟胺、吖定类化合物等； ➢ 最适诱变剂量选择： ✔诱变剂剂量表示方式：a.UV的剂量指强度与作用时间的乘积； b.化学诱变剂剂量：诱变剂的浓度和作用 时间的乘 积来表示； c.在育种实践中，常以杀菌率来作诱变剂 的相对剂量； ✔最适诱变剂量确定：a.依据：最适剂量应该使所希望得到的突变株在存活 群体中占有最大的比例； b.方法：通过比较剂量--存活率曲线和剂量-
第五章 工业微生物诱变育种
株时，应选择多种遗传类型的菌株作为出发菌株比较
稳妥，容易在较短时期内达到育种目的。
8. 菌种代谢特点
了解菌种代谢特点有助于选择有效的出发菌株。 有人曾研究过肌苷酸产生菌的代谢特性，发现肌苷 酸的生物合成过程与肌苷、肌苷酸及核苷酸、磷酸 化酶的活性有关，如果从产生肌苷酸野生型的枯草 杆菌中筛选到降解酶活性低而磷酸化酶活性强的作 为诱变出发菌株，一般都能得到良好的诱变效果。
6. 药品和原材料质量
药品规格和原材料来源不同，都会影响菌种的质量。
四、了解菌种有效产物中的 各种组分在代谢 合成过程中与培养条件的关系
由棘孢小单孢菌(Micromonospora echinopora) 产生的庆大霉素，其中C1是有效的组分； C2是无效
的。在发酵过程中加入适量的磷或蛋白胨以及加大 通 风量都有利于C1的合成；反之，C2的比例就上升。
菌悬液由出发菌株的孢子或菌体细胞与生理盐水或 缓冲液制备而成。对菌悬液的制备有如下的要求：
1、供试菌株的孢子或菌体要年轻、健壮。
细胞要新培养的，细胞生理活性方面既要同步， 又要处在最旺盛的对数期，这样突变率高，重现性也 好。 霉菌孢子浓度约为：106ml-1，放线菌孢子浓度约 为：106~107ml-1。菌悬液通常采用生理盐水制备。如 果用化学诱变剂处理时，应采用相应的缓冲液配制， 以防处理过程中pH变化而影响诱变效果。
1. 对一般出发菌株的要求
（1）从自然界样品中分离筛选出来的野生菌株，虽 然产量较低，但对诱变因素敏感，变异幅度大，
正突变率高；
（2）在生产中使用的，具有一定生产能力，并且在 生产过程经过自然选育的菌株； （3）采用具有有利性状的菌株，如生长速度快、营 养要求低以及产生孢子早而多的菌株；
第七章微生物的遗传变异和育种2
10-6~10-9
若干细菌某一性状的突变率
菌名
突变性状
突变率
Escherichia coil （大肠杆菌）
抗T1噬菌体
3×10-8
E．coil
抗T3噬菌体
1×10-7
E．coil
不发酵乳糖
1×10-10
E．coil
Staphylococcus aureus（金黄色葡 萄球菌）
S．aureus
抗紫外线 抗青霉素 抗链霉素
间接引起置换的诱变剂：
引起这类变异的诱变剂都是一些碱基类似物，如5-溴尿嘧 啶（5-BU）、5-氨基尿嘧啶（5-AU）、8-氮鸟嘌呤 （8-NG）、2-氨基嘌呤（2-AP）和6-氯嘌呤（6-CP） 等。它们的作用是通过活细胞的代谢活动掺入到DNA 分子中后而引起的，故是间接的。
（2）移码突变（frame-shift mutation 或phase-shift mutation）
（四） 基因突变的自发性和不对应性的证明
一种观点：突变是“定向变异”，是“驯化”，是由环 境因子诱发出来的；
另一种观点；基因突变是自发的，且与环境因素是不对 应的，后者只不过是选择因素；
1、 变量试验（fluctuation test） 又称波动试验或彷徨试 验。
2、涂布试验（Newcombe experiment） 3、平板影印培养试验（replica plating） 1952年，J．Lederberg夫妇
2、定向培育优良品种：指用某一特定因素长期处理某微生 物的群体，同时不断的对它们进行移种传代，以达到积 累并选择相应的自发突变株的目的。由于自发突变 的 频 率较低，变异程度较轻微，所以培育新种的过程十分缓 慢。与诱变育种、杂交育种和基因 工程技术相比，定向 培育法带有“守株待兔”的性质，除某些抗性突变外， 一般要相当长的时间
微生物遗传育种名词解释（二）
微⽣物遗传育种名词解释（⼆）1、⾃然选育：从⾃然界直接分离和筛选菌种或在⽣产中利⽤⾃发突变选育优良菌株。
2、诱变育种：对出发菌株进⾏诱变，然后运⽤合理的程序与⽅法筛选符合要求的优良菌株。
3、代谢调控育种：利⽤现有的代谢调控知识，筛选特定突变型，改变代谢流量或流向，从⽽提⾼⽬的产物产量的⼀种育种技术。
4、重组育种；利⽤微⽣物间的遗传重组来改变其遗传物质组成及结构的⼯业微⽣物育种技术。
