脲酶快速检测方法(1)

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脲酶的测定——精选推荐

一.液态法1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨，会使酚红指示剂改变颜色。

2.试剂2.1尿素:GB696，分析纯。

2.2酚红指示剂2.2.1称取0.1g酚红，加1.43mL0.1mol/L氢氧化钠溶液，在研钵中研磨以促溶解；2.2.2转移至250mL定量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀备用。

3.操作方法3.1取0.2g粉末样品，置于25mL比色管中。

3.2加0.02g尿素，加酚红指示剂2滴，再加水20mL，充分摇匀15s。

3.3记录粉红色出现时间，并根据时间判断尿酶活性，颜色出现时间应少于15min。

颜色出现时间脲酶活性1min 极强1～5min 强5～15min 稍有15min 无同时作空白对照试验。

样品空白(不加尿素)及试剂空白(不加样品)，只有上述空白正常时，即酚红指示剂不改变颜色，试验结果才是可靠的。

一般企业认为7、8分钟变色较为合适。

二、半固态法1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨，会使酚红指示剂改变颜色。

2.试剂2.1稀硫酸（H2SO4）0.2N。

2.2尿素一酚红试剂2.2.1将1.2克酚红溶解于30ml0.2N的NaOH中；2.2.2用蒸馏水将之稀释至约300mL；2.2.3加入90g尿素（分析纯）并溶解之；2.2.4用蒸馏水稀释至2L；2.2.5加入14mL 1.0N的H2SO4或70mL o.2N的H2SO4；2.2.6用蒸馏水稀释至最后体积3L；2.2.7溶液应具明亮的琥珀色。

3.操作方法3.1在一个150ml的烧杯中倒入少量试剂，注意溶液必须呈明亮的琥珀色。

若溶液已转变为深桔红色，滴人稀硫酸溶液并搅拌之，直至溶液再度呈琥珀色。

3.2量一匙粉末样品，放置于培养皿中。

3.在样品上加入两匙试剂，轻轻搅拌，将样品平铺于培养皿中。

若仍有干样品斑点，则再加入试剂，直至将样品浸湿。

4.放置5分钟后观察：a. 没有任何红点出现：再任其放置25分钟，若仍无红点出现，说明大豆粉过熟。

b. 有少量红点：少量尿素酶活性，可用。

大豆制品中脲酶活性的测定

大豆制品中脲酶活性的测定
制作人：刘力、李亚杰
背景
大豆制品中含有大量抗营养因子，影响到动物的正常生长发育。其中最主要的是胰蛋白酶抑制因子，不耐热，但在点击添加标题生产加工过程中，过度的加热在灭活抗营养因子的同时，导致蛋白质变性，特别是赖氨酸、精氨酸和胱氨酸等严重点击添加标题变性，大大降低了大豆制品的消化率和生物学价值。抗胰蛋白酶活性是直接反映大豆制品中抗营养因子水平及加热程度的可靠指标，但由于该法费时、所用试剂昂贵，在生点击添加标题产上不适用。而脲酶活性与抗胰蛋白酶活性呈高度正相关，方法较简便、快速、经济，国内外常用脲酶活性作为检验点击添加标题大豆制品加热程度和抗营养因子水平的判断指标。
注意事项
若样品粗脂肪含量高于点击添加标题 10%，则应先进行不加热的脱脂处理后，在测定脲酶活性；点击添加标题称量样品时，一定要将样品混合均匀，否则会造成试验误差；点击添加标题试样和空白试验同时操作，过程要迅速，防止时间影响。点击添加标题
问题
反应时间（30min ）对脲酶活性是否有影响？点击添加标题
仪器设备
粉碎机：粉碎时应不生强热，如球点击添加标题磨机。
点击添加标题点击添加标题
点击添加标题
测定步骤
样品中脲酶活性的测定：称取0.2 g（准确至0.0001 g）样品（如果活性很
高，可称取0.05 g试样）玻璃试管中，加10 mL尿素缓冲液，立即盖好试管盖剧烈振摇后，马上置于30±0.5 ℃水浴锅内，准确计30 min±10 s。取下点击添加标题后立即加入10 mL盐酸（0.1 mol/L），振摇后迅速冷却至20℃，将试管内容物全部转入50 mL烧杯中，用20 mL蒸馏水冲洗数次，以0.1 mL的氢氧化钠标准滴定溶液用酸度计滴定至 pH 4.70。记录氢氧化钠标准滴定溶液消耗量。点击添加标题如果选用指示剂，试管中内容物全部移入250 mL锥形瓶中，滴加8~10滴混合指示剂，以0.1 mol/L氢氧化钠标准滴定溶液滴定至蓝绿色，记录氢氧化点击添加标题钠滴定溶液消耗量。空白测定：称取样品后立即加入10 mL盐酸溶液，之后不加。