5、原⽣质体融合育种；通过⼈为⽅法，使遗传性状不同的两细胞的原⽣质体发⽣融合，从⽽实现遗传重组的⼯业微⽣物育种技术。
6、基因⼯程育种技术：在体外构建重组DNA分⼦并导⼊宿主内⾼效表达，从⽽获得重组微⽣物的育种技术。
7、突变：遗传物质核酸中的核苷酸序列发⽣了稳定的可遗传的变化。
8、突变体：带有突变基因的细胞或个体9、突变型：突变体的基因型或表型称为突变型，和其相对的原存在状态称为野⽣型。
10、⾃发突变（spontaneous mutagenesis）：未经任何⼈为处理⽽⾃然发⽣的突变；11、诱发突变（induced mutagenesis）：由⼈们有意识地利⽤物理或化学⼿段对⽣物体进⾏处理⽽引起的突变。
12、整倍体：含有完整的染⾊体组。
13、⾮整倍体：含有不完整状态的染⾊体组，⼀般是指⼆倍体中成对染⾊体成员的增加或减少。
14、部分⼆倍体：原核⽣物中由⼀整条染⾊体和外来染⾊体⽚段所构成的不完整⼆倍体。
增变基因（mutator gene）：其基因突变会导致整个基因组的突变频率明显上升的⼀些基因。
15、前突变：诱变剂所造成的DNA分⼦某⼀位置的损伤16、光复活：指细菌在紫外线照射后⽴即⽤可见光照射，可以显著地增加细菌的存活率，降低突变率。
17、表型延迟phenotype lag：突变体表型改变落后于其基因型改变的现象。
18、分离性延迟segregational lag ：突变基因由杂合状态到纯合状态所造成的表型迟延19、⽣理性延迟physiological lag ：由于基因产物的“稀释”过程所造成的表型迟延野⽣型（wild type）：从⾃然界分离到的任何微⽣物在其发⽣营养缺陷突变前的原始菌株；基因重组：由于不同DNA链的断裂和连接⽽产⽣DNA⽚段的交换和重新组合，形成新的DNA分⼦，进⽽形成新遗传个体的⽅式称为基因重组。
微生物 诱变育种
见光的能量而被激活。
紫外损伤的光复活作用
DNA损伤的修复
切补修复 切补修复是在内切核酸酶、
外切核酸酶、DNA聚合酶以及 连接酶的协同作用下将嘧啶 二聚体酶切除去，继而重新 合成一段正常的DNA链以填补 酶切所留下的缺口，使损伤 的DNA分子恢复正常的修复方 式。由于整个过程不依赖于 可见光，所以切补修复也称 暗修复。切补修复几乎存在 于所有的微生物中。
也可用长了菌落的平板直接照射。 一般照射剂量4~10万伦琴。
此外还能引起染色体畸变，即因 染色体断裂引起染色体的倒位、 缺损和重组等。但发生了染色体
断裂的细胞常常不稳定。
化学诱变因素
化学诱变剂用量很少，诱变时设
备简单，只要一般实验室的玻璃 器皿就行，所以其应用发展较快。
碱基类似物
碱基类似物是指与DNA结构中的四种碱基 A、T、G、C在化学结构上相似的一类物 质。如5-溴尿嘧啶（BU）和5-溴脱氧尿
紫外损伤的切补修复
紫外线照射的操作方法
在暗室中安装的15瓦紫外线灯管最 好装有稳压装置，以求剂量稳定。
处理时，可将5毫升菌悬液放在直径 5厘米的培养皿中，置磁力搅拌器上， 使培养皿底部离灯管30厘米左右， 培养皿底要放平，处理前应先开灯 20~30分钟预热稳定。照射时启动磁 力搅拌器，以求照射均匀。
诱变育种
第一节基因突变
突变泛指细胞内（或病毒颗粒 内）的遗传物质的分子结构或 数量突然发生的可遗传的变化。
突变往往导致产生新的等位基 因及新的表现型。狭义的突变 专指基因突变，也称点突变， 而广义的突变则包括基因突变 和染色体畸变。
突变的几率一般很低，约为106~10-9。
突变是工业微生物产生变种 的根源，是育种的基础，但 也是菌种发生退化的主要原 因。
紫外损伤的光复活作用
DNA损伤的修复
切补修复 切补修复是在内切核酸酶、
外切核酸酶、DNA聚合酶以及 连接酶的协同作用下将嘧啶 二聚体酶切除去，继而重新 合成一段正常的DNA链以填补 酶切所留下的缺口，使损伤 的DNA分子恢复正常的修复方 式。由于整个过程不依赖于 可见光，所以切补修复也称 暗修复。切补修复几乎存在 于所有的微生物中。
也可用长了菌落的平板直接照射。 一般照射剂量4~10万伦琴。
此外还能引起染色体畸变，即因 染色体断裂引起染色体的倒位、 缺损和重组等。但发生了染色体
断裂的细胞常常不稳定。
化学诱变因素
化学诱变剂用量很少，诱变时设
备简单，只要一般实验室的玻璃 器皿就行，所以其应用发展较快。
碱基类似物
碱基类似物是指与DNA结构中的四种碱基 A、T、G、C在化学结构上相似的一类物 质。如5-溴尿嘧啶（BU）和5-溴脱氧尿