大豆中脲酶活性的测定

e.结果计算
UA＝14×C(V0-V)/(30×m) C——氢氧化钾标准溶液浓度， mol/L； V0——空白试验消耗氢氧化钾的体积， ml； V——测定试验消耗的氢氧化钾的体积，ml； m——试验质量，g。
比色法
原理：向含有EDTA二钠盐的PH=7的缓冲液的分析悬浮液中加入尿素溶液，在 30℃下保温5min，加入磷钨酸终止酶作用并沉淀蛋白质。产生的氨在次溴酸钠和麝香草酚作用下形成蓝色的靛麝香草酚，借以比色。
大豆饼粕中脲酶活性的测定
豆粕的蛋白质含量为45%左右，是一种优质的蛋白质饲料，但是由于其中的抗营养因子较多，极大的限制了豆粕在饲料中的应用。
大豆中的抗营养因子
胰蛋白酶抑制剂植物红细胞凝集素皂甙胃肠胀气因子植酸抗维生素致甲状腺肿因子
这些抗营养因子大多是不耐热的，
在大豆饼粕的加工过程中由于加热而失活，从而降低或者失去其有害作用，因此，在大豆加工生产饲用饼粕时，必须对大豆粕进行充分而又适当的加热，这样才能使其中的抗营养因子失活。
评价大豆饼粕的指标
脲酶活性：检测豆粕的加热程度是否足以破坏其中的抗营养因子的指标。蛋白质溶解度：反映豆粕是否加热过度的一个指标。
快速测定方法2
在培养皿上放入少量的豆饼粕，在样品上滴入少量指示剂并搅拌，将其平铺于培养皿中，放置5min后观察结果。无任何红点出现，再放置25min仍然无红点出现，说明豆粕过熟；有少量红点出现，说明脲酶活性较低，豆粕可用；样品表面有25％被红点覆盖，豆粕可用；样品表面有50％被红点覆盖，应慎用；样品表面有75％－100％被红点覆盖，脲酶活性过高，豆粕过生，不可用；
大豆中的抗营养因子?胰蛋白酶抑制剂?植物红细胞凝集素?皂甙?胃肠胀气因子?植酸?抗维生素?致甲状腺肿因子这些抗营养因子大多是不耐热的在大豆饼粕的加工过程中由于加热而失活从而降低或者失去其有害作用因这些抗营养因子大多是不耐热的在大豆饼粕的加工过程中由于加热而失活从而降低或者失去其有害作用因此在大豆加工生产饲用饼粕时必须此在大豆加工生产饲用饼粕时必须对大豆粕进行充分而又适当的加热这样才能使其中的抗营养因子失活

豆浆中脲酶活性的测定

表２准确度试验（一３ｎ）
０９９）．９２。结果表明：豆甙在００２．３ｍｇｍｌ大．０￣０００／范围内呈良好的线性关系，低检出限为００ｔ；最．４ｔｇ淫羊藿甙在００２０１ｍｇｍｌ围内呈良好的线．０￣．Ｏ／范
维普资讯
江苏预防医学２０年９月第１卷第３０２３期
ＪｎｓｒｄＳｐ２０，ｌ３Ｎ — ｉ￣ｕＦｅＭｅ，ｅ，０２Ｖｏ１，ｏ３ａ＇ｖ —．
பைடு நூலகம்
（ＮＨ４２３２ａＨ — ）ＣＯ＋ＮＯ
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２５０２０１）
【文献标识码】Ｂ【中图分类号】Ｒ一３【３文章编号】１０－９７（０２０－０６－００６００２０）３０３３【关键词】豆浆；酶活性；脲吸光度
豆浆营养丰富，但必须煮沸后才可食用。煮沸可防止豆浆中毒，但也破坏了多种营养物质。由于豆浆有“ 假沸” 现象，目前多以豆浆脲酶活性来表示抗营
［］张回剐，３曾红，徐绥绪，．效液相色谱法测定糖脂双降茶中等高淫羊藿甙的含量Ｅ］色谱，０１１（）３５３６Ｊ．２０，９４：６—６．
－１］王德先，４杨更亮，秀荣等．毛细管电泳法测定淫羊藿甙的宋ｐａＫ值及其在中药淫羊藿中的含量ｌ］色谱，０１１（）６— －．Ｊ２０，９１：４
６６．
２５准确度试验．