紫外损伤的切补修复
紫外线照射的操作方法
在暗室中安装的15瓦紫外线灯管最 好装有稳压装置，以求剂量稳定。
处理时，可将5毫升菌悬液放在直径 5厘米的培养皿中，置磁力搅拌器上， 使培养皿底部离灯管30厘米左右， 培养皿底要放平，处理前应先开灯 20~30分钟预热稳定。照射时启动磁 力搅拌器，以求照射均匀。
诱变育种
第一节基因突变
突变泛指细胞内（或病毒颗粒 内）的遗传物质的分子结构或 数量突然发生的可遗传的变化。
突变往往导致产生新的等位基 因及新的表现型。狭义的突变 专指基因突变，也称点突变， 而广义的突变则包括基因突变 和染色体畸变。
突变的几率一般很低，约为106~10-9。
突变是工业微生物产生变种 的根源，是育种的基础，但 也是菌种发生退化的主要原 因。
微生物遗传育种第二章
1952年，J. 和E. Lederberg 夫妇发明了一种直接证明突变自发 性的方法 -----影印培养法，证明了 细菌的抗药性是发生在加入药物之 前的，而药物的作用仅是把突变型 筛选出来。
第二节 基因突变的规律
Lederberg等设计的平板影印培养法
第二节 基因突变的规律
二、自发性
各种性状的突变，可以在没有人 为的诱变因素下自发地发生。
第三节 诱变的机制
（5）NTG（NNG）的作用特点：
第三节 诱变的机制
三、嵌合剂的致突变作用
吖啶类染料和ICR类化合物是通过同 DNA分子结合而发生诱变作用的两类主要的 化学诱变剂。吖啶类化合物主要有原黄素， 5-氨基吖啶、吖啶橙等。ICR化合物是指由 美国癌症研究所应用化学方法合成的 （Institute for Cancer Research)，是一些由 烷化剂和吖啶类相结合的化合物。
分子结构，引起生物体发生突变。
第三节 诱变的机制
A 直接诱发碱基错配：
鸟嘌呤N7位置上的烷化有利于发生
电离作用，而离子化的鸟嘌呤则应该具
有同T而不是同C配对的倾向，因此，便
能产生GC→AT的转换。
第三节 诱变的机制
B 错误修复： 鸟嘌呤N7烷化作用的另一种效应是使 鸟嘌呤碱基与糖-磷酸的键合削弱，从而导 致烷化的鸟嘌呤从DNA上逐渐地脱落下来， 这个过程就是所谓的“烷化脱嘌呤作用”。 脱嘌呤形成了分子裂缝，在随后的DNA复 制过程中便会产生转换或颠换。
1、突变（Mutation）：指遗传物质发生了稳定 的可遗传的变化，所有的突变都是DNA结构中碱 基所发生的改变。 2、突变体（Mutant）：携带突变的生物个体或 群体或株系，称为突变体。
3、突变基因（Mutant Gene）和野生型基因 （Wild Gene）：发生了突变的基因称为突变基 因，没有发生突变的基因称为野生型基因。
微生物 10-1第十章 微生物的遗传变异和育种
R100质粒 质粒(89kb)可使宿主对下列药物及重金属具有抗性： 可使宿主对下列药物及重金属具有抗性： 质粒 可使宿主对下列药物及重金属具有抗性 汞（mercuric ion ，mer）四环素（tetracycline，tet ）链霉素 ）四环素（ ， (Streptomycin, Str)、磺胺 、磺胺(Sulfonamide, Su)、氯霉素 、 (Chlorampenicol, Cm)、夫西地酸（fusidic acid，fus） 、夫西地酸（ ， ） 并且负责这些抗性的基因是成簇地存在于抗性质粒上。 并且负责这些抗性的基因是成簇地存在于抗性质粒上。
3、质粒的类型 、
严谨型质粒(stringent plasmid)：复制行为与核染色体的复制同步，低拷贝数 严谨型质粒 ：复制行为与核染色体的复制同步， 松弛型质粒(relaxed plasmid)：复制行为与核染色体的复制不同步，高拷贝数 松弛型质粒 ：复制行为与核染色体的复制不同步，
窄宿主范围质粒(narrow host range plasmid) 窄宿主范围质粒 只能在一种特定的宿主细胞中复制） （只能在一种特定的宿主细胞中复制） 广宿主范围质粒(broad host range plasmid) 广宿主范围质粒 可以在许多种细菌中复制） （可以在许多种细菌中复制）
因子） （2）抗性因子（Resistance factor，R因子） ）抗性因子（ ， 因子
包括抗药性和抗重金属二大类，简称 质粒 质粒。 包括抗药性和抗重金属二大类，简称R质粒。 抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。 抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。
抗性转移因子（ 抗性转移因子（RTF）：转移和复制基因 ） R质粒 质粒 抗性决定因子： 抗性决定因子：抗性基因
微生物的遗传变异和育种
第七章微生物的遗传变异和育种第一节微生物的遗传变异的概述遗传和变异是生物体最本质的属性之一。
所谓遗传，讲的是发生在亲子间的关系，即指生物的上一代将自己的一整套遗传因子稳定地传递给下一代的行为或功能，它具有极其稳定的特性。
而变异是指子代与亲代之间的不相似性。
遗传是相对的，变异是绝对的。
遗传保证了物种的存在和延续，而变异推动了物种的进化和发展。
在学习遗传、变异内容时，先应清楚掌握以下几个概念：（一）遗传型又称基因型，指某一生物个体所含有的全部遗传因子即基因组所携带的遗传信息。
遗传型是一种内在可能性或潜力，其实质是遗传物质上所负载的特定遗传信息。
具有某遗传型的生物只有在适当的环境条件下，通过自身的代谢和发育，才能将它具体化，即产生表型。
（二）表型指某一生物体所具有的一切外表特征及内在特性的总和，是其遗传型在合适环境下通过代谢和发育而得到的具体体现。
所以，它与遗传型不同，是一种现实性。
（三）变异指在某种外因或内因的作用下生物体遗传物质结构或数量的改变，亦即遗传型的改变。
变异的特点是在群体中以极低的概率(一般为10-5～10-10)出现，性状变化的幅度大，且变化后的新性状是稳定的、可遗传的。
（四）饰变指一种不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、翻译水平上的表型变化。
其特点是整个群体中的几乎每一个体都发生同样变化；性状变化的幅度小；因其遗传物质不变，故饰变是不遗传的。
例如，Serratia marcescens(粘质沙雷氏菌)在25℃下培养时，会产生深红色的灵杆菌素，它把菌落染成鲜血似的。
可是，当培养在37℃下时，群体中的一切个体都不产色素。
如果重新降温至25℃，所有个体又可恢复产色素能力。
所以，饰变是与变异有着本质差别的另一种现象。
上述的S.marcescens产色素能力也会因发生突变而消失，但其概率仅10-4，且这种消失是不可恢复的。
从遗传学研究的角度来看，微生物有着许多重要的生物学特性：微生物结构简单，个体易于变异；营养体一般都是单倍体；易于在成分简单的合成培养基上大量生长繁殖；繁殖速度快；易于累积不同的最终代谢产物及中间代谢物；菌落形态特征的可见性与多样性；环境条件对微生物群体中各个体作用的直接性和均一性；易于形成营养缺陷型；各种微生物一般都有相应的病毒；以及存在多种处于进化过程中的原始有性生殖方式等。
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①细 菌
预培养 20-24h培养 同步化 3-6℃培养1h 35-37℃培养至对数 期
基本 培养基
前培养及 诱变菌悬 液制备
培养20-60min
2℃
保藏 10min
加入一定浓度的嘌呤、嘧啶或酵母膏
加入预冷 的缓冲液 或生理盐水
离心洗涤
用无菌脱脂 棉或滤膜
悬液
加入 玻璃珠
调整浓度 备用
过滤
振荡10min
抗生素法
菌丝过滤法
制霉菌素法 夹层培养法 限量补充培养法 逐个检出法 影印接种法
同一培养皿
不同培养皿
鉴定缺陷型
生长谱法
2.营养缺陷型的诱变
• 用于诱发营养缺陷型的诱变剂有亚硝基胍，紫 外线、亚硝酸等。其中亚硝基胍诱发频率极高， 一般可达10％。
3.中间培养（CM，培养过夜） 目的：克服表型延迟
表型延迟（phenotypic lag）：表型的改变落后于 基因型改变的现象.
分离性延迟： 突变的基因经DNA复制和细胞分裂 后变成纯合状态，表型才能表现出来。
生理性延迟： 由杂合状态变为纯合状态，突变表 型仍不能表现出来。
4.淘汰野生型菌株
⑴抗生素法
适用于：细菌和真菌
原理： 青霉素、制 霉菌素等抗生素作用 于生长着的微生物细 胞，对休止态细胞无 作用。 方法：将菌培养在含 抗生素的MM基中
不能合成
甲硫氨酸 苏氨酸
可以大 量积累
赖氨酸
作业题
什么叫做营养缺陷型菌株?在实验室中 如何从原养型菌株获得营养缺陷型菌株?请 设计一个具体实验方案。
谢 谢！
筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤.