豆粕脲酶活性相关资料

另取比色管做空白试验，加入10ml尿素缓冲液，10ml0.1 mol/l盐酸。称取与上述试样量相当的试样，迅速加入比色管中，
立即盖好比色管并剧烈摇动，在30±0.5℃恒温水浴上准确保持30min，冷却到20℃，将比色管内容物全部转入烧杯，用水冲洗比色管2～3次，用标准氢氧化钠溶液滴定至PH＝4.7。
大豆中脲酶活性测定
为什么要测定脲酶？
脲酶毒性
一般脲酶并没有毒性作用，但在一定温度和pH值条件下，生大豆的脲酶遇水迅速将含氮化合物分解成氨，引起氨中毒。大豆中的抗营养因子：胰蛋白酶抑制剂最重要
评估胰蛋白酶抑制剂活性
大豆饼粕中胰蛋白酶抑制剂抑制动物的生长和引起胰腺肥大。而直接测定大豆饼粕中的胰蛋白酶抑制剂的活性比较困难、耗时。脲酶和胰蛋白酶抑制剂在加热时有相近的速率变性，并且脲酶对热的抵抗力比胰蛋白酶抑制剂强，又易于测定，所以常用脲酶活性指标来判断大豆饼粕加热的程度和估计大豆饼粕中胰蛋白酶抑制剂是否已经被破坏。
M＝m/(V×0.2042) 式中：m：邻苯二甲酸氢钾质量，g；
V：消耗氢氧化钠体积，ml。
滴定法（续）
操作方法
称取0.2000g试样，转入比色管中，加入10ml尿素缓冲液，立即盖好盖子并剧烈摇动。置于30±0.5℃恒温水浴上准确保持30min后立即加入10ml0.1mol/l盐酸，迅速冷却到20℃，将比色管内容物全部转入烧杯，用水冲洗比色管2～3次，立即用标准氢氧化钠溶液滴定至PH＝4.7。
我国《饲料用大豆》标准（GB1038489）规定：“饲料用大豆需加热后使用，尿素酶活性不得超过0.4”。台湾省标准为
0.02～0.3△pH 。
脲酶的测定方法
比色法滴定法 PH增值法快速检测法
比色法

脲酶活性

随着膨化技术在饲料工业中推广普及，越来越多的饲料生产商在配方中使用膨化大豆粉，与其它蛋白资源一样，大豆的适度熟化非常重要，熟化程度低会含抗胰蛋白酶等营养抑制因子，熟化度过高又会导致氨基酸利用率低。

判断膨化大豆粉是否合格的主要指标是脲酶活性。

脲酶活性是指：在30±5℃和PH值等于7的条件下，每分钟每克膨化大豆分解尿素所释放的氨态氮的毫克数。

脲酶本身无营养意义，但它与抗胰蛋白酶的含量接近，并且遇热变性失活的程度与抗胰蛋白酶相似，因此，尿酶活性用来作为膨化大豆加热是否合适的间接估测指标。

脲酶活性没有负值，最低为0。

在我国现行的国标推荐值为0.3，在美国一般认为以不超过0.2为宜，并且针对日粮中有尿素的反刍动物而言不得超过0.12，当然对于家禽和猪0.3或稍高都可以接受。

国内很多大企业一般均采用0.2。

实验室定量测定脲酶活性的方法较复杂，有滴定法和pH增值法两种，已有研究表明两者对同一样品测得的数值也不相等。

目前国内绝大部分企业都采用快速而简单的简易判定方法定性地估测脲酶活性，一般来说，主要有如下两种方法。

一.液态法1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨，会使酚红指示剂改变颜色。

2.试剂2.1尿素:GB696，分析纯。

2.2酚红指示剂2.2.1称取0.1g酚红，加1.43mL0.1mol/L氢氧化钠溶液，在研钵中研磨以促溶解；2.2.2转移至250mL定量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀备用。

3.操作方法3.1取0.2g粉末样品，置于25mL比色管中。

3.2加0.02g尿素，加酚红指示剂2滴，再加水20mL，充分摇匀15s。

3.3记录粉红色出现时间，并根据时间判断尿酶活性，颜色出现时间应少于15min。

颜色出现时间脲酶活性1min 极强1～5min 强5～15min 稍有15min 无同时作空白对照试验。

样品空白(不加尿素)及试剂空白(不加样品)，只有上述空白正常时，即酚红指示剂不改变颜色，试验结果才是可靠的。

脲酶测定试剂盒说明书

脲酶（Urease，UE）测定试剂盒说明书分光光度法50管/24样注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义：UE能够水解尿素，产生氨和碳酸。