筛选方案
2.筛选的程序
⑴常规筛选程序
将随机挑选的菌落直接接入摇瓶培养，产物用常规法测定
⑵定向筛选程序
改进之处：①预筛采用琼脂块法。②初筛摇瓶发酵液中产物 的分析采用简便、快速的琼脂平板测定法。 预筛
3.菌落预筛的方法
⑴根据形态筛选变株
部分微生物菌株经过诱变处理后，变异菌株的菌 落形态与生理特性、生产性能变化有一定的相关性。
使用UV照射最为方便。取5ml单细胞悬液置于直径6cm的培养皿中， 开盖照射； 时间不短于10 ~ 20s，也不长于10 ~20min。
挑选优良菌株
培养
接种分离 紫外线
Hale Waihona Puke 接种15W、30cm
5mL
出发菌株
菌体的稀释液
三、突变株的分离与筛选
1.诱变育种筛选的基本环节
设计和采用效率高的筛选方案和方法极其重要。
如目标产物与色素之间具有一定相关性。
⑵根据平板菌落生化反应筛选变株
定性和半定量检测
⑶采用冷敏感菌筛选抗生素变株
冷敏感菌是从人的病原菌中经诱变分离出的低温 敏感变异株，在20℃下不能生长，可作为检验菌 使用。
操 冷敏菌+ 诱变后的放线 菌孢子悬浮液 作：
混 合 形成抑菌圈
冷敏菌 迅速生长
20℃ 培养3-4d 37℃ 培养18-20h
b方法
稀释后的菌悬液取0.1m1 加入到基本培养中
2
1
4
3
圆滤纸分别浸湿沾取 以上四类代表物质
缺陷型所需生长因子的测定
以氨基酸缺陷为例进行说 明,将18种氨基酸按右表 分为6组 特点：每2组只有一种共同 物质
1 2 3 4 6
组 别 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 7 7 8 9 10 11 化合物代号 8 12 12 13 14 15 9 13 16 16 17 18 10 14 17 19 19 20 11 15 18 20 21 21
①诱变剂量的确定———突变剂量曲线
②诱变剂对产量性状的诱变作用，大致 有如下趋向：
4.诱变处理
⑴诱变处理方式
复合因子适合于遗传性稳定的纯种及 生活能力强的菌株处理，能导致较大 的突变。
先 弱 后 强
⑵诱变处理方法
适用于诱变力强而杀菌率低的诱 变剂，或只对DNA复制起作用的诱 变剂。
具体做法
设计有效的筛选方法，将少量正变 筛选（定向） 株中的优良菌株挑选出来。
诱变育种中的几个原则：
(1)选择简便有效的诱变剂
(2)挑选优良的出发菌株
(3)处理单细胞或单孢子悬液
(4)选用最适的诱变剂量
(5)充分利用复合诱变的协同效应
(6)利用和创造形态、生理与产量间的相关指标
(7)设计高效的筛选方案 (8)创造新型筛选方法
1.
一、诱变育种的设计和准备
前期准备工作
诱
变 育 种 的 设 计
出发菌株的选择与纯化
单细胞悬液的制备 诱变剂及诱变剂量的选择
诱变处理 突变体的分离与筛选 优良菌株
2.前期准备工作
⑴对出发菌株的选择
1.出发菌株的选择 与纯化
⑵出发菌株的纯化
2.菌悬液 (单孢子或单细胞悬液)的制备
⑵菌悬液制备方法
完全培养基 （CM）[+]
补充培养基 （SM）[x]
满足一切营养缺陷型菌株生长的天然或半 合成培养基。 在MM中有针对性地加入一或几种营养成 分以满足相应营养缺陷型菌株生长的合成 培养基。
1.营养缺陷型突变株的筛选步骤
原菌株(出发菌株) 诱变剂处理 中间培养
青霉素法
Auxo 的浓缩 淘汰野生型 检出缺陷型
采用青霉素法淘汰野生型细菌的方法和步骤：
⑵菌丝过滤法
适用于：丝状（放线菌、 霉菌）
原理：基本培养基上只 有野生型发育成菌丝； 突变孢子可通过滤膜， 野生型菌丝不能通过。
⑶高温杀菌法
适用于：芽孢菌 原理：利用芽孢菌类的芽孢和营养体对热的敏 感性差异，野生型芽孢荫发，营养缺陷型芽孢 不萌发。则加热后，野生型细胞大部分被杀死， 缺陷型保留下来。
适合的染料
合理设计 培养基
⑹琼脂块法大通量筛选突变株
该法是日本学者八木建立的，而由Ichilawa等在春雷 霉素产生菌选育中得到应用，取得令人满意的效果。
四、营养缺陷型菌株的诱变和筛选
营养缺陷型的筛选三类培养基
基本培养基 （MM）[-]
凡是能满足野生型菌株营养要求的最低 成分的合成培养基。
如：
头孢菌素C产生菌的有效诱变剂是：uv 、LiCl2 烷化 剂； 青霉素产生菌以烷化剂更合适。
a.遗传稳定的出发菌株：
以前未使用过 突变谱较宽 诱变率高
b. 遗传性不稳定的出发菌株：
效价高、 性能好的 一类菌落
温和诱变剂处理
环境条件
自然分离
原始菌株
出发菌株
突变体筛选
选用的诱变剂是温和的或曾经是有效的诱变剂
5
7.缺陷型菌的应用
作为菌株的遗传标记：进行基因工程、诱变
育种、
研究代谢过程时用作亲本标记；
作为生产菌种：aa、核苷酸等生产菌种；
作为aa、维生素、碱基的测定菌株。
氨基酸合成代谢的人工控制
赖氨酸高产菌
天冬氨酸
人工诱变的 菌种不能产生
天冬氨酸激酶
高丝氨酸 脱氢酶
中间产物Ⅰ
高丝氨酸
中间产物Ⅱ
项目二 微生物的遗传变异和育种
( Microbial genetics and
breeding )
任务三 诱变育种
什么是诱变育种？
用物理或化学的诱变剂使诱变对象内的遗传 物质（ DNA ）的分子结构发生改变，引起性状
变异并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种
育种方法。
诱变育种的2个主要环节：
选用合适的诱变剂和诱变剂量处理大 诱变（随机） 量均匀、分散的微生物细胞，以引起 绝大多数细胞致死的同时，使存活个 体中的突变频率大大提高。
最佳诱变剂的选择
预实验：生产能力分类法
⑵诱变剂的种类（高效，简便） 照射源、 照射距离、
照射时间、 处理 条件
物理诱变剂： 频度低、大损伤，难修复，且操作简便；
化学诱变剂：
频度高，点突变，易回复突变，操作麻烦。 ( NTG——超诱变剂） UV是最常用的一种诱变剂
浓度、处 理时间、 处理条件
⑶最适诱变剂量的选择
培养后菌丝生长延伸到盖片 以外的培养基上，揭去盖片 盖片周围部分尖端菌丝断裂
b.单菌落周围菌丝尖端法
紫外线照射或加入 杀菌率低的化学诱变剂
选择数个单菌落 筛 选
对菌落四周延伸 的菌丝尖端处理
培养
c.混合处理法
常用化学诱变剂
玻璃匀浆
培养后相当年幼的菌丝体 小段菌丝的菌 悬液进行处理
过滤
3.诱变剂及处理剂量的选择
5. 营养缺陷型的检出
①点植对照法
②影印法
该法效率高，适用于细菌、酵母菌及小型菌落的放线菌和霉菌。
影印平板培养法
母平板 另一选择 培养基
灭菌的 丝绒
印章
③夹层法
先出现
也称延迟补给 法。本法用于 细菌更为合适。
④限量补充培养法
6.营养缺陷型的鉴定
⑴鉴定方法
① 在一个平皿中加入一种营养物质以测定多株缺 陷型菌株(10-50株)对该生长因子的需求情况。 ② 在同一平皿上测定一种缺陷型菌株对多种生长 因子的需求情况，称为生长谱法。
⑵营养缺陷型鉴定步骤
测定缺陷型菌株所需生长因子的类别
具体测定缺陷该类别物质中的哪种生长因子
用单一生长因子进行复证试验
缺陷型类别的测定
a.先选择缺陷型菌株所需用的类别代表物质。
①氨基酸混合物、酪素水解物或蛋白陈，代表 氨基酸类。 ②酵母浸出液，其中氨基酸、维生素、嘌呤、 嘧啶均具有。
③维生素混合物，代表维生素类。 ④核酸碱基混合液或酵母核酸 (0.1 ％碱水解 物)，代表嘌呤、嘧啶类。
②产孢子的菌类
预培养
成熟而新鲜 的孢子
预培养 20-24h培养 同步化 3-6℃培养1h 35-37℃培养至对数 期
基本 培养基
前培养及 诱变菌悬 液制备
培养20-60min
2℃
保藏 10min
加入一定浓度的嘌呤、嘧啶或酵母膏
加入预冷 的缓冲液 或生理盐水
离心洗涤
用无菌脱脂 棉或滤膜
悬液
加入 玻璃珠
调整浓度 备用
过滤
振荡10min
抗生素法
菌丝过滤法
制霉菌素法 夹层培养法 限量补充培养法 逐个检出法 影印接种法
同一培养皿
不同培养皿
鉴定缺陷型
生长谱法
2.营养缺陷型的诱变
• 用于诱发营养缺陷型的诱变剂有亚硝基胍，紫 外线、亚硝酸等。其中亚硝基胍诱发频率极高， 一般可达10％。
3.中间培养（CM，培养过夜） 目的：克服表型延迟
表型延迟（phenotypic lag）：表型的改变落后于 基因型改变的现象.