UE活性与有机物质含量、全氮和速效氮含量呈正相关，反应了氮素状况。

测定原理：利用靛酚蓝比色法测定脲酶水解尿素产生的NH3-N。

需自备的仪器和用品：可见分光光度计、水浴锅、可调式移液器、1ml比色皿、研钵、冰、和蒸馏水。

试剂的组成和配制：提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存；试剂一：粉剂×1瓶，临用前加入5mL蒸馏水，充分溶解待用，4℃保存；用不完的试剂4℃保存；试剂二：液体12mL×1瓶，4℃保存；试剂三A液：液体×1支，4℃保存；试剂三B液：液体×1瓶，4℃保存；临用前将A液倒入B液中混合，待用；用不完的试剂4℃保存一周；试剂四：液体5mL×1瓶，4℃保存；样本的前处理：1、细菌、细胞或组织样品的制备：细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。

8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至578nm，蒸馏水调零。

2、酶促反应试剂名称测定管对照管样本（μL）20 20试剂一（μL）90蒸馏水（μL）90试剂二（μL）190 190混匀，放入37℃水浴1h后，10000g 25℃离心10min，取上清液。

酶电极法测定发酵酒中尿素的含量

关键词：尿素；传感器；脲酶；电极；发酵酒文章篇号：１６７３．９０７８（２０１３）９．２２５８．２２６１
Ｄｅｔｅｃｔｉ０ｎ０ｆＵｒｅａＣｏｎｔｅｎｔｉｎＦｅｒｍｅｎｔｅｄＷｉｎｅｂｙｔｈｅＥｎｚｙｍｅＥｌｅｃｔｒｏｄｅ
Ａｂｓｔｒａ ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ ｔ：Ａｒａｐｉｄａｎｄａｃｃｕｒａｔｅｄｅｅｃｔｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｆｏｒｕｒｅａｉｎｆｅｒｍｅｎｔｅｄｗｉｎｅｗａｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄｂｙｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｕｒｅａ
ｍｅｍｂｒａｎｅＷａｓｔｈｅｎａｐｐｉｆｅｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｅａｃｔｕａｌｓａｍｐｌｅｓ，ｃｏｍｂｎｅｉｄｗｉｈｔｔｈｅａｍｍｏｎｉｔｔｍｉｏｎｓｅｌｅｃｉｔｖｅｅｌｅｃｔｒｄ．ｏＴｈｅｕｒｅａｓｅｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｃｏｎｉｔｄｉｏｎｓｎｄａｈｅｔｒｅｓｐｏｎｓｅｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｏｆｔｈｅｕｒｅａｓｅｎｓｏｒｗｅｒｅａｌｓｏｓｔｕｄｉｅｄ．Ｆｏｒｕｒｅｓｅａｅｎｚｙｍｅｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｉｔｏｎｐｒｏｃｅｓｓ，ｈｅｔｍｏｓｔｓｕｉｔａｂｌｅ

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大豆制品中尿素酶活性的测定方法
方法一尿素酶活性快速测定法——酚红法（粗略法）
1. 原理：尿素酶 +
尿素氨气（用酚红作指示剂） 2.试剂
（1） 0.1N 氧化钠：称0.4g 氢氧化钠溶于100ml 水中。

（2） 0.1N 硫酸：将1.4ml 浓硫酸溶于l000ml 水中（先加水后加入硫酸） 3.尿素—酚红溶液：
0.14g 酚红溶于35ml 水中+7ml0.1N 氢氧化钠
混合 0.1N 硫酸滴定琥珀色 21g 尿素溶于300ml 水中
方法：将一匙粉碎过的黄豆粕放入小玻皿中，将已调好的尿素——酚红溶液加入小玻皿中的豆粕上，直至完全锦湿，停留5min ，观察豆粕的红色反应。

稀硫酸0.2N
尿素—酚红试剂：将1.2g 酚红溶解于30ml0.2N 的氢氧化钠中，用蒸馏水将之稀释至约300ml,加入90g 尿素（分析纯）并溶解之，用蒸馏水稀释至2L ，加入14ml1.0N 硫酸或70ml0.2N 的硫酸；用蒸馏水稀释至最后体积3L ；溶液应具有明亮的琥珀色。

（过段时间溶液变为深桔红色，可滴入稀硫酸溶液搅拌之，直至溶液再次成为琥珀色。

方法：将一匙粉碎过的黄豆粕放入小玻皿中，将已调好的尿素——酚红溶液加入小玻皿中的豆粕上，直至完全锦湿，停留5min ，观察豆粕的红色反应。

溶液保质期最好3个月，最好一个月内用完。