分离性延迟： 突变的基因经DNA复制和细胞分裂 后变成纯合状态，表型才能表现出来。
生理性延迟： 由杂合状态变为纯合状态，突变表 型仍不能表现出来。
4.淘汰野生型菌株
⑴抗生素法
适用于：细菌和真菌
原理： 青霉素、制 霉菌素等抗生素作用 于生长着的微生物细 胞，对休止态细胞无 作用。 方法：将菌培养在含 抗生素的MM基中
不能合成
甲硫氨酸 苏氨酸
可以大 量积累
赖氨酸
作业题
什么叫做营养缺陷型菌株?在实验室中 如何从原养型菌株获得营养缺陷型菌株?请 设计一个具体实验方案。
谢 谢！
筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤.
筛选方案
2.筛选的程序
⑴常规筛选程序
将随机挑选的菌落直接接入摇瓶培养，产物用常规法测定
⑵定向筛选程序
改进之处：①预筛采用琼脂块法。②初筛摇瓶发酵液中产物 的分析采用简便、快速的琼脂平板测定法。 预筛
3.菌落预筛的方法
⑴根据形态筛选变株
部分微生物菌株经过诱变处理后，变异菌株的菌 落形态与生理特性、生产性能变化有一定的相关性。
使用UV照射最为方便。取5ml单细胞悬液置于直径6cm的培养皿中， 开盖照射； 时间不短于10 ~ 20s，也不长于10 ~20min。
挑选优良菌株
培养
接种分离 紫外线
Hale Waihona Puke 接种15W、30cm
5mL
出发菌株
菌体的稀释液
三、突变株的分离与筛选
1.诱变育种筛选的基本环节
设计和采用效率高的筛选方案和方法极其重要。
如目标产物与色素之间具有一定相关性。
⑵根据平板菌落生化反应筛选变株
定性和半定量检测
⑶采用冷敏感菌筛选抗生素变株
冷敏感菌是从人的病原菌中经诱变分离出的低温 敏感变异株，在20℃下不能生长，可作为检验菌 使用。
操 冷敏菌+ 诱变后的放线 菌孢子悬浮液 作：
混 合 形成抑菌圈
冷敏菌 迅速生长
20℃ 培养3-4d 37℃ 培养18-20h
b方法
稀释后的菌悬液取0.1m1 加入到基本培养中
2
1
4
3
圆滤纸分别浸湿沾取 以上四类代表物质
缺陷型所需生长因子的测定
以氨基酸缺陷为例进行说 明,将18种氨基酸按右表 分为6组 特点：每2组只有一种共同 物质
1 2 3 4 6
组 别 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 7 7 8 9 10 11 化合物代号 8 12 12 13 14 15 9 13 16 16 17 18 10 14 17 19 19 20 11 15 18 20 21 21
①诱变剂量的确定———突变剂量曲线
②诱变剂对产量性状的诱变作用，大致 有如下趋向：
4.诱变处理
⑴诱变处理方式
复合因子适合于遗传性稳定的纯种及 生活能力强的菌株处理，能导致较大 的突变。
先 弱 后 强
⑵诱变处理方法
适用于诱变力强而杀菌率低的诱 变剂，或只对DNA复制起作用的诱 变剂。
具体做法
设计有效的筛选方法，将少量正变 筛选（定向） 株中的优良菌株挑选出来。
诱变育种中的几个原则：
(1)选择简便有效的诱变剂
(2)挑选优良的出发菌株
(3)处理单细胞或单孢子悬液
(4)选用最适的诱变剂量
(5)充分利用复合诱变的协同效应
(6)利用和创造形态、生理与产量间的相关指标
(7)设计高效的筛选方案 (8)创造新型筛选方法
1.
一、诱变育种的设计和准备
前期准备工作
诱
变 育 种 的 设 计
出发菌株的选择与纯化
单细胞悬液的制备 诱变剂及诱变剂量的选择
诱变处理 突变体的分离与筛选 优良菌株
2.前期准备工作
⑴对出发菌株的选择
1.出发菌株的选择 与纯化
⑵出发菌株的纯化
2.菌悬液 (单孢子或单细胞悬液)的制备
⑵菌悬液制备方法
完全培养基 （CM）[+]
补充培养基 （SM）[x]
满足一切营养缺陷型菌株生长的天然或半 合成培养基。 在MM中有针对性地加入一或几种营养成 分以满足相应营养缺陷型菌株生长的合成 培养基。
1.营养缺陷型突变株的筛选步骤
原菌株(出发菌株) 诱变剂处理 中间培养
青霉素法
Auxo 的浓缩 淘汰野生型 检出缺陷型
采用青霉素法淘汰野生型细菌的方法和步骤：
⑵菌丝过滤法
适用于：丝状（放线菌、 霉菌）
原理：基本培养基上只 有野生型发育成菌丝； 突变孢子可通过滤膜， 野生型菌丝不能通过。
⑶高温杀菌法
适用于：芽孢菌 原理：利用芽孢菌类的芽孢和营养体对热的敏 感性差异，野生型芽孢荫发，营养缺陷型芽孢 不萌发。则加热后，野生型细胞大部分被杀死， 缺陷型保留下来。
适合的染料
合理设计 培养基
⑹琼脂块法大通量筛选突变株
该法是日本学者八木建立的，而由Ichilawa等在春雷 霉素产生菌选育中得到应用，取得令人满意的效果。
四、营养缺陷型菌株的诱变和筛选
营养缺陷型的筛选三类培养基
基本培养基 （MM）[-]
凡是能满足野生型菌株营养要求的最低 成分的合成培养基。
如：
头孢菌素C产生菌的有效诱变剂是：uv 、LiCl2 烷化 剂； 青霉素产生菌以烷化剂更合适。
a.遗传稳定的出发菌株：
以前未使用过 突变谱较宽 诱变率高
b. 遗传性不稳定的出发菌株：
效价高、 性能好的 一类菌落
温和诱变剂处理
环境条件
自然分离
原始菌株
出发菌株
突变体筛选
选用的诱变剂是温和的或曾经是有效的诱变剂
5
7.缺陷型菌的应用
作为菌株的遗传标记：进行基因工程、诱变
育种、
研究代谢过程时用作亲本标记；
作为生产菌种：aa、核苷酸等生产菌种；
作为aa、维生素、碱基的测定菌株。
氨基酸合成代谢的人工控制
赖氨酸高产菌
天冬氨酸
人工诱变的 菌种不能产生
天冬氨酸激酶
高丝氨酸 脱氢酶
中间产物Ⅰ
高丝氨酸
中间产物Ⅱ
项目二 微生物的遗传变异和育种
( Microbial genetics and
breeding )
任务三 诱变育种
什么是诱变育种？
用物理或化学的诱变剂使诱变对象内的遗传 物质（ DNA ）的分子结构发生改变，引起性状
变异并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种
育种方法。
诱变育种的2个主要环节：
选用合适的诱变剂和诱变剂量处理大 诱变（随机） 量均匀、分散的微生物细胞，以引起 绝大多数细胞致死的同时，使存活个 体中的突变频率大大提高。
最佳诱变剂的选择
预实验：生产能力分类法
⑵诱变剂的种类（高效，简便） 照射源、 照射距离、
照射时间、 处理 条件
物理诱变剂： 频度低、大损伤，难修复，且操作简便；
化学诱变剂：
频度高，点突变，易回复突变，操作麻烦。 ( NTG——超诱变剂） UV是最常用的一种诱变剂
浓度、处 理时间、 处理条件
⑶最适诱变剂量的选择
培养后菌丝生长延伸到盖片 以外的培养基上，揭去盖片 盖片周围部分尖端菌丝断裂
b.单菌落周围菌丝尖端法
紫外线照射或加入 杀菌率低的化学诱变剂
选择数个单菌落 筛 选
对菌落四周延伸 的菌丝尖端处理
培养
c.混合处理法
常用化学诱变剂
玻璃匀浆
培养后相当年幼的菌丝体 小段菌丝的菌 悬液进行处理
过滤
3.诱变剂及处理剂量的选择
5. 营养缺陷型的检出
①点植对照法
②影印法
该法效率高，适用于细菌、酵母菌及小型菌落的放线菌和霉菌。
影印平板培养法
母平板 另一选择 培养基
灭菌的 丝绒
印章
③夹层法
先出现
也称延迟补给 法。本法用于 细菌更为合适。
④限量补充培养法
6.营养缺陷型的鉴定
⑴鉴定方法
① 在一个平皿中加入一种营养物质以测定多株缺 陷型菌株(10-50株)对该生长因子的需求情况。 ② 在同一平皿上测定一种缺陷型菌株对多种生长 因子的需求情况，称为生长谱法。
⑵营养缺陷型鉴定步骤
测定缺陷型菌株所需生长因子的类别
具体测定缺陷该类别物质中的哪种生长因子
用单一生长因子进行复证试验
缺陷型类别的测定
a.先选择缺陷型菌株所需用的类别代表物质。
①氨基酸混合物、酪素水解物或蛋白陈，代表 氨基酸类。 ②酵母浸出液，其中氨基酸、维生素、嘌呤、 嘧啶均具有。
③维生素混合物，代表维生素类。 ④核酸碱基混合液或酵母核酸 (0.1 ％碱水解 物)，代表嘌呤、嘧啶类。
②产孢子的菌类
预培养
成熟而新鲜 的孢